Caracterização funcional e visualização de fibroblastos esofágicos utilizando co-culturas organoides

Summary

Co-culturas organóide-fibroblastos fornecem um modelo para estudar o nicho de células-tronco in vivo . Aqui é descrito um protocolo para co-culturas esofágico-organóide-fibroblasto. Além disso, imagens de montagem inteira são usadas para visualizar a interação fibroblasto-organoide.

Abstract

As células-tronco epiteliais e progenitoras contribuem para a formação e manutenção da barreira epitelial ao longo da vida. A maioria das populações de células-tronco e progenitoras está escondida em locais anatomicamente distintos, permitindo interações exclusivas com sinais de nicho que mantêm a estanqueidade. Enquanto o desenvolvimento de culturas de organoides epiteliais fornece uma ferramenta poderosa para a compreensão do papel das células-tronco e progenitoras na homeostase e na doença, a interação dentro do ambiente de nicho está amplamente ausente, dificultando a identificação de fatores que influenciam o comportamento das células-tronco. Os fibroblastos desempenham um papel fundamental na direção do destino do tronco epitelial e do progenitor. Aqui, um protocolo abrangente de co-cultura organóide-fibroblasto que permite o delineamento de subpopulações de fibroblastos na renovação e diferenciação de células progenitoras esofágicas é apresentado. Neste protocolo, um método para isolar células epiteliais e fibroblastos em paralelo do esôfago é descrito. Estratégias distintas de classificação celular ativada por fluorescência para isolar tanto as células progenitoras do esôfago quanto as subpopulações de fibroblastos de camundongos transgênicos ou selvagens são descritas. Este protocolo fornece uma abordagem versátil que pode ser adaptada para acomodar o isolamento de subpopulações específicas de fibroblastos. O estabelecimento e a passagem de monoculturas organoides epiteliais esofágicas estão incluídos neste protocolo, permitindo uma comparação direta com o sistema de co-cultura. Além disso, uma abordagem de clareamento 3D que permite a análise detalhada de imagens das interações epitélio-fibroblasto é descrita. Coletivamente, este protocolo descreve um método comparativo e de alto rendimento para identificar e compreender componentes de nicho de células-tronco esofágicas in vitro.

Introduction

Os organoides são utilizados como ensaios 3D in vitro para caracterizar células-tronco e progenitoras, bem como para entender as pistas de sinalização derivadas dos componentes celulares do nicho de células-tronco 1,2,3,4. Organoides esofágicos de camundongos foram descritos pela primeira vez em 2014 e vários trabalhos identificaram fatores de crescimento, como R-Spondin (RSPO), NOGGIN e fator de crescimento epidérmico (EGF), necessários para manter e passar organoides esofágicos ^5,6,7, argumentando que pistas de sinalização semelhantes são necessárias para sinais in vivo renovação de células progenitoras. No entanto, fatores de crescimento são comumente adicionados em concentrações não fisiológicas, resultando em condições de crescimento organoide que não refletem necessariamente o ambiente de sinalização in vivo.

Fibroblastos são populações heterogêneas de células estromais que suportam propriedades de células progenitoras em muitos nichos de células-tronco⁸. A combinação de células progenitoras epiteliais e fibroblastos em uma mesma cultura organoide permite a formação de organoides em concentrações reduzidas de fatores de crescimento exogenamente suplementados. Sistemas de co-cultura organoide de epitélios intestinais e hepáticos são descritos, mas um protocolo para estabelecer co-culturas organóide-fibroblastos esofágicos ainda está pendente9,10,11.

Neste protocolo, duas estratégias de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para fibroblastos do esôfago, usando camundongos transgênicos Pdgfrα^{H2BeGFP 12} ou camundongos selvagens com coloração clássica de anticorpos são descritas. Diferentes subpopulações de fibroblastos podem ser isoladas usando marcadores de superfície celular de escolha, proporcionando flexibilidade ao protocolo. Além disso, uma técnica de imagem por fluorescência 3D preservando a morfologia organoide é usada para caracterizar interações fibroblasto-organóide. O clareamento organoide fornece um método rápido para aumentar a profundidade de penetração da luz nos organoides, melhorando a visualização das conexões organoide-fibroblastos e permitindo a recapitulação da estrutura organoide em sua totalidade. Este protocolo combina co-cultura organoide esofágica com uma estratégia de imagem de montagem completa, permitindo a caracterização funcional da interação fibroblasto-organoide.

Protocol

As experiências em animais para este estudo foram aprovadas pela Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (licença ética n.º 14051-2019). Os animais foram alojados em condições livres de patógenos de acordo com as recomendações da Federation of European Laboratory Animal Science Association.

1. Preparo

1. Descongelar as soluções-mãe enzimáticas utilizadas para dissociação (ver Tabela de Materiais) no gelo. Descongelar uma alíquota da matriz da membrana basal (matriz) reduzida do fator de crescimento (TFG) a 4 °C.
2. Prepare o meio de cultura. Utilizar o meio descrito na Tabela 1 para culturas e coculturas organoides e prepará-lo antes de iniciar o protocolo.

2. Dissecção e separação do epitélio esofágico e estroma

NOTA: Certifique-se de que todos os instrumentos usados para dissecção e processamento de tecidos sejam estéreis. Preparar 2 ml de solução de dissociação (ver Tabela de Materiais) em solução salina balanceada de Hanks (HBSS) por três esófagos.

1. Use uma cepa de mouse de escolha, como camundongos C57BL/6J. O desenvolvimento esofágico em camundongos termina após o dia pós-natal (p) 70, por isso recomenda-se o uso de camundongos com idade mais velha que p70¹³. Use quatro ou cinco camundongos, pois eles fornecem material suficiente para estabelecer 8-10 co-culturas de organoides.
   NOTA: A eficiência de formação de organoides diminui com a idade dos camundongos. Se subpopulações específicas de fibroblastos forem de interesse, é possível que o baixo rendimento de fibroblastos esteja limitando o número de co-culturas organoides que podem ser estabelecidas.
2. Use camundongos geneticamente modificados (por exemplo, Pdgfrα^H2BeGFP) ou selvagens (WT) para o isolamento de populações de fibroblastos. Ao usar camundongos WT, realize a coloração de anticorpos para isolar subpopulações específicas de fibroblastos do estroma via FACS.
3. Eutanásia dos camundongos por asfixia por CO₂ . Dissecar o esôfago com pinça e tesoura de dissecção. Para remover todo o esôfago, corte a extremidade distal do esôfago diretamente acima do estômago e a extremidade proximal no início da traqueia. Submergir o esôfago em PBS e colocá-lo no gelo.
4. Remover mecanicamente a muscular externa usando um microscópio de dissecção (amplitude total de 8x-40x) e pinças. Segurar a extremidade distal do esôfago dissecado com uma pinça e usar a outra pinça para agarrar e puxar o músculo da extremidade distal para a proximal do esôfago dissecado. Retire e descarte a camada muscular.
5. Abra o esôfago longitudinalmente. Isso funciona melhor usando tesoura de mola de microdissecção com uma ponta de esfera para evitar danos ao tecido. Segure uma extremidade do esôfago para inserir a bola da tesoura de mola no lúmen do esôfago e abra o esôfago enquanto segura até a extremidade.
6. Coloque o esôfago em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL ou em uma placa de 24 poços. Incubar o esôfago aberto em 0,5 mg/mL de termolisina em HBSS a 37 °C em um balancim por 15 min. Submergir completamente o esôfago em solução de termolisina.
   NOTA: O volume de solução de termolisina utilizado depende do tamanho do poço ou do tubo. Vários esôfagos podem ser colocados e submersos no mesmo poço ou tubo.
7. Retire o esôfago da solução de termolisina. Use um microscópio de dissecção para separar cuidadosamente o epitélio esofágico do estroma. Usando pinças finas, pegue o lado epitelial e o lado do estroma do tecido e lentamente os afaste para separar as duas camadas.
   NOTA: O estroma é identificado por sua aparência branca e opaca, em contraste com o epitélio transparente. O estroma contém a lâmina própria e a camada submucosa.
8. Transferir a camada epitelial e estromal para dois tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mL com 200 μL de solução de dissociação em HBSS. Coloque no gelo.

3. Isolamento de células progenitoras esofágicas

OBS: O isolamento das células progenitoras esofágicas (etapa 2) e fibroblastos (etapa 3) pode ser realizado simultaneamente. Preparar um tubo de 50 mL de FBS a 1% em HBSS (FBS a 1%).

1. Transferir o epitélio esofágico separado do tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (passo 2.8) para uma placa de Petri limpa e utilizar um bisturi afiado para picar. Recolher o tecido picado da placa de Petri com 200 μL de solução de dissociação e transferi-lo de volta para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   NOTA: O epitélio é picado corretamente quando as peças podem ser colocadas de volta no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando uma ponta de pipeta de 200 μL.
2. Adicionar 800 μL de solução de dissociação fresca ao tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para um volume total de 1 mL.
   NOTA: É importante adicionar um volume suficiente de solução de dissociação. Por um a três esôfagos, recomenda-se 1 mL de solução. Aumente a escala quando mais esôfago for processado de uma só vez.
3. Colocar o tubo com a camada epitelial picada num balancim a 37 °C durante 60 minutos. Pipetar a solução para cima e para baixo aproximadamente 20 vezes usando uma ponta de pipeta de 200 μL a cada 15 min para melhorar a digestão.
4. Após 60 min, pipetar para cima e para baixo mais 20 vezes usando uma ponteira de pipeta de 200 μL. Passar a solução através de um filtro celular de 40 μm para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
   NOTA: Molhe o filtro celular com 1% de FBS antes de forçar as células para minimizar a aderência das células ao filtro. O epitélio não será completamente digerido, e pedaços de tecido ainda serão visíveis. A incubação mais longa, no entanto, diminuirá a sobrevivência celular e não resultará em maior rendimento de células viáveis.
5. Descarte o sobrenadante removendo o excesso de líquido com uma pipeta de 1 mL e ressuspenda o pellet em 1 mL de FBS a 1%. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
   1. Durante a centrifugação, preparar a mistura de anticorpos conjugados para FACS de células progenitoras esofágicas.
   2. Misturar 1 μL de CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) e CD104-A647 (INTEGRIN-β4) em 200 μL de FBS a 1% por milhão de células.
      NOTA: 1 μL de anticorpo (200 μL de volume final) é suficiente para um ou dois esôfagos. Ao processar mais esôfago de uma só vez, aumente o volume da solução de coloração de anticorpos.
6. Ressuspender o pellet em 200 μL de mistura de anticorpos e transferir para um tubo de citometria de fluxo. Depois de adicionar anticorpos fluorescentes, mantenha as suspensões celulares no escuro para evitar o clareamento do sinal. Incubar as células durante 30 min a 4 °C. Adicionar 3 mL de SFB a 1% e centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C e, em seguida, ressuspender as células em um mínimo de 200 μL de 1% de SFB.
   NOTA: 500 μL de SFB a 1% é usado para até quatro ou cinco esôfagos. Aumente o volume quando mais esôfago for processado de uma só vez, para que uma taxa de fluxo FACS de 100-300 eventos/s possa ser alcançada. Mais eventos/s diminuirão a eficiência de classificação, e um aumento na taxa de fluxo diminuirá a sobrevivência celular.
7. Adicionar marcador de coloração de células mortas a uma concentração final de 1:10.000, 5 minutos antes da classificação FACS para isolar células vivas. Classifique as células progenitoras usando uma máquina FACS (consulte a Figura 1 para estratégia de limitação). Coletar as células em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL preenchidos com 200 μL de meio organoide básico (Tabela 1).

4. Isolamento de fibroblastos da camada estromal

1. Cortar a camada estomal em pedaços finos num tubo de 1,5 ml contendo 200 μL de solução de dissociação (passo 2.8) utilizando tesoura de dissecção. O tecido é devidamente picado, uma vez que a solução pode ser pipetada para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de 200 μL.
2. Adicionar 800 μL de solução de dissociação fresca ao tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para um volume total de 1 mL.
   NOTA: É importante adicionar um volume suficiente de solução de dissociação. Por um a três esôfagos, recomenda-se 1 mL de solução. Aumente a escala quando mais esôfago for processado de uma só vez.
3. Colocar o tubo num balancim a 37 °C durante 30 minutos. Após 15 min, pipetar a solução para cima e para baixo aproximadamente 20 vezes usando uma ponta de pipeta de 200 μL para melhorar a digestão.
4. Após 30 min de digestão enzimática, pipetar para cima e para baixo mais 20 vezes usando uma ponteira de pipeta de 200 μL. Coar a solução através de um filtro de células de 70 μm em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
   NOTA: Molhe o filtro celular com 1% de FBS antes de forçar as células para minimizar a aderência das células ao filtro.
5. Descarte o sobrenadante removendo o excesso de líquido com uma pipeta de 1 mL e ressuspenda o pellet em 1 mL de FBS a 1%. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
   NOTA: Ao usar uma cepa de camundongo geneticamente modificada contendo fibroblastos marcados com farinescência, as colorações de anticorpos são opcionais. Se não forem necessárias colorações de anticorpos, continue com a etapa 3.7 e transfira a amostra para um tubo de citometria de fluxo.
   1. Durante a centrifugação, preparar a mistura de anticorpos conjugados para o isolamento FACS de fibroblastos. Misturar 1 μL de CD26-APC (DPP4) em 200 μL de FBS a 1% por milhão de células.
      NOTA: 1 μL de anticorpo é suficiente para um ou dois esôfagos. Ao processar mais esôfago de uma só vez, aumente o volume da solução de coloração de anticorpos.
6. Ressuspender o pellet em 200 μL de mistura de anticorpos conjugados em FBS a 1% e transferir para um tubo de citometria de fluxo. Incubar as células durante 30 min a 4 °C.
7. Adicionar 3 ml de SFB a 1% e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos a 4 °C. Ressuspender as células em um mínimo de 200 μL de 1% de SFB.
   NOTA: 500 μL de SFB a 1% é usado para até quatro ou cinco esôfagos. Aumente o volume quando mais esôfago for processado de uma só vez, para que uma taxa de fluxo de 100-300 eventos/s possa ser alcançada. Mais eventos/s diminuirão a eficiência de classificação, e o aumento da taxa de fluxo diminuirá a sobrevivência celular. Após a adição de anticorpos fluorescentes, as suspensões celulares devem ser mantidas escuras para evitar o clareamento do sinal.
8. Adicionar marcador de coloração de células mortas a uma concentração final de 1:10.000, 5 minutos antes da classificação FACS para isolar células vivas. Classifique as células usando uma máquina FACS (consulte a Figura 1 para obter a estratégia de limitação). Coletar as células em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL preenchidos com 200 μL de meio organoide básico (Tabela 1).

5. Estabelecimento e cultura de organoides esofágicos

NOTA: Pré-aquecer RE_baixo (co-cultura organoide), meio ENR (organoide) (ver Tabela 1 para descrição) e uma placa de 48 poços a 37 °C. Coloque a alíquota da matriz descongelada (preparada no passo 1) sobre o gelo. Recomenda-se o uso da matriz fornecida aqui (ver Tabela de Materiais) para cultura de organoides esofágicos de camundongos, uma vez que outras marcas de matriz afetam negativamente a eficiência de formação de organoides.

1. Para a co-cultura de organoides, misturar as células epiteliais e fibroblastos selecionados na proporção de 1:2 em um tubo. Para cada cúpula matricial, utilizar 5.000 células epiteliais e 10.000 fibroblastos. Ao se preparar para mais cúpulas, adicione um múltiplo de 5.000 células epiteliais e 10.000 fibroblastos a um tubo. Para culturas de organoides sem fibroblastos, utilizar 5.000 células epiteliais por cúpula da matriz.
2. Centrifugar a população de células mistas a 300 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante removendo-o cuidadosamente com uma pipeta de 200 μL.
3. Lave as células uma vez, ressuspendendo o pellet em meio organoide básico frio e centrifugando a 300 x g por 5 min. Coloque as células no gelo.
4. Prepare uma mistura composta por 80% de matriz e 20% de meio organoide básico frio. Coloque tudo no gelo enquanto a matriz se solidifica à temperatura ambiente (TR).
5. Eliminar o sobrenadante após a centrifugação, retirando-o cuidadosamente com uma pipeta de 200 μL. Ressuspender as células em 10 μL de matriz mistura/cúpula e colocar novamente no gelo.
6. Pegue a placa pré-aquecida de 48 poços da incubadora de 37 °C e faça uma cúpula matricial por poço usando uma pipeta de 20 μL. Cada cúpula contém 10 μL de matriz de 80%, 5.000 células epiteliais,s e 10.000 fibroblastos. Transfira a placa de cabeça para baixo para uma incubadora e deixe as cúpulas solidificarem por mais 20-30 min a 37 °C.
   NOTA: Uma diminuição no volume da cúpula da matriz e/ou um aumento no número de células afetará a eficiência de formação do organoide.
7. Adicionar 200 μL de meio baixo de RE pré-aquecido (Tabela 1) às cúpulas matriciais contendo coculturas organoides_{e meio} ENR (Tabela 1) às respectivas cúpulas matriciais contendo apenas organoides epiteliais e colocar a placa na incubadora.
8. Cultivar os organoides a 37 °C e 5% CO₂. Nos primeiros 2 dias, suplementar o meio com 10 μM de inibidor de rocha (Y-27623). O inibidor de rocha previne a morte celular induzida por estresse e aumenta a chance de um estabelecimento bem-sucedido de culturas de organoides.
9. Atualize o meio a cada 2-3 dias. Certifique-se de que o meio está quente para evitar a dissociação da matriz sensível à temperatura.
10. Realizar análises do experimento 6 a 8 dias após o plaqueamento. Os organoides podem ser mantidos em cultura por até 14 dias. Por volta do 14º dia, observa-se perda da integridade da cúpula.

6. Passagem de organoides

NOTA: A passagem de organoides cultivados em co-cultura resulta na perda de fibroblastos. Portanto, recomenda-se o uso do meio ENR para todos os organoides quando passados. Pré-aquecer ENR, PBS e uma placa de 48 poços a 37 °C.

1. Retire o meio e lave o poço que contém a cúpula matricial com PBS pré-aquecido. Adicionar 200 μL de solução fria de tripsina a 0,25% e pipetar para cima e para baixo para quebrar a cúpula da matriz.
   OBS: Recomenda-se o uso de tripsina a 0,25% a frio, pois a matriz é sensível à temperatura e isso auxilia na quebra das cúpulas da matriz.
2. Incubar os organoides com tripsina a 37 °C durante ~20 min. Pipetar para cima e para baixo após 10 min para aumentar a dissociação dos organoides. Monitore o processo de dissociação com um microscópio a cada 5-10 min. Como a tripsina diminui a viabilidade celular, isso pode ajudar a identificar o tempo ideal de dissociação.
3. Após 20 min, pipetar os organoides para cima e para baixo com uma pipeta de 200 μL para dissociar os organoides. Coletar as células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicionar 1 mL de meio organoide básico e centrifugar a 300 x g por 5 min na RT.
4. Opcional: Para garantir as melhores condições de crescimento organoide e que os novos organoides sejam derivados de células únicas, coe as células através de um filtro celular pré-molhado de 40 μm. A filtragem da suspensão celular resulta na remoção de núcleos organoides e aglomerados celulares que são difíceis de dissociar.
5. Preparar uma matriz composta por 80% de matriz e 20% de meio organoide básico frio. Coloque tudo no gelo, pois a matriz se solidifica no RT.
6. Eliminar o sobrenadante retirando-o cuidadosamente com uma pipeta de 200 μL, ressuspender as células em 10 μL de mistura/cúpula de matriz e recolocar a mistura no gelo.
   NOTA: Os organoides podem ser divididos em uma proporção de 1:5 para 1:10, dependendo da densidade da cúpula. As células epiteliais também podem ser contadas e replaqueadas a 5.000 células/cúpula.
7. Pegue a placa pré-aquecida de 48 poços da incubadora de 37 °C e faça uma cúpula por poço. Transfira a placa de cabeça para baixo para uma incubadora e deixe as cúpulas solidificarem por mais 20-30 min a 37 °C.
8. Adicionar 200 μL de meio ENR pré-aquecido às respectivas cúpulas organoides. Completar o meio com 10 μM de inibidor de rocha (Y-27623) durante os primeiros 2 dias.
9. Atualize o meio a cada 2-3 dias. Certifique-se de que o meio está quente para evitar a dissociação da matriz sensível à temperatura.

7. Processamento organoide para coloração de montagem inteira

NOTA: Revestir as pontas e tubos com 10% de FBS em PBS antes de usar para evitar organoides aderidos aos plásticos. Para pontas de pipeta, basta pipetar uma ou duas vezes para cima e para baixo em solução FBS/PBS a 10% antes de usar a ponteira. Para tubos, encha o tubo com FBS/PBS a 10% e, em seguida, remova a solução.

1. Remova o meio organoide e adicione 200 μL de PBS gelado às cúpulas da matriz. Coloque a placa no gelo por 5-10 min.
2. Pipetar para cima e para baixo e transferir a solução para tubos não aderentes de microcentrífuga de 0,6 mL. Centrifugar logo por 30-60 s a 100 x g para deixar os organoides se acomodarem no fundo.
   NOTA: O excesso de pipetagem e centrifugação longa quebra os organoides e interrompe a interação fibroblasto-organóide.
3. Retire o excesso de líquido e adicione PBS gelado. Centrifugar logo por 30-60 s a 100 x g para deixar os organoides se acomodarem no fundo.
4. Retire o excesso de líquido e fixe o organoide com 200 μL de formaldeído a 4% gelado em solução PBS durante 30 minutos no gelo.
   CUIDADO: O formaldeído é tóxico e deve ser sempre usado em uma capela de fumaça química. Luvas de nitrilo, óculos de segurança e jalecos devem ser sempre usados.
5. A fixação do organoide faz com que eles afundem, e a centrifugação não é mais necessária. Deixe os organoides afundarem colocando o tubo na vertical e aguarde 2-3 min, remova o formaldeído e adicione 500 μL de PBS frio para lavar o formaldeído.
6. Deixe os organoides afundarem, remova o excesso de PBS e adicione 500 μL de PBS fresco e frio. Deixe os organoides afundarem, remova o excesso de PBS e adicione 500 μL de tampão de bloqueio (5% de soro de burro normal, 1% de BSA e 0,5% de Triton X-100 em PBS). Coloque o tubo em um balancim por 60 min no RT.
   NOTA: O bloqueio também pode ser feito durante a noite (O/N) a 4 °C.
7. Deixe os organoides afundarem, remova o tampão de bloqueio e ressuspenda os organoides em 200 μL de tampão de bloqueio com anticorpos primários (ver Tabela de Materiais). Manter os organoides num agitador O/N a 4 °C.
   NOTA: Para melhorar a coloração de proteínas nucleares, proteínas de baixa expressão ou anticorpos que mostram coloração inespecífica, o tempo de incubação pode ser aumentado por 1 ou 2 dias a 4 °C. Colocar os organoides em um agitador de balancim é essencial, pois evita que os organoides se aglutinem e aumenta a eficiência da coloração.
8. Deixe os organoides afundarem, remova a mistura primária de anticorpos e lave os organoides usando 500 μL de Triton X-100 a 0,02% em PBS (0,02% Tx) por 60 min em RT. Repita três vezes.
   NOTA: Quando for necessária uma incubação de anticorpos primários mais longa, adicione uma etapa de lavagem com 0,02% de Tx em PBS O/N a 4 °C.
9. Deixe os organoides afundarem, remova o tampão de lavagem e adicione 200 μL de anticorpo secundário conjugado com fluorescência no tampão de bloqueio O/N a 4 °C. Depois de adicionar anticorpos secundários fluorescentes, mantenha os organoides no escuro para evitar o clareamento do sinal.
10. Deixe os organoides afundarem, remova a mistura de anticorpos secundários e lave os organoides usando 500 μL de Tx 0,02% por 60 minutos na RT. Repita três vezes.
11. Contramanchar os organoides com 200 μL de solução de DAPI (0,25 μg/mL) para coloração nuclear, se necessário. Incubar as amostras por 60 min em RT em um balancim.
12. Deixe os organoides afundarem, remova a solução de DAPI e lave os organoides em 500 μL de PBS por 15 minutos na RT. Repita três vezes.
13. Deixe os organoides afundarem e remova todo o excesso de líquido. Adicionar 10 μL de solução de limpeza aos organoides e incubar durante 15 minutos em RT.
    NOTA: A solução de compensação é viscosa, pelo que corte a parte exterior de uma ponta de pipeta de 20 μL antes de pipetar a solução de compensação. Mais solução de limpeza pode ser adicionada se um espaçador maior for usado para geração de imagens. A solução de montagem pode ser usada em vez da solução de limpeza quando não limpar os organoides. A solução de limpeza reduz o plano de fundo durante a criação de imagens e aumenta a profundidade da imagem.
14. Coloque um espaçador de 4 poços adesivo de dupla face de 0,05 mm em uma lâmina de microscópio. Adicione os 10 μL da solução de limpeza com os organoides num poço e coloque uma tampa por cima do espaçador.
    NOTA: Os organoides também podem ser montados sem o uso de espaçador. O espaçador mantém a forma organoide intacta e impede que os organoides sejam achatados.
15. Mantenha a lâmina em RT O/N para limpar os organoides. Para armazenamento a longo prazo, mantenha as lâminas a 4 °C. Adquirir imagens utilizando um sistema de microscopia confocal.

Results

O esôfago é dividido em diferentes camadas: epitélio, lâmina própria, submucosa e muscular externa (Figura 1A). Os fibroblastos residem na submucosa e lâmina própria, denominada estroma. Nesse protocolo, a muscular externa é removida mecanicamente (Figura 1B), o que não leva à perda de fibroblastos (Pdgfrα^H2BeGFP+) residentes no estroma (Figura 1C). Antes da dissociação, o epitélio é separado do estroma, resultando em dois segmentos de tecido (Figura 1B). A separação das duas camadas oferece a oportunidade de aumentar o tempo de dissociação da camada epitelial mais robusta em comparação com a camada estromal frágil. Dessa forma, estabelece-se um eficiente protocolo de isolamento com células progenitoras epiteliais viáveis e fibroblastos estromais (Figura 1B). As células progenitoras esofágicas são classificadas com base em sua alta expressão de INTEGRINA-β4 e E-caderina (Figura 1C,D).

Subpopulações de fibroblastos podem ser isoladas usando marcadores distintos. Neste protocolo, uma estratégia para isolamento de fibroblastos baseada nos marcadores de fibroblastos PDGFRα e DPP4 (CD26) comumente utilizados é fornecida. O isolamento pela expressão do repórter Pdgfrα^H2BeGFP ou pelo anticorpo DPP4 mostra que cerca de 50% das células isoladas são fibroblastos (Figura 1E,F). Além disso, 70% dos fibroblastos PDGFRα+ são DPP4+, indicando que uma população de fibroblastos amplamente sobreposta, mas não idêntica, é obtida. Após o isolamento das populações de células epiteliais e estromais, as células progenitoras esofágicas são cultivadas isoladamente ou em conjunto com fibroblastos em uma cúpula matricial. Para estudar a contribuição dos fibroblastos na formação organoidal, a co-cultura é mantida em meio de fator de crescimento reduzido (Figura 1G).

As células progenitoras esofágicas formam organoides na presença de EGF, NOGGIN e RSPO (ENR). Remoção de NOGGIN e redução da quantidade de RSPO (25 ng/μL; RE_baixo) é suficiente para prevenir a formação de organoides (Figura 2A). Curiosamente, a adição de fibroblastos DPP4+ ou PDGFRα+ às células progenitoras esofágicas_{no meio baixo} do RE restaura a capacidade de formação de organoides, demonstrando uma função de suporte para ambas as populações de fibroblastos (Figura 2A-D). A visualização do transgene Pdgfrα^H2BeGFP mostra que os fibroblastos estão em íntimo contato com as células progenitoras epiteliais durante a formação organoide (Figura 2A). No dia 6, fibroblastos Pdgfrα^H2BeGFP+ ainda estão abundantemente presentes na co-cultura. Os fibroblastos estão presentes em toda a cúpula, próximos e tocando os organoides (seta cheia), ou aderidos aos organoides (cabeça de seta; Figura 2D).

A coloração de montagem completa mostra uma representação 3D da interação dos fibroblastos com os organoides (Figura 3). Embora seja possível realizar todo o protocolo de montagem sem o uso de uma solução de clareamento, ele diminui a transparência e a penetração do laser no organoide (Figura 3B, z-view). Ao montar organoides, o espaçador ajuda a manter a morfologia organoide. Em contraste, o revestimento diretamente sobre os organoides (sem espaçador) achata os organoides e resulta em perda da estrutura organoide (Figura 3A,B).

Tanto os fibroblastos DPP4+ quanto os PDGFRα+ encontram-se envolvidos ao redor dos organoides (Figura 3C, Vídeo1 e Vídeo 2). A diferenciação dos organoides esofágicos pode ser avaliada por diferentes marcadores. A Figura 4 mostra que o protocolo de coloração fornecido é adequado para queratinas mais fáceis de colorir (KRT14/13), bem como fatores de transcrição mais difíceis de corar (TRP63/KLF4). O protocolo de co-cultivo gera organoides com padrão de diferenciação semelhante, como demonstrado in^vivo13,14 e observado em organoides cultivados em meio ENR; As células progenitoras KRT14+ ou TRP63+ formam a camada externa e as células diferenciadas KRT13+ ou KLF4+ orientam-se para dentro.

Este protocolo fornece uma ferramenta para estudar o nicho de células-tronco esofágicas in vitro e visualiza a interação entre organoides e fibroblastos. Ao implementar um protocolo para o isolamento de fibroblastos usando anticorpos, o método é adaptável e pode ser usado para estudar subpopulações de fibroblastos sem a necessidade de camundongos transgênicos.

Figura 1: Isolamento das células progenitoras e subpopulações de fibroblastos do esôfago. (A) Visão esquemática das diferentes camadas do esôfago. O estroma contém a lâmina própria e submucosa. (B) Visão geral esquemática do protocolo de isolamento. O músculo (muscular externa) é removido mecanicamente com pinças; O esôfago remanescente é cortado aberto e incubado em termolisina para separar a camada epitelial do estroma. O epitélio e o estroma são separados, picados mecanicamente e digeridos enzimaticamente para suspensões unicelulares. As células dissociadas são então coradas e preparadas para FACS. (C) Secção transversal do esôfago retirado da muscular externa mostrando fibroblastos Pdgfrα^H2BeGFP+ no estroma. As células duplamente positivas da INTEGRINA-β4 (ITGβ4) e da E-CADERINA (ECAD) são as células progenitoras epiteliais do esôfago. Barra de escala = 100 μm. (D) Gráfico representativo de citometria de fluxo do isolamento de células epiteliais mostrando a porcentagem de células vivas (painel superior) de todas as células isoladas. O painel inferior mostra a porcentagem de células progenitoras ITGβ4+ ECAD+ isoladas (Prog.) de todas as células vivas. (E) Gráfico representativo de citometria de fluxo do isolamento de células estromais mostrando a porcentagem de células vivas (painel superior esquerdo). Gráficos representativos de citometria de fluxo mostrando a porcentagem de fibroblastos DPP4+ isolados (Fibr.; painel superior direito) e fibroblastos Pdgfrα+ (painel inferior esquerdo) de todas as células vivas. 70% dos fibroblastos Pdgfrα+ também são DPP4+ (painel inferior direito). (F) Gráfico representativo de citometria de fluxo do estroma mostrando somente células DPP4+ (2,5%), células PDGFRα+ DPP4+ (37,5%) e células PDGFRα+ somente (17,7%). As porcentagens são de todas as células vivas. (G) Somente células epiteliais são plaqueadas em uma cúpula matricial na presença de 50 ng/μL de EGF, 100 ng/μL de NOGGIN e 250 ng/μL RSPO (ENR), ou em conjunto com fibroblastos na presença de EGF e baixa concentração de RSPO (25 ng/μL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados representativos das co-culturas organoides. (A) Imagens de campo claro mostrando o crescimento dos organoides do dia 1 ao dia 6. As imagens de campo claro com os organoides co-cultivados com fibroblastos Pdgfrα^H2BeGFP+ também mostram o sinal nuclear eGFP. Barra de escala = 25 μm. (B) Imagens de campo claro de toda a cúpula da matriz no dia 6. A coluna da esquerda mostra co-culturas organoides cultivadas na presença de fibroblastos Pdgfrα+ em RE baixo ou E baixoR_{médio baixo}. A coluna do meio mostra co-culturas organoides crescidas na presença de fibroblastos DPP4+ em ER baixo ou Ebaixo R_{médio baixo}. A coluna da direita mostra monoculturas organoides cultivadas em meio ENR. ENR médio = EGF (50 ng/μL), NOGGIN (100 ng/μL) e RSPO (250 ng/μL). RE_baixa = EGF e RSPO 25 ng/μL. E_baixoR_baixo = 5 ng/μL EGF e 25 ng/μL RSPO. Barra de escala = 500 μm. (C) Gráfico mostrando a eficiência de formação de organoides (%) (ou seja, a porcentagem de células formando organoides em diferentes condições de cultura). Cada ponto representa uma cúpula matricial e a barra representa a média de todos os pontos por condição. (D) Imagem fluorescente e de campo claro de organoides do dia 6 co-cultivados com fibroblastos Pdgfrα^H2BeGFP+. Os fibroblastos Pdgfrα^H2BeGFP+ estão presentes em toda a cúpula, aderidos aos organoides (cabeça de seta) e desanexados, mas em contato com os organoides (seta completa). Barra de escala = 250 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Protocolo de coloração de montagem total para o estudo das interações fibroblasto-organóide . (A) Visão geral esquemática de todo o protocolo de imunofluorescência de montagem. AB = anticorpo. (B) Imagem de imunofluorescência da coloração de montagem inteira não limpa mostrando uma diminuição da transparência e penetração da luz laser em comparação com os organoides eliminados. A ausência de espaçador resulta em achatamento do organoide e perda da morfologia organoide. (C) Imagens de montagem inteira dos organoides co-cultivados mostram superfícies 3D dos organoides com fibroblastos VIMENTIN+ (Fibr.) envolvidos e em contato próximo com o organoide. Seções transversais 3D e imagens planas 2D mostram o lúmen do organoide. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagens de montagem inteira revelam populações de células basais e suprabasais distintas. (A) Coloração de montagem total de organoides mono e co-cultivados com fibroblastos Pdgfrα^H2BeGFP+ mostrando células basais KRT14+ na camada externa e células suprabasais diferenciadas KRT13+. Barra de escala = 50 μm. (B) Coloração de montagem total de organoides mono e co-cultivados com fibroblastos Pdgfrα^H2BeGFP+ mostrando células basais TRP63+ na camada externa e células suprabasais diferenciadas KLF4+. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Tabela que descreve os componentes dos meios de cultura organoides. Clique aqui para baixar esta tabela.

Vídeo 1: Fibroblasto Pdgfrα^H2BeGFP+ enrolado e em contato próximo com o organoide. O vídeo acompanha o painel superior da Figura 3C. A barra de escala na Figura 3C é de 50 μm, e o organoide tem ~120 μm de diâmetro. VIMENTINA é mostrada em branco, E-CADHERIN em vermelho, Pdgfrα^H2BeGFP em verde e DAPI em azul. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Fibroblasto DPP4+ enrolado e em contato próximo com o organoide. O vídeo acompanha o painel inferior da Figura 3C. A barra de escala na Figura 3C é de 50 μm, e o organoide tem ~120 μm de diâmetro. VIMENTINA é mostrada em branco, E-CADHERIN em vermelho e DAPI em azul. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussion

O protocolo aqui apresentado estabelece um modelo in vitro para investigação funcional das interações epitélio-fibroblasto do esôfago.

A camada epitelial é separada do estroma, permitindo um protocolo de dissociação otimizado tanto para o compartimento epitelial quanto para o estromal. Apesar da otimização do protocolo de dissociação epitelial, os aglomerados teciduais permanecem aparentes. Subir e descer vigorosamente a cada 15 min diminui substancialmente o número e o tamanho dos aglomerados. Outros protocolos utilizam tripsina para dissociar ainda mais a camada epitelial ^5,6. Aqui, o uso de tripsina, ou aumentar ainda mais o tempo de dissociação, não é recomendado, pois isso tende a resultar em diminuição da viabilidade das células epiteliais e eficiência de formação de organoides. Em contraste com o epitélio, o estroma é facilmente dissociado, e 30 min em solução de dissociação resulta em uma suspensão unicelular com ~90% de viabilidade de fibroblastos (Figura 1E). A exclusão da etapa de separação epitélio-estomal do protocolo aumenta substancialmente o tempo de dissociação, resultando em diminuição da viabilidade dos fibroblastos e menor rendimento de células epiteliais. Além disso, separar o epitélio do estroma fornece uma oportunidade para determinar o número de células de cada população e misturar células epiteliais e fibroblastos de diferentes linhagens de camundongos ao estabelecer as co-culturas.

O estudo da função dos fibroblastos no crescimento organoide é um método comumente utilizado na biologia de células-tronco9,10,11,15,16. Os meios de co-cultura estabelecidos são suplementados com DMEM a 10% de soro fetal de bezerro (SFB)9,15 ou meio de fator de crescimento^{reduzido10,16}. Neste protocolo, o meio de fator de crescimento reduzido é usado para mimetizar as condições no nicho de células-tronco in vivo, onde os fibroblastos são em grande parte quiescentes. O SFB é um soro rico em fatores de crescimento que resulta em ativação e proliferação de fibroblastos nas coculturas, provavelmente correspondendo a um estado celular de fibroblastos distinto do estado in vivo. Excluindo os SFC e reduzindo os fatores de crescimento, de modo que o meio isolado (ER_baixo) não suporta o crescimento organoide e não estimula a proliferação de fibroblastos, é possível isolar o efeito dos fibroblastos sobre o crescimento organoide. Neste meio, NOGGIN é removido e RSPO reduzido a um mínimo (10% RPSO). Tanto a NOGGIN quanto a RSPO demonstraram ser essenciais para o crescimento organoide esofágico⁶. O EGF foi retido no meio de co-cultura, pois não suporta o crescimento organoide por si só. No entanto, os fibroblastos também são capazes de suportar o crescimento organoide em um meio reduzido por EGF (E baixo R_baixo; Figura 2B,D).

As co-culturas organoides não podem ser sustentadas através do passaging, pois os fibroblastos são perdidos durante a tripsinização. No entanto, a passagem organoide foi incluída no protocolo, uma vez que organoides esofágicos podem ser mantidos, expandidos e usados para experimentos posteriores como monoculturas. Organoides passados de monoculturas podem ser usados para configurar co-culturas com fibroblastos recém-isolados. Uma desvantagem do uso de células primárias é o número de camundongos necessários para estabelecer múltiplas coculturas de organoides. Quando focalizamos pequenas subpopulações de fibroblastos, o número de co-culturas obtidas é limitado. Em outros protocolos, os fibroblastos são primeiramente expandidos em cultura antes de usá-los para estabelecer co-culturas organoides¹⁰. No entanto, os fibroblastos alteram a morfologia e a identidade durante a passagem, demonstrada pelo uso de fibroblastos primários da pele e do coração^17,18. A passagem 2D convencional de fibroblastos esofágicos resulta em alterações morfológicas e fenotípicas, demonstrando que o enriquecimento in vitro de fibroblastos não é adequado para co-culturas com o objetivo de fenocopiar o nicho de células-tronco endógenas.

A coloração de montagem completa fornece uma ferramenta para manter e visualizar a interação fibroblasto-organóide. Deve-se notar que, embora nem todos os organoides tenham fibroblastos diretamente ligados a eles, a maioria dos organoides está em contato com fibroblastos (ver Figura 2C). Para manter as interações epitélio-fibroblasto, é importante manusear os organoides com cuidado e evitar pipetagem vigorosa, vórtice e rotação de alta velocidade. A fixação ideal é importante para manter a arquitetura tecidual 3D, bem como manter a fluorescência endógena. Uma fixação de 30 min é suficiente para reter o sinal H2BeGFP e é ideal para os anticorpos usados neste protocolo, porém isso pode variar entre os fluoróforos e anticorpos usados. A limpeza dos organoides reduz a dispersão da luz e melhora substancialmente a visualização de toda a estrutura 3D. Como os organoides são pequenos, a limpeza é fácil e rápida; no entanto, a obtenção de imagens de organoides inteiros usando microscopia confocal de varredura a laser pode ser demorada, pois várias pilhas Z precisam ser feitas. Microscópios confocais, como o disco giratório, podem ser usados para reduzir o tempo de imagem.

Em geral, organoides esofágicos cultivados na presença de fibroblastos fornecem uma ferramenta valiosa para entender aspectos do nicho de células-tronco esofágicas. Além disso, a limpeza de montagem completa fornece um método acessível para visualizar a interação entre fibroblastos e organoides.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suplemento B-27 (50X), sem soro	Thermo Fisher (Gibco)	17504001
Corning  Matrigel  Matriz de membrana basal reduzida por fator de crescimento (TFG)	fisher scientific	356231
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	276855-100ML
DMEM/F-12	Thermo Fisher (Gibco)	11320074
DPBS	Thermo Fisher (Gibco)	14190250
Soro bovino fetal	Sigma-Aldrich	F7524
GlutaMAX Suplemento	Thermo Fisher (Gibco)	35050061
HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem fenol vermelho	Thermo Fisher (Gibco)	14175-129
Soro de Burro Normal	Jackson Immuno	017-000-121
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher (Gibco)	15140122
Solução Triton X-100	Merck	93443-100ML
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol	Thermo Fisher (Gibco)	25200-056
Produtos químicos, peptídeos e proteínas recombinantes
DAPI Solução	Thermo Fisher	62248
Solução de dissociação: 0,25 mg/ml Liberase TM, 0,25 mg/ml Dnase em HBSS
Dnase I	Sigma-Aldrich
Formaldeído, 37%, com 10-15% de metanol	Sigma-Aldrich	252549-1L
Liberase	Sigma-Aldrich	5401127001
N-Acetil-cisteína	Sigma-Aldrich	A9165-25G
Noggin murine	Peprotech	250-38
RapiClear 1.47	SunJin Lab	#RC147001
Proteína EGF de camundongo recombinante, CF	R& D systems	2028-EG-200
R-spondin-1 murine	Peprotech	315-32
SYTOX Blue Dead Cell Stain	Thermo Fisher	S34857
Thermolysin	Sigma-Aldrich	T7902-25MG
Y-27632 dicloridrato	Sigma-Aldrich	Y0503-5MG
strong>Plastic & Vidros
Corning Filtros de Células Estéreis 40um	VWR	15360801
Filtros de Células Estéreis Corning 70um	VWR	431751
Menzel Deckglä ser/lamínulas	Thermo Fisher	Q10143263NR15
Tubo de reação SafeSeal, 1,5 mL, PP	Sarstedt	72.706
Tubos de microcentrífuga de baixa retenção com tampa de pressão 0,6 mL	Thermo Fisher	3446
SuperFrost Slides	VWR	631-9483
Tools
0,05 mm 4 poços circulares iSpacer	SunJin Lab	#IS204
Dumont # 5 fórceps, ponta de biologia	FST	11252-20
ImmEdge Pen	VectorLaboratories	H-4000
Tesoura de mola inclinada para a ponta lateral da bola 8mm Ponta de corte	FST	15033-09
< strong>Instrumentos< / strong >
microscópio confocal Stellaris 5	Leica
ZEISS Stemi 305	Zeiss
FACS ARIA III	BD Biosciences
Anticorpos conjugados para FACSAlexa
Fluor 647 anti-mouse CD104 Anticorpo Clone: 346-11A	123608	123608
APC anti-mouse CD26 (DPP-4) Anticorpo	H194-112	H194-112
PE/Cy7 anti-camundongo/CD324 humano (E-caderina) Anticorpo	147310	147310
Anticorpos para imunofluorescência
CD104 (ß-integrina 4) Clone: 346-11A	BioLegend	553745
Cytokeratin 14	Acris Anticorpos (AbD Serotec)	BP5009
Citoqueratina13 Clone: EPR3671	abcam	ab92551
E-caderina (CD324) Clone: 2.40E+11	Tecnologia de Sinalização Celular	3195
Queratina 5 Anticorpo Policlonal de Frango, Purificado Clone: Poly9059	BioLegend	905901
p63 Clone: 4a4	abcam	ab735
Antibod anti-KLF4 recombinante Clone: EPR20753-25	abcam	ab214666
Vimentin	Sigma-Aldrich	AB5733
Anticorpos secundários
Anticorpos anti-espécie* de burro com fluoróforo de escolha	Jackson Immuno