Summary
In questo studio, viene presentata una serie di metodi per preparare campioni DESI-MSI dagli impianti e viene descritta in dettaglio una procedura di installazione dell'assemblaggio DESI, acquisizione dei dati MSI ed elaborazione. Questo protocollo può essere applicato in diverse condizioni per l'acquisizione di informazioni sul metaboloma spaziale nelle piante.
Abstract
L'uso medicinale della medicina tradizionale cinese è dovuto principalmente ai suoi metaboliti secondari. La visualizzazione della distribuzione di questi metaboliti è diventata un argomento cruciale nella scienza delle piante. La spettrometria di massa può estrarre enormi volumi di dati e fornire informazioni sulla distribuzione spaziale su questi analizzando fette di tessuto. Con il vantaggio di un'elevata produttività e di una maggiore precisione, l'imaging con spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray a desorbimento (DESI-MSI) viene spesso utilizzato nella ricerca biologica e nello studio della medicina tradizionale cinese. Tuttavia, le procedure utilizzate in questa ricerca sono complicate e non accessibili. In questo studio, abbiamo ottimizzato le procedure di sezionamento e imaging DESI e sviluppato un metodo più economico per identificare la distribuzione dei metaboliti e classificare questi composti nei tessuti vegetali, con particolare attenzione alle medicine tradizionali cinesi. Lo studio promuoverà l'utilizzo del DESI nell'analisi dei metaboliti e nella standardizzazione della medicina tradizionale cinese / medicina etnica per le tecnologie legate alla ricerca.
Introduction
La visualizzazione della distribuzione dei metaboliti è diventata un argomento cruciale nella scienza delle piante, specialmente nella medicina tradizionale cinese, in quanto svela il processo di formazione di specifici metaboliti all'interno della pianta. Con riferimento alla medicina tradizionale cinese (MTC), fornisce informazioni sui componenti attivi e guida l'applicazione di parti di piante in applicazioni farmaceutiche. Normalmente, la visualizzazione dei metaboliti si ottiene mediante ibridazione in situ, microscopia a fluorescenza o immunoistochimica, tuttavia il numero di composti rilevati da questi esperimenti trasmette informazioni chimiche limitate. In combinazione con la colorazione dei tessuti, la spettrometria di massa (MSI) può fornire una grande quantità di dati e fornire informazioni sulla distribuzione spaziale dei composti scansionando e analizzando fette di tessuto a livello di micron1. MSI utilizza analiti per il desorbimento e la ionizzazione dalla superficie del campione, seguiti dall'analisi di massa degli ioni di fase vapore risultanti e dall'applicazione di software di imaging per integrare le informazioni e tracciare un'immagine bidimensionale che registra una specifica abbondanza di ioni. Questa tecnologia può determinare sia molecole esogene che endogene rilevando la distribuzione caratteristica dei farmaci e dei loro metaboliti indotti nei tessuti e negli organi bersaglio 2,3,4,5.
Negli ultimi decenni sono state sviluppate varie modalità di imaging della SM; i più importanti tra questi sono MSI (DESI-MSI) basato sulla ionizzazione elettrospray di desorbimento, desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI) e spettrometria di massa di ioni secondari (SIMS)6. DESI-MSI è spesso utilizzato nella ricerca biologica grazie al suo funzionamento atmosferico, all'elevata produttività e alla maggiore precisione7. MALDI è stato applicato per identificare un frammento di transtiretina come potenziale biomarcatore nefrotossico per la gentamicina e per analizzare la distribuzione del metabolita neurotossico 1-metil-4-fenilpiridinio dopo la gestione di 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina nel cervello di topo 8,9. MALDI e DESI sono stati utilizzati per determinare la composizione di strutture cristalline indotte da farmaci nel rene di conigli dosati; Queste strutture sono composte principalmente da metaboliti formati a causa della demetilazione e/o ossidazione del farmaco10. Inoltre, l'MSI è stato applicato nella localizzazione della distribuzione metabolica della tossicità dei farmaci negli organi bersaglio. Tuttavia, le cellule nel tessuto vegetale variano e sono diverse dagli animali e richiedono speciali procedure di sezionamento.
Nelle piante, utilizzando l'imaging MALDI, finora, è stata analizzata la distribuzione di diversi composti nel fusto di grano (Triticum aestivum), semi di soia (Glycine max), semi di riso (Oryza sativa), fiori e radici di Arabidopsis thaliana e semi di orzo (Hordeum vulgare) 11,12,13,14,15,16,17,18 . Studi recenti hanno riportato che DESI-MSI sta emergendo nell'analisi dei metaboliti di farmaci e prodotti naturali, specialmente in MTC come Ginkgo biloba, Fuzi e Artemisia annua L 19,20,21. In questi studi, i protocolli per la preparazione di campioni di materiale vegetale differiscono e alcuni richiedono attrezzature più complesse, come un microtomo di congelamento. DESI-MSI ha requisiti rigorosi per la planarità superficiale del campione rilevato. Quando si analizza l'organo o il tessuto di un animale, il campione viene solitamente realizzato mediante crio-sezione22. Tuttavia, la procedura per la criosezione è complicata e più costosa e il metodo comunemente usato della temperatura di taglio ottimale dell'adesivo (OCT) ha un segnale forte durante l'imaging. Inoltre, i tessuti medicinali della MTC variano; ad esempio, la radice di Salvia miltiorrhiza, conosciuta come Danshen in cinese, è usata in medicina, mentre in Zisu (Perilla frutescens), la foglia è usata23,24. Pertanto, è necessario migliorare le procedure di preparazione del campione per promuovere l'utilizzo del DESI nell'analisi dei metaboliti per la MTC.
Come erba perenne e MTC comunemente usata, S. miltiorrhiza è stata inizialmente registrata nella più antica monografia di medicina, Shennong's Classic of Materia Medica (conosciuta come Shennong Bencao Jing in cinese). In questo studio, abbiamo ottimizzato le procedure di sezionamento e imaging DESI e sviluppato un metodo più economico per identificare la distribuzione e classificare i composti nei tessuti di S. miltiorrhiza. Questo metodo può anche superare gli svantaggi associati ai tessuti asciutti - che di solito si fratturano facilmente sotto il colpo di azoto - e promuovere lo sviluppo della MTC. Lo studio promuoverà la standardizzazione della MTC/medicina etnica per le tecnologie legate alla ricerca.
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Protocol
1. Preparazione del campione
- Raccogliere radici e foglie pulite da una pianta di Salvia miltiorrhiza di 2 anni (Figura 1A) e tagliare direttamente a mano uno spessore della sezione trasversale di circa 3-5 mm. Quindi, incollare il campione su un vetrino da microscopio ad adesione utilizzando nastro biadesivo (Figura 1B).
NOTA: assicurarsi che le dimensioni del nastro biadesivo siano maggiori del campione. Se i tessuti sono essiccati, immergerli in acqua o paraformaldeide al 4% durante la notte prima di affettarli. - Mettere un altro vetrino da microscopio sopra il campione e avvolgere i due vetrini con una pellicola sigillante come un sandwich (Figura 1C). Congelare il campione sandwich a -80 °C per almeno 4 ore, quindi sottoporlo a un vuoto d'aria per 2 ore (figura 1D) con i seguenti parametri di impostazione: temperatura di intercettazione a -75-82 °C e vacuometro a 2,5-3,7 Pa.
NOTA: Assicurarsi che i due vetrini siano paralleli quando si avvolge la pellicola sigillante per mantenere intatta la superficie del campione. Se i tessuti vegetali hanno un alto contenuto di umidità, estendere il tempo di vuoto d'aria a 3 ore. Non superare le 5 ore, altrimenti i tessuti si fratturano facilmente. - Conservare i campioni sandwich a -80 °C fino all'analisi. Portare i campioni a temperatura ambiente in un essiccatore per evitare la condensa sulla superficie del campione. Quindi, sottoporre il campione all'applicazione della matrice.
2. Installazione dell'unità di ionizzazione elettrospray di desorbimento (DESI)
- Implementare la configurazione del rivelatore e la calibrazione di massa dello strumento in modalità ESI; effettuare la configurazione del rivelatore utilizzando l'encefalina leucina (LE) in soluzione acquosa-acetonitrile (1:1 v/v) ed eseguire la calibrazione di massa con formiato di sodio (NaFA) in soluzione acquosa-isopropanolo (1:1 v/v).
- Estrarre la sorgente ESI e montare l'unità DESI sullo spettrometro di massa. Collegare l'alimentazione del gas N2 all'unità DESI e regolare la pressione del gas a circa 0,5 MPa (Figura 2A). Non è necessario sfogare lo strumento durante lo scambio di fonti.
- Riempire la siringa da 5 mL con LE e acido formico in soluzione acquosa metanolo (1:9 v/v) e collegare la siringa alla pompa a siringa ad alte prestazioni per fornire solvente per la ionizzazione delle sostanze chimiche nel campione (Figura 2B).
- Collegare un solvente capillare alla siringa e allo spruzzatore DESI (Figura 2C). Il solvente che fornisce capillare è un capillare standard di 75 μm di diametro interno e 375 μm di diametro esterno; è piuttosto stretto e viene facilmente bloccato dalle impurità, pertanto i solventi utilizzati nei processi di scansione devono essere di grado MS e filtrati prima dell'uso per ridurre il rischio di blocco.
- Avviare la pompa a siringa e impostare la velocità di infusione a 2 μL/min per ottenere un flusso e uno spruzzo costanti del solvente (Figura 2B). Spegnere la valvola del gas N2 , quindi dopo circa 15 s accenderla; Una piccola goccia di solvente verrà soffiata sul palco e lo spray può essere visto se il flusso di solvente è in uno stato costante.
- Regolare la posizione dello spruzzatore in termini di angolo di spruzzatura, asse XYZ, sporgenza e altezza (Figura 2D). Utilizzare marcatori rossi e neri come riferimenti per ottimizzare il segnale di spettrometria di massa, per ottenere un'intensità del segnale superiore a 1 x 105 in modalità sensibilità (Figura 2E).
- La protrusione dello spruzzatore è il fattore più significativo che influenza l'intensità del segnale; regolare la sporgenza cambiando la protezione del gas N2 con una chiave da 5 mm. La direzione dello spruzzo influenza la qualità dell'immagine di massa; Ruotare lo spruzzatore fino a quando lo spray è dritto. Una volta regolata la protrusione nella posizione di intensità del segnale migliore, cercate di non cambiarla durante lo scambio delle sorgenti.
- Dopo tutti i passaggi precedenti, la configurazione è pronta per gli esperimenti e la configurazione è normalmente stabile per >3 settimane di usabilità, osservata dopo la configurazione iniziale.
3. Acquisizione di immagini DESI-MS
- Per DESI-MSI, non eseguire alcun pretrattamento del campione. Per i campioni che hanno già un pretrattamento, ridurre al minimo le fasi di pretrattamento il più possibile. Ad esempio, alcuni campioni possono essere realizzati solo con supporti di montaggio, quindi rimuovere il supporto in eccesso sulle diapositive, se possibile.
- Acquisire un'immagine dell'esempio sulla diapositiva (Figura 3A). Non toccare la superficie del campione per evitare l'assorbimento di impurità.
- Posizionare la slitta sulla posizione della piastra sul palco DESI. Il palco ha due posizioni di piatto, A e B; È importante ricordare la giusta posizione. Utilizzare guide standard (75 mm x 25 mm) o una diapositiva completa, altrimenti la guida non si adatta alla posizione e non può essere tenuta in modo stabile. Una diapositiva completa (120 mm x 80 mm) può ospitare fino a quattro vetrini e quindi ha un'area molto più ampia per gli esperimenti.
- Aprire il software di elaborazione delle immagini di massa ad alta definizione, impostare una nuova lastra nella scheda Acquisisci e selezionare la posizione corretta della lastra (A o B) e il tipo di piastra. Nella pagina di selezione dell'immagine, selezionare i quattro angoli della diapositiva, quindi l'immagine viene regolata automaticamente sull'orientamento corretto (Figura 3A).
- Impostare i parametri MS; il tipo di esperimento comunemente usato è la modalità DESI-MS, in cui verrà rilevato solo lo ione genitore. Lo strumento può utilizzare una sola polarità in un esperimento; Pertanto, selezionate la polarità come positiva o negativa. Per ottenere maggiori informazioni sulle sostanze chimiche in piccole quantità, applicare la modalità di sensibilità (Figura 3B).
- Disegnate un rettangolo per definire l'area di scansione nella scheda Modello e impostate la dimensione in pixel. In genere, per la modalità DESI-MS, mantenere uguali le dimensioni X e Y dei pixel. Impostare la velocità di scansione su non più di 5 volte la dimensione dei pixel (Figura 3C).
- Salvare il progetto ed esportare un foglio di lavoro per il software di acquisizione della spettrometria di massa.
- Aprire il software di acquisizione della spettrometria di massa, importare il foglio di lavoro e salvarlo come nuovo elenco di campioni. Premere Avvia esecuzione per iniziare la scansione MSI. È possibile aggiungere più immagini alla coda degli esperimenti importando più fogli di lavoro.
4. Trattamento e visualizzazione dei dati DESI-MSI
- Caricare il file di dati del campione nel software di elaborazione delle immagini di massa e impostare i parametri per l'elaborazione delle immagini DESI (Figura 3D). Poiché la leucina encefalina è stata utilizzata per la massa interna della serratura e la massa della serratura è l'unico punto per identificare la polarità dell'esperimento, è di grande importanza impostare la massa di blocco corretta. Impostare i seguenti valori: per la modalità positiva: 556.2772; Per la modalità negativa: 554.2620.
- È possibile creare un elenco di sostanze chimiche target, nel qual caso il risultato dell'elaborazione si concentrerà sulle sostanze chimiche nell'elenco target. Caricare il file di dati elaborato per visualizzare l'immagine DESI del campione. Fare clic sul pulsante "Normalizzazione" per normalizzare i dati mediante cromatografia ionica totale (TIC) per ottenere l'intensità relativa di una sostanza chimica specifica rispetto al riferimento, quindi è possibile confrontare diversi campioni tra loro (Figura 3E).
- Disegnare una regione di interesse (ROI) e copiare diverse copie sull'immagine di esempio; I ROI possono essere realizzati su immagini diverse. Selezionare tutti i ROI ed esportare l'analisi multivariata (MVA) per estrarre le informazioni MS da tutti i ROI per MVA (Figura 3F).
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Representative Results
Questo protocollo può portare all'identificazione e alla distribuzione di composti in campioni vegetali. Nell'immagine MS di uno specifico m/z, il colore di ogni singolo pixel rappresenta l'intensità relativa del m/z, quindi può essere associato alla distribuzione naturale e all'abbondanza dello ione metabolita in tutto il campione. Maggiore è l'abbondanza della sostanza chimica nella posizione di raccolta, più luminoso è il colore. La barra nell'immagine (Figura 4A-D) mostra la sfumatura dei colori. Qui, abbiamo selezionato due composti che sono preziosi nell'uso medicinale di S. miltiorrhiza. Come mostrato nella Figura 4A-D, la distribuzione dei composti bersaglio, Tanshinone IIA (m/z: 333.0893, M+H) e acido rosmarinico (m/z: 705.1848, 2M+H-O), è visibile in diverse aree della radice. Nel frattempo, il composto Danshenol A (m/z: 297.1127, M+H; m/z: 335.0686, M+K) è stato rilevato nella foglia, come mostrato nella Figura 4E-H. La distribuzione dei composti può essere utilizzata per guidare l'uso della parte vegetale in applicazioni mediche; inoltre, i dati MVA esportati possono essere applicati per eseguire ulteriori analisi metabolomiche.
Figura 1: Metodo di preparazione del campione . (A) La pianta (Salvia miltiorrhiza) utilizzata in questa ricerca. La freccia rossa indica il tessuto raccolto come campione. (B,C) Schema che mostra come preparare un campione di sandwich. D) Vuoto d'aria dei campioni. La temperatura impostata è -83,1 ± 3 °C e l'intervallo di vuoto è 3-5 Pa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Attrezzature e apparecchiature nell'unità DESI-MSI . (A) Vista frontale dell'assemblaggio DESI. (B) Pompa a siringa. (C) Spruzzatore capillare. (D) Vista dall'alto dell'assieme DESI. (E) Ottimizzazione del segnale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Acquisizione, analisi dei dati e visualizzazione da parte di DESI-MSI. (A) Caricare l'immagine nel software di elaborazione delle immagini di massa e selezionare gli angoli della diapositiva per regolare l'immagine con il giusto orientamento. (B) Impostare i parametri MS, impostare l'intervallo di scansione m/z e selezionare la modalità positiva o negativa. (C) Definire l'area di scansione, la risoluzione dell'immagine e la velocità di scansione. (D) Impostare i parametri di elaborazione: numero di masse target, massa di blocco, frequenza del campione e durata. (E) Caricare il risultato e normalizzare i dati. Selezionare l'm/z previsto dall'elenco di massa per visualizzare l'immagine MS di m/z. (F) Disegnare regioni di interesse (ROI) sull'immagine MS ed esportare MVA per l'analisi metabolomica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Imaging con spettrometria di massa di sezioni radicali e intere di foglie. (A-D) Immagini che mostrano la distribuzione spaziale di due composti selezionati nella radice. (E-H) Immagini che mostrano la distribuzione spaziale di due composti selezionati in foglia. Il colore di ogni singolo pixel rappresenta l'intensità relativa del m/z e quindi può essere associato alla distribuzione naturale e all'abbondanza dello ione metabolita in tutto il campione. Maggiore è l'abbondanza della sostanza chimica nella posizione di raccolta, più luminoso è il colore. La barra nelle immagini mostra la sfumatura dei colori. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
L'emergere della tecnologia SM ha aperto una nuova visione della ricerca sui prodotti naturali a livello molecolare negli ultimi anni24. Lo strumento MS, con la sua elevata sensibilità e l'elevata produttività, consente analisi mirate e non mirate di metaboliti in prodotti naturali, anche con concentrazione di tracce25. Pertanto, la SM è attualmente ampiamente utilizzata nel campo della chimica della medicina tradizionale cinese (MTC). La ricerca qualitativa e quantitativa sulla composizione chimica della MTC può fornire informazioni sugli ingredienti del medicinale e sul suo composto associato, che non solo forniscono un riferimento adeguato per la ricerca farmacologica, ma forniscono anche la base per la costruzione di un sistema standard di qualità per la MTC26. Inoltre, nei prodotti naturali, le firme metaboliche sono solitamente correlate alle caratteristiche morfologiche e istologiche27; Pertanto, è di grande utilità condurre analisi in situ per identificare il meccanismo e la risposta delle piante a varie condizioni di stress biotico e abiotico28. Tuttavia, poiché i campioni per l'analisi tradizionale della SM sono soluzioni di estratti di un determinato prodotto naturale o delle sue parti specifiche, la SM non ottiene informazioni sulla distribuzione spaziale o temporale dei metaboliti nei campioni. La tecnica MSI, una tecnologia relativamente nuova sviluppata solo due decenni fa, ottiene metaboliti dai campioni di prodotti naturali, analizza le informazioni molecolari sia qualitativamente che quantitativamente e registra le informazioni spaziotemporali. Successivamente, con l'aiuto di strumenti di mappatura, è possibile simulare le coordinate 2D o 3D di molecole specifiche29.
La tecnica DESI-MSI utilizzata in questo studio è una nuova tecnica MSI sviluppata nel 2004 dal gruppo di Cooks alla Purdue University (USA)30. Rispetto ad altre tecniche MSI utilizzate in precedenza, tra cui la spettrometria di massa a ioni secondari (SIMS)31, la ionizzazione di desorbimento laser assistita da matrice (MALDI)32 e la ionizzazione elettrospray per ablazione laser (LAESI)33, DESI presenta diversi vantaggi. SIMS e MALDI hanno entrambi bisogno di un ambiente ad alto vuoto per ionizzare i campioni e, per MALDI, i campioni devono essere montati su una superficie conduttiva7. Inoltre, la preparazione del campione per tutte e tre queste tecniche comporta diversi passaggi complicati. DESI, come nuova tecnica ESI, si basa su un principio di ionizzazione morbida simile alla ionizzazione elettrospray (ESI) nella spettrometria di massa per cromatografia liquida (LC-MS)30. Pertanto, gli ioni rilevati sono per lo più ioni quasi-molecolari e la frammentazione può anche essere eseguita se necessario, il che supera l'inconveniente della ionizzazione dura nella tecnica SIMS, generando ioni secondari che possono insultare la perdita di informazioni7. DESI funziona in condizioni ambientali, quindi non ha bisogno di molto tempo per raggiungere le condizioni di lavoro dopo aver inserito i campioni nell'apparecchiatura. A causa del principio di ionizzazione distruttiva minimizzato, è possibile eseguire esperimenti ripetutamente su un campione, quindi non sono necessari campioni aggiuntivi per una seconda modalità (negativa o positiva).
Questo articolo descrive principalmente un metodo economico per preparare campioni di piante e imaging utilizzando la tecnica DESI-MSI. In questo metodo, lo spessore della sezione trasversale del campione non gioca alcun ruolo chiave; Invece, la superficie piana del campione è cruciale, che è garantita dal sandwich aria-vuoto. Nel caso degli impianti, la preparazione dei campioni DESI può essere ottenuta in diversi modi e svolgere un ruolo chiave nell'imaging della SM. Le foglie sono spesso problematiche in quanto mostrano una superficie irregolare, morbida e della cuticola di cera, che potrebbe causare un segnale basso durante l'imaging, mentre la radice contiene un alto contenuto di lignina ed è facile da fratturare durante l'imaging. Lavori precedenti hanno mostrato che la radice di S. miltiorrhiza è stata crio-sezionata su un microtomo di criostato durante l'analisi DESI-MSI, mentre la foglia è stata preparata imprimendo34. Tuttavia, il metodo di imprinting potrebbe indurre una perdita di intensità del segnale durante l'imaging MSI a causa della rapida dissoluzione dei metaboliti depositati sulla superficie del vetro. Con questo protocollo (passo 1.2), come previsto, le sezioni di radice (Figura 4A,B) e foglia (Figura 4E,F) rimangono intatte durante l'imaging MS. Inoltre, il metodo per preparare i campioni, mediante cito-sezione con un microtomo criostato, è ad alto costo a causa della costosa macchina.
Sebbene il nostro metodo abbia molti vantaggi rispetto ad altre tecniche, ci sono ancora alcune limitazioni. In primo luogo, il taglio manuale dei campioni (fase 1.1) richiede pratica per mantenere adatto lo spessore della sezione trasversale. Inoltre, la risoluzione spaziale e l'intensità di picco del DESI sono relativamente basse rispetto a MALDI. Nonostante l'imperfezione, tutti i vantaggi rendono la tecnica DESI un metodo rapido ed economico per studiare la distribuzione spaziotemporale dei metaboliti nelle piante. Inoltre, DESI-MSI è già stato utilizzato nel campo della medicina, della microbiologia e della chimica dei prodotti naturali35. Con la crescente popolarità e il rapido miglioramento in diverse dimensioni di questa tecnica, otterrà sempre più applicazioni in tutti i campi relativi in futuro7.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Natural Science Foundation della provincia del Sichuan (n. 2022NSFSC0171) e dallo Xinglin Talent Program dell'Università di Chengdu di TCM (n. 030058042).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
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