Summary
يصف البروتوكول الحالي خطوات التنقية والدراسات اللاحقة لأربعة أنواع مختلفة من β الجلوكان الفطرية كجزيئات مناعية محتملة تعزز الخصائص المضادة للورم للخلايا الدبقية الصغيرة ضد خلايا الورم الأرومي الدبقي.
Abstract
أحد أكبر التحديات في تطوير علاجات فعالة ضد الورم الأرومي الدبقي هو التغلب على قمع المناعة القوي داخل البيئة المكروية للورم. برز العلاج المناعي كاستراتيجية فعالة لتحويل استجابة الجهاز المناعي ضد الخلايا السرطانية. تعد الضامة المرتبطة بالورم الدبقي والخلايا الدبقية الصغيرة (GAMs) من الدوافع الرئيسية لمثل هذه السيناريوهات المضادة للالتهابات. لذلك ، قد يمثل تعزيز الاستجابة المضادة للسرطان في GAMs علاجا مساعدا مشتركا محتملا لعلاج مرضى الورم الأرومي الدبقي. في هذا السياق ، تعرف جزيئات β-glucan الفطرية منذ فترة طويلة باسم معدلات المناعة القوية. تم وصف قدرتها على تحفيز النشاط المناعي الفطري وتحسين الاستجابة للعلاج. وتعزى هذه السمات المعدلة جزئيا إلى قدرتها على الارتباط بمستقبلات التعرف على الأنماط ، والتي ، من المثير للاهتمام ، يتم التعبير عنها بشكل كبير في GAMs. وبالتالي ، يركز هذا العمل على عزل وتنقية واستخدام β-glucans الفطرية لتعزيز استجابة مبيدات الأورام للخلايا الدبقية الصغيرة ضد خلايا الورم الأرومي الدبقي. تستخدم خطوط خلايا الورم الأرومي الدبقي للفأر (GL261) والخلايا الدبقية الصغيرة (BV-2) لاختبار الخصائص المناعية لأربعة أنواع مختلفة من β الجلوكان الفطرية المستخرجة من الفطر المستخدم بكثافة في صناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية الحالية: Pleurotus ostreatus و Pleurotus djamor و Hericium erinaceus و Ganoderma lucidum. لاختبار هذه المركبات ، تم إجراء فحوصات التحفيز المشترك لقياس تأثير وسط مكيف بالخلايا الدبقية الصغيرة المنشط مسبقا على الانتشار وتنشيط موت الخلايا المبرمج في خلايا الورم الأرومي الدبقي.
Introduction
على الرغم من ظهور إنجازات جديدة في مجال الأورام العصبية ، فإن متوسط العمر المتوقع لمرضى الورم الأرومي الدبقي لا يزال ضئيلا. تعتمد العلاجات القياسية الذهبية ضد أورام المخ على دمج الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي. ومع ذلك ، في العقد الماضي ، ظهر العلاج المناعي كاستراتيجية قوية لعلاج أنواع مختلفة من السرطان1. وهكذا ، أصبحت إمكانية تسخير الاستجابة المناعية للجسم ضد الخلايا السرطانية مؤخرا الركيزة الرابعة لعلم الأورام.
من المعروف منذ فترة طويلة أن أحد أكبر التحديات في هذا المجال هو التغلب على كبت المناعة القوي الموجود داخل البيئة المكروية للورم2. على وجه الخصوص ، في حالة الورم الأرومي الدبقي ، أحد أكثر أشكال سرطان الدماغ شيوعا وعدوانية ، فإن الكشف عن المسارات الرئيسية التي تنظم مثل هذه السيناريوهات المؤيدة للورم وإيجاد مركبات جديدة يمكن أن تتصدى للاستجابة المحبطة للجهاز المناعي قد يمهد الطريق للعلاجات المستقبلية ضد هذا المرض غير القابل للشفاء.
يمتلك الدماغ خلايا الجهاز المناعي الخاصة به ، ونوع الخلايا الأكثر صلة هو الخلايا الدبقية الصغيرة. وقد ثبت أن هذه الخلايا لديها سلوك معقد إلى حد ما عبر الأمراض المركزية المختلفة3. في حالة أورام الدماغ الأولية (على سبيل المثال ، الورم الأرومي الدبقي) ، يتم تحويل هذه الخلايا نحو نمط ظاهري مضاد للالتهابات يدعم الخلايا السرطانية لاستعمار حمة الدماغ3. عززت العديد من المنشورات الدور الرئيسي لهذه الخلايا أثناء تطور الورم. أحد الأسباب الرئيسية لذلك هو أن الخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بالورم الدبقي والبلاعم المتسللة (GAMs) تمثل ثلث إجمالي كتلة الورم ، مما يشير إلى التأثير الواضح لحالات تنشيطها أثناء تطور ورم المخ 4,5.
في هذا السياق ، تم وصف β-glucans الفطرية بأنها جزيئات قوية تؤدي إلى استجابات مناعية فعالة ، بما في ذلك البلعمة وإنتاج العوامل المؤيدة للالتهابات ، مما يؤدي إلى القضاء على العوامل الضارة6،7،8،9،10. تمت دراسة β-glucans الفطرية بشكل عام باستخدام مقتطفات من أجزاء مختلفة من الفطر. ومع ذلك ، فإن إسناد تأثيرات محددة يتطلب تنقيتها لتجنب الغموض والقدرة على فهم آلية عمل هذه الجزيئات مثل العوامل المناعية8.
في هذا العمل ، يتم تنقية β-glucans القابلة للذوبان من الجسم المثمر لأربعة أنواع مختلفة من الفطر ، والتي تستخدم بانتظام كصالحة للأكل (Pleurotus ostreatus و Pleurotus djamor) وكفطر طبي (Ganoderma lucidum و Hericium erinaceus). على وجه الخصوص ، هذه الفطر الأربعة لها استخدام كبير في صناعة الأغذية والأدوية وتم إنتاجها ضمن اقتصاد دائري صديق للبيئة في مؤسسة تجارية (انظر جدول المواد).
من أجل وضع الأساس للاستخدام المستقبلي للجلوكان β الفطرية في علاجات سرطان الدماغ ، فإن استراتيجيات التنقية المحددة جيدا والدراسات قبل السريرية التي تتعمق في تفاعلها المفترض مع خلايا الجهاز المناعي ضرورية لتقييم دورها المحتمل كوسطاء مضادين للورم. يصف هذا العمل الخطوات العديدة للعزل والتنقية اللازمة لاسترداد β-glucans القابلة للذوبان الموجودة داخل الأجسام المثمرة للفطر المختار. بمجرد تنقيتها بنجاح ، يتم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة لتعزيز نمطها الظاهري الالتهابي. يتم طلاء خلايا الورم الأرومي الدبقي للفأر (GL261) بوسط مختلف مكيف للخلايا الدبقية الصغيرة ، تمت معالجته مسبقا بهذه المستخلصات ، ثم يتم تقييم تأثيره على سلوك الخلايا السرطانية. ومن المثير للاهتمام ، أن الدراسات التجريبية من مختبرنا (البيانات غير معروضة) كشفت كيف أن الخلايا الدبقية الصغيرة المؤيدة للالتهابات قد تبطئ هجرة الخلايا السرطانية وخصائص الغزو ليس فقط في خلايا الورم الأرومي الدبقي ولكن أيضا في خطوط الخلايا السرطانية الأخرى. قد يوفر هذا العمل متعدد التخصصات أداة مفيدة للباحثين في علم الأورام لاختبار المركبات الواعدة القادرة على تعزيز الاستجابة المناعية في العديد من أنواع الأورام المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على أنواع الفطر الأربعة المختلفة الموصوفة في هذا البروتوكول من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
1. عزل β الجلوكان الفطرية
- استخراج وعزل السكريات الفطر القابلة للذوبان
ملاحظة: تم الحصول على السكريات الفطر القابلة للذوبان (SMPs) وفقا للإجراء الموضح بشكل تخطيطي في الشكل 1.- اشطف بلطف أجسام P. ostreatus و P. djamor و H. erinaceus و G. lucidum المثمرة (حوالي 2000 جم / فطر) في الماء المقطر خمس مرات.
- جفف أجسام الفاكهة عند 50 ± 2 درجة مئوية في فرن تجفيف الهواء التقليدي حتى يتم الوصول إلى وزن ثابت (~ 24 ساعة).
- طحن الفطر المجفف في مطحنة شفرة ، والحصول على حوالي 200 غرام من مسحوق من كل فطر.
- 100 غرام من مسحوق الفطر (MP) (P. ostreatus و P. djamor و H. erinaceus و G. lucidum) في 1000 مل من H2Od. ثم ، الأوتوكلاف على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، وأخيرا يترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي التعليق الناتج عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- جفف الراسب الذي يحتوي على عديد السكاريد الفطر غير القابلة للذوبان (IMPs) عند 50 ± 2 درجة مئوية في فرن تجفيف بالهواء لمدة 24 ساعة.
- تخلص من المادة المترسبة واحتفظ بالمادة الطافية. ركز المادة الطافية 10 مرات في مبخر دوار.
- ترسيب التركيز الذي يحتوي على SMPs مع الإيثانول (80٪ تركيز نهائي) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- قم بطرد مركزي لتعليق الإيثانول عند 6000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، واحتفظ بالحبيبات (راسب) ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
- اغسل المادة المترسبة ثلاث مرات ب 80٪ من الإيثانول قبل إذابتها في H2Od (10٪ w / v). اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.5 / 7 ودرجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية ، وعالج ب 2 U و 4 U من α-amylase و glucoamylase ، على التوالي ، لإذابة α-glucans باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- بعد العلاج باستخدام α-amylase / glucoamylase ، اضبط درجة الحموضة ودرجة الحرارة إلى 8.0 و 50 درجة مئوية ، على التوالي ، وعالج باستخدام alcalase (2.5 وحدة / جم من البروتين) (انظر جدول المواد) لإذابة البروتينات.
ملاحظة: يزيل هذا العلاج الأنزيمي المتسلسل معظم α-glucans والبروتينات التي تترسب مع β-glucans في ترسيب الإيثانول. - بعد التحلل المائي ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالتحلل المائي عند 6000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ويتركز الطافي النظيف خمس مرات في مبخر دوار. ترسب مرة أخرى مع 80 ٪ من الإيثانول.
- إذابة الراسب الناتج في H2Od وغسيل الكلى في الماء المقطر لمدة 24 ساعة باستخدام أغشية أنابيب السليلوز (12000 Da أغشية مقطوعة ؛ انظر جدول المواد) لإزالة جزيئات الوزن الجزيئي المنخفضة. استرجع الجزء القابل للذوبان في الماء وقم بتجميده وتجفيفه لإنتاج β جلوكان قابل للذوبان (SβGs).
- قياس السكر والبروتين
- قم بقياس إجمالي محتوى السكر في كل جزء بطريقة حمض الفينول الكبريتيك ، باستخدام الجلوكوز كمعيار8.
ملاحظة: يمكن أيضا إجراء القياس الكمي لمحتوى β-glucan باستخدام مجموعة مقايسة β-glucan (الفطر والخميرة ؛ انظر جدول المواد) ، بناء على التحلل الأنزيمي ونشاط الأكسدة المؤكسدة: وهي exo-1،3-β-glucanase ، وأوكسيديز الجلوكوز ، و β-glucosidase ، و peroxidase ، مع التكوين اللاحق للكينونيمين. اتبع تعليمات الشركة المصنعة ، مع تعديلات طفيفة. - استخدم 18 MH 2 SO4 بدلا من 12 MH2SO4.
- تقييم محتوى إجمالي الجلوكان و α جلوكان بشكل منفصل.
- قم بقياس قيم β-glucan الناتجة كفرق بين إجمالي قيم الجلوكان و α-glucan (ثلاث نسخ) بعد بروتوكول Kjeldahl. في بعض الحالات ، يمكن تحديد محتوى البروتين بطريقة لوري ، باستخدام الألبومين لرسم منحنى المعايرة11,12.
- قم بقياس إجمالي محتوى السكر في كل جزء بطريقة حمض الفينول الكبريتيك ، باستخدام الجلوكوز كمعيار8.
- تحليل التحليل الطيفي للامتصاص فوق البنفسجي
- احصل على أطياف الأشعة فوق البنفسجية SβG (UV) باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية (انظر جدول المواد) عن طريق مسح العينات في منطقة 200-400 نانومتر (الشكل 2).
- تحضير 1.0 مجم / مل من كل SβG في H2Od ، ونقل المحلول إلى كوفيت كوارتز ، والمسح الضوئي في درجة حرارة الغرفة.
- تحليل توزيع الوزن الجزيئي
- تقدير تجانس SβGs والوزن الجزيئي للبوليمرات حسب كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائلة عالي الأداء (HPLC) (انظر جدول المواد) مجهز بكاشف معامل الانكسار وعمود ترشيح هلامي خطي فائق الهيدروجيل (300 مم × 7.8 مم ؛ الشكل 3).
- قم بإجراء الفحص عند 40 درجة مئوية باستخدام الماء منزوع الأيونات كمحلول بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة -1 و dextrans (110 و 80 و 50 كيلو دالتون) كمعايير (انظر جدول المواد). اجمع جزءا قدره 5 مل.
- تحليل الأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FTIR)
- سجل أطياف الأشعة تحت الحمراء (الشكل 4) على مطياف FTIR في حدود 4000-500 سم -1. يجب خلط العينات مسبقا مع KBr لتشكيل الأفلام (إجراء FTIR القياسي ؛ انظر تعليمات الشركة المصنعة وجدول المواد).
- تحليل التركيب الجزيئي
- تقدير التركيبات الجزيئية ل SβGs بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة عالية الأداء (HPTLC) بالإضافة إلى كروماتوغرافيا الغاز المقترنة بقياس الطيف الكتلي (GC-MS) ، باتباع الإجراءات القياسية12.
2. دراسة مخبرية لتحفيز الخلايا الدبقية الصغيرة التي يسببها β الجلوكان
- زراعة الخلايا للورم الأرومي الدبقي للفأر والخلايا الدبقية الصغيرة في شرائح حجرة ذات 8 آبار
ملاحظة: هذا البروتوكول خاص بخطوط خلايا GL261 (الورم الأرومي الدبقي) و BV2 (الخلايا الدبقية الصغيرة). ومع ذلك ، مع تعديلات طفيفة ، يمكن استخدام هذه الخطوات لدراسة خطوط السرطان والخلايا المناعية الأخرى.- تحضير وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) وسط كامل معدل مع L-glutamin ، 4.5 جم / لتر D-glucose ، وبدون بيروفات. أضف 10٪ من مصل الأبقار الجنينية (FBS) و 1٪ من البنسلين / الستربتومايسين (انظر جدول المواد). قم بتسخين المادة مسبقا في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- قم بإذابة قسامات BV2 و GL261 المجمدة في حمام مائي (37 درجة مئوية) لمدة دقيقتين ، وقبل أن تذوب تماما ، احملها إلى غطاء تدفق رقائقي وقم بطلاء الخلايا في قارورتين مختلفتين من T25 معقمة (واحدة لكل خط خلية).
- احتضان قوارير T25 عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 حتى تتلاقى الثقافة.
ملاحظة: اعتمادا على ظروف التجمد والوقت قيد الحفظ بالتبريد، قد يختلف الوقت حتى الالتقاء. تتطلب خطوط الخلايا هذه عادة ما بين 3 إلى 5 أيام للوصول إلى نقطة التقاء في قارورة T75. - بعد أن تصبح ثقافة خلية BV2 متقاربة ، قم بنقلها إلى شرائح حجرة ذات 8 آبار 0.6 × 106 خلايا / بئر. الحفاظ على شرائح غرفة 8 بئر في الحاضنة لمدة 24 ساعة.
- بمجرد طلاء الخلايا الدبقية الصغيرة في شرائح الغرفة المكونة من 8 آبار ، كرر نفس البروتوكول مع خلايا GL261.
- تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة مع β جلوكان
- قم بتغطية خلايا BV2 بأربعة β-glucans مختلفة (P. ostreatus و P. djamor و G. lucidum و H. erinaceus) بتركيز 0.2 مجم / مل لمدة 72 ساعة. يجب أن تظل حالة تجريبية واحدة دون علاج (وسط طبيعي) ، تعمل كمجموعة ضابطة.
- جمع طاف مع ماصة بعد 72 ساعة وتمرير الحجم المتبقي من خلال مرشح حقنة 0.20 ميكرومتر. ثم قم بتجميد المادة الطافية عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.
- علاج GL261 بوسط مكيف للخلايا الدبقية الصغيرة المنشط مسبقا
- بمجرد أن يتلاقى GL261 بنسبة 80٪ داخل شرائح الغرفة المكونة من 8 آبار ، أضف وسط الخلايا الدبقية الصغيرة المعالج بالجلوكان β (الخطوة 2.2.2) بتركيز حجم نهائي يبلغ 25٪ لمدة 72 ساعة (الحجم الإجمالي: 250 ميكرولتر / بئر).
- قم بإزالة الوسط بعد حضانة 72 ساعة وتخلص منه.
- اغسل الخلايا بمحلول ملحي عازل للفوسفات (PBS ؛ درجة الحموضة 7.4 ، 0.1 م) ثلاث مرات لمدة 5 دقائق.
- ثبت الخلايا بإضافة 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: اعتمادا على الأجسام المضادة المختلفة التي يمكن استخدامها للتألق المناعي ، قد تختلف طرق التثبيت عن 4٪ PFA النموذجية. قد تكون المثبتات التي تحتوي على الكحول أكثر كفاءة في الحفاظ على بعض الحواتم.
- دراسة التألق المناعي
- اغسل العينات باستخدام برنامج تلفزيوني باستخدام تريتون X (PBST ؛ 0.01٪) لمدة 10 دقائق ثلاث مرات.
- قم بإزالة PBST وإضافة المخزن المؤقت لألبومين مصل الأبقار (BSA) الذي يحجب 10٪ في PBST (الجدول 1) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة المخزن المؤقت المانع وأضف 200 ميكرولتر لكل بئر من PBS يحتوي على خليط الأجسام المضادة الأولية (1: 500 فأر Ki-67 جسم مضاد أحادي النسيلة و 1: 500 جسم مضاد كاسباس -3 مشقوق أرنب ؛ انظر جدول المواد). احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- بعد 24 ساعة من الحضانة عند 4 درجات مئوية ، اترك العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- اغسل الآبار ثلاث مرات لمدة 10 دقائق باستخدام PBS على شاكر (سرعة منخفضة).
- قم بإزالة PBS واستبدله ب 200 ميكرولتر لكل بئر من PBS يحتوي على خليط من الأجسام المضادة الثانوية (1: 200 حمار مضاد للفئران IgG (H + L) جسم مضاد ثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 488 و 1: 200 حمار مضاد للأرانب IgG (H + L) جسم مضاد ثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 647 ؛ انظر جدول المواد) لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- اغسل العينات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق على شاكر متعدد الأغراض.
- قم بإزالة PBS وأضف 200 ميكرولتر لكل بئر من 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) المخفف في PBS (1: 5,000) لمدة دقيقة واحدة.
- قم بإزالة DAPI (انظر جدول المواد) واغسل الخلايا لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
- قم بإزالة إطار البئر وإضافة 50 ميكرولتر من PBS: الجلسرين (1: 1) على كل بئر وقم بتغطيته بغطاء غطاء.
- ختم الشرائح مع طلاء الأظافر.
- التقط صورا بمعدل 20 ضعفا باستخدام نظام مجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد).
3. القياس الكمي وتحليل تكاثر الخلايا السرطانية وموت الخلايا المبرمج
ملاحظة: من أجل قياس التأثير المحتمل لمختلف β-glucans على تكاثر الخلايا السرطانية وموت الخلايا المبرمج ، تم استخدام نص داخلي في برنامج ImageJ لتحديد عدد وحدات البكسل الموجبة ل Ki67 (الانتشار) و cCasp3 (موت الخلايا المبرمج)13.
- افتح ImageJ. انقر فوق الزر "المكونات الإضافية ". انقر فوق Coloc2 ، وهو مكون إضافي تم تثبيته مسبقا في مجلد المكون الإضافي ، وأخيرا حدد الصورة لتحليلها11.
ملاحظة: كان هذا المكون الإضافي متاحا بعد الاتصال السابق بالدكتور فاسيليكي إيكونوموبولوس (veconom@uwo.ca). بدلا من البرنامج النصي ، يحتوي كل من برنامج ImageJ و Fiji على أدوات مختلفة لتحليل colocalization (انظر جدول المواد) ، مع خصائص مماثلة. - قم بتعيين العتبات وفقا لشروط التحكم (غير المعالجة ، DMEM فقط). انقر فوق الزر "موافق ".
ملاحظة: لتجنب التناقضات في الخلفية والشدة ، يجب التقاط جميع الصور في نفس الظروف. على نحو مفضل ، يجب إجراء جلسات التصوير في نفس اليوم ، ومعلمات المجهر دون تغيير عبر الصور. - تأكد من أن الصور الناتجة من البيكسلات المترجمة ونافذة ملخص توفر النسبة المئوية أو العدد الأولي للبيكسلات فوق العتبة تنبثق. تطبيع النتائج فيما يتعلق بظروف التحكم (غير المعالجة).
ملاحظة: يتم إعطاء جميع البيانات كمتوسط ± SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برامج الرسوم البيانية والتحليل (انظر جدول المواد). تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار المقارنة المتعددة ل Tukey. يتم تمثيل الأخطاء كخطأ معياري للمتوسط (s.e.m.) (* p < 0.05 ، ** p < 0.01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تنقية ناجحة من β الجلوكان
يتم تلخيص كتلة MP و SMPs و SβGs التي تم الحصول عليها من الأجسام المثمرة ل P. ostreatus و P. djamor و G. lucidum و H. erinaceus بعد عملية الاستخراج والتنقية في الجدول 1. يوضح الجدول 2 التركيب الأساسي (إجمالي الكربوهيدرات ، β-glucans ، والبروتين) من MP و SMPs و SβGs التي تم الحصول عليها من الفطريات. توضح هذه النتائج كيف سمح البروتوكول باسترجاع كمية كبيرة من محتوى البروتين في SMPs. ومع ذلك ، فإن العلاج الأنزيمي باستخدام α-amylase / glucoamylase والبروتياز قلل من كمية البروتين وزاد من تركيز β-glucan.
لم تظهر أطياف الأشعة فوق البنفسجية لمختلف SβGs أي قمم امتصاص للأشعة فوق البنفسجية عند 260 و 280 نانومتر (الشكل 2A) ، مما يشير إلى أن SβGs تفتقر إلى الأحماض النووية (260 نانومتر) والبروتينات (280 نانومتر). علاوة على ذلك ، تم اختبار تجانس SβGs بعد الكيمياء الطيفية للامتصاص المرئي للأشعة فوق البنفسجية (SEC). أظهرت الكروماتوجرام (الشكل 3) تجانسا جيدا ، مع ذروة رئيسية حادة ومفردة عند 8.20 و 10.5 و 10,9 و 11.3 دقيقة ل H. erinaceus و G. lucidum و P. ostreatus و P. djamor ، على التوالي. تشير هذه البيانات إلى أن الكسر يتوافق مع البوليمرات المتجانسة. علاوة على ذلك ، تم حساب متوسط الوزن Mw على أنه حوالي 120.8 و 92.8 و 80.7 و 75.9 كيلو دالتون ل H. erinaceus و G. lucidum و P. ostreatus و P. djamor ، على التوالي ، وفقا لمعادلة منحنى المعايرة (y = -0.0655x + 2.6194; ص2 = 0.9951).
قامت أطياف FTIR بقياس الاهتزازات الجزيئية التي تتوافق مع روابط السكاريد التساهمية (الشكل 4). أظهرت الأطياف مجموعة هيدروكسيل واسعة ومكثفة عند حوالي 3,435 سم -1. كما أظهرت قمة تمدد C-H ضعيفة عند حوالي 2,922 سم -1 ، المقابلة للسكريات14. علاوة على ذلك ، يمكن تعيين الامتصاص عند حوالي 1641 سم -1 إلى الأميد I15 ، المتعلق باهتزازات الاستطالة لمجموعات C = O و CN. قد تكون الإشارة عند حوالي 1,154 cm-1 بسبب التمدد غير المتماثل C-O-C للارتباط الجليكوسيدي16. أخيرا ، أشار النطاق الذي يبلغ طوله حوالي 1072 سم -1 إلى تمدد C-O ل β-glucans16. قد يكون الامتصاص الضعيف بالقرب من 893 سم -1 بسبب الاهتزاز الانكساري غير المتماثل ل β-pyranose ، مما يدل على التكوين β لوحدات السكر17. بشكل عام ، تم العثور على SβGs تتكون أساسا من الكربوهيدرات المترافقة مع الحد الأدنى من البروتين.
تمت دراسة ملف تعريف السكريات الأحادية ل SβGs بواسطة HPTLC و GC-MS. تم تأكيد وجود كمية كبيرة من D-glucose مع كميات أقل من D-galactose و D-mannose وأثر D-xylose و D-rhamnose و D-fucose و L-arabinose. يلخص الجدول 3 النتائج التي تم الحصول عليها ل SβGs من H. erinaceus و G. lucidum و P. ostreatus و P. djamor.
وسط مكيف للخلايا الدبقية الصغيرة ، يتم تنشيطه مسبقا باستخدام β جلوكان ، موت الخلايا المبرمج المستحث في الخلايا السرطانية
بمجرد عزل β-glucans من الفطر المختار بنجاح وتوصيفه بالكامل ، تمت إضافته إلى ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة (BV2). في 72 ساعة بعد إضافة وسط مكيف الخلايا الدبقية الصغيرة إلى خلايا GL261 (الشكل 5) ، تم قياس التعبير عن علامتين رئيسيتين للانتشار (Ki67) وموت الخلايا المبرمج (الكاسباز المشقوق 3 [cCasp3]) عن طريق التألق المناعي. باستخدام برنامج نصي داخلي في برنامج ImageJ ، تم تحديد عدد وحدات البكسل الموجبة لكل قناة فلورية ، وبالتالي تم تحليل الطريقة التي قد يؤثر بها التأثير المحتمل للتنشيط الدبقي الصغير الناجم عن β-glucan على سلوك الخلايا السرطانية. باستخدام عينات التحكم كعتبة لشدة كل فلوروفور ، قدم البرنامج النصي عدد وحدات البكسل ، وبالتالي أشار إلى التعبير لكل علامة بعد الظروف التجريبية المختلفة (الشكل 6).
ومن المثير للاهتمام ، أن GL261 لم يعاني من أي فرق كبير فيما يتعلق بانتشار الورم بمجرد تعرضه للوسائط المختلفة المشروطة بالخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 7). ومع ذلك ، أظهر P. djamor (B) و H. erinaceus (C) تحريضا قويا (حوالي ستة أضعاف وتسعة أضعاف ، على التوالي) من cCasp3.
الشكل 1: بروتوكول العزل. رسم تخطيطي للبروتوكول لعزل وتنقية إعداد SβG من P. streatus و P. djamor و H. erinaceus و G. lucidum. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: أطياف الأشعة فوق البنفسجية للجلوكان β. أطياف الأشعة فوق البنفسجية في منطقة 200-400 نانومتر من (A) P. ostreatus ، (B) G. lucidum ، (C) P. djamor ، و (D) H. erinaceus. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الكروماتوجرام باستثناء الحجم. الكروماتوجرام استبعاد الحجم ل (A) P. ostreatus ، (B) G. lucidum ، (C) P. djamor ، و (D) H. erinaceus. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أطياف FTIR. أطياف الأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FTIR) ل (A) P. ostreatus و (B) G. lucidum و (C) P. djamor و (D) H. erinaceus. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: رسم تخطيطي لمقايسات التحفيز المشترك. مقايسة التحفيز المشترك حيث تم طلاء خلايا الخلايا الدبقية الصغيرة للفأر (BV2) لمدة 72 ساعة ب β جلوكان. بعد حفظه وتصفيته بالتبريد ، تم جمع المادة الطافية ونقلها إلى مزرعة خلايا GL261 (25٪) لمدة 72 ساعة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صور الانتشار وموت الخلايا المبرمج. تظهر صور التألق المناعي ترابطا ثلاثيا ل GL261 مع DAPI (أزرق) و Ki67 (أخضر) و cCasp3 (أحمر). سمح البرنامج النصي "Prob Coloc" (الصور السفلية) بتحديد عدد وحدات البكسل الموجبة من كل علامة والتوطين المشترك فيما بينها. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: القياس الكمي لمعدلات الانتشار وموت الخلايا المبرمج. القيم الطبيعية فيما يتعلق بظروف التحكم (DMEM) لتعبير Ki67 (يسار) و cCasp3 (يمين) في خلايا GL261 بعد عرض الوسط المكيف بالخلايا الدبقية الصغيرة. (أ) بلوروتوس أوستريتوس، (ب) بلوروتوس جامور، (ج) هيريسيوم إريناسيوس ذ، د: غانوديرما لوسيدوم. يتم تمثيل الأخطاء ك s.e.m. (* p < 0.05 ، ** p < 0.01). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| النائب (ز) | SMPs (ز) | سميكروغرام (ز) | |
| ب. أوستريتوس | 201.3 ± 2.2 | 14.4 ± 0.9 (7.1٪) | 5.3 ± 0.2 (2.6٪) |
| ب. جامور | 200.8 ± 1.9 | 13.5 ± 0.6 (6.7٪) | 4.9 ± 0.3 (2.4٪) |
| غ. لوسيدوم | 201.8 ± 1.6 | 14.7 ± 1.2 (7.3٪) | 5.5 ± 0.2 (2.7٪) |
| ه. إريناسيوس | 204.2 ± 1.2 | 15.4 ± 0.8 (7.5٪) | 5.7 ± 0.2 (2.8٪) |
الجدول 1: جدول محتوى الجلوكان. توازن الكتلة للحصول على MP و SMPs و SβGs من الأجسام المثمرة ل P. ostreatus و P. djamor و G. lucidum و H. erinaceus.
| النائب | SMPs | SβGs | ||
| CHر (٪) | 67.3 ± 1.9 | 53.8 ± 2.3 | 90.1 ± 1.2 | |
| ب. أوستريتوس | β-جلوكان (٪) | 22.7 ± 1.4 | 31.3 ± 2.4 | 89.4 ± 2.3 |
| البروتين (٪) | 21.5±0.9 | 19.6 ± 0.8* | 0.4 ± 0.1* | |
| CHر (٪) | 68.3 ± 2.1 | 61.4 ± 3.1 | 93.4 ± 1.1 | |
| ب. جامور | β-جلوكان (٪) | 24.3 ± 2.8 | 30.8 ± 3.5 | 91.3 ± 3.4 |
| البروتين (٪) | 19.9 ± 1.0 | 22.3 ± 1.1* | 0.9 ± 0.2* | |
| غ. لوسيدوم | CHر (٪) | 66.4 ± 1.8 | 56.8 ± 2.9 | 93.7 ± 0.9 |
| β-جلوكان (٪) | 22.5 ± 1.9 | 24.9 ± 3.1 | 92.0 ± 2.6 | |
| البروتين (٪) | 18.9 ± 0.8 | 21.4 ± 0.6* | 1.5 ± 0.4* | |
| ه. إريناسيوس | CHر (٪) | 67.4 ± 1.2 | 58.9 ± 1.9 | 93.8 ± 1.4 |
| β-جلوكان (٪) | 23.9 ± 1.6 | 35.9 ± 2.1 | 91.8 ± 2.8 | |
| البروتين (٪) | 17.6 ± 1.3 | 22.7 ± 1.8* | 1.3 ± 0.2* |
الجدول 2: إجمالي الكربوهيدرات. الوزن الجاف (جم) محتوى الكربوهيدرات الكلية (CHt) ، β-glucan ، وبروتين MP و SMPs و SβGs. محتوى البروتين (MP) محدد كميا بطريقة Kjeldah12. (* ، البروتينات المحددة كميا بطريقة لوري9).
| D-Gluc (٪) | دي مان (٪) | D-Gala (٪) | د-فوكو (٪) | د-زيلو (٪) | د-رهام (٪) | L-عرب (٪) | |
| ه. إريناسيوس | 91.6 ± 0.6 | 3.8 ± 0.1 | 2.1 ± 0.2 | 0.5 ± 0.2 | 0.8 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 | بدون تاريخ |
| غ. لوسيدوم | 94.3 ± 0.8 | 2.6 ± 0.2 | 1.9 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 | 0.9 ± 0.2 | بدون تاريخ | 0.4 ± 0.1 |
| ب. أوستريتوس | 93.8 ± 0.5 | 4.4 ± 0.1 | 0.8 ± 0.1 | 0.4 ± 0.1 | بدون تاريخ | بدون تاريخ | بدون تاريخ |
| ب. جامور | 95.2 ± 0.7 | 1.7 ± 0.2 | 1.1 ± 0.1 | 0.3 ± 0.1 | بدون تاريخ | بدون تاريخ | بدون تاريخ |
الجدول 3: توصيف السكريات الأحادية. ملف تعريف السكريات الأحادية ل SβGs من P. ostreatus و P. djamor و G. lucidum و H. erinaceus (بدون تاريخ ، كانت بعض السكريات الأحادية غير قابلة للكشف).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا العمل استخدام التقنيات الراسخة لعزل محتوى SβGs وتنقيته وتوصيف محتوى SβGs بنجاح من أربعة فطريات مختلفة. أظهرت النتائج كيف أنه بعد استخراج الماء الساخن من SMPs ، التي تم الحصول عليها من P. ostreatus و P. djamor و G. lucidum و H. erinaceus ، تليها المعالجة المائية باستخدام α-amylase و glucosidase و protease ، تم تقليل محتوى α-glucan والبروتين ، مما أدى إلى إثراء كمية SβGs النقية بشكل كبير.
على الرغم من ذلك ، لاحظنا أن معظم β-glucans الفطرية كانت غير قابلة للذوبان في الماء أثناء عملية التنقية. كان الاهتمام الرئيسي للدراسة هو SβGs ، نظرا لخصائصها الطبية / الصيدلانية10,18. علاوة على ذلك ، بفضل المعالجة المائية ، وترسيب الإيثانول ، وغسيل الكلى ، تمت إزالة الكربوهيدرات منخفضة الوزن الجزيئي القابلة للذوبان ، والببتيدات ، وقليل الببتيدات ، والأحماض الأمينية بنجاح من SMPs ، مما يدل على كفاءة مماثلة للأعمال السابقة الأخرى باستخدام نوع مختلف من الفطر ولكن مع عمليات مماثلة19,20.
لاختبار نقاء SβGs ، تم فحص أطياف الأشعة فوق البنفسجية لمختلف SβGs بواسطة قياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية ، ومسح العينات في منطقة 200-400 نانومتر. لم يلاحظ أي قمم امتصاص للأشعة فوق البنفسجية عند 260 و 280 نانومتر ، مما يشير إلى أن SβGs لم يكن يحتوي على أحماض نووية (260 نانومتر) ولا بروتينات (280 نانومتر) ، مما يدل مرة أخرى على أن β-glucans تشكل بشكل أساسي SβGs. على الرغم من أن أطياف الأشعة فوق البنفسجية في منطقة 200-400 نانومتر أظهرت عدم وجود أي اختيار محدد / حاد عند 280 نانومتر ، إلا أنه لا يزال من الممكن ملاحظة قمة صغيرة. يمكن تفسير ذلك من خلال وجود كمية صغيرة من البروتينات المرتبطة بالسكريات ، بما يتفق مع النتائج الموضحة في الجدول 2. ومع ذلك ، من المثير للاهتمام أن نعتبر أن مثل هذه الكمية الضئيلة من السكريات يمكن تفسيرها أيضا من خلال تأخر الوصول إلى البروتينات المتبقية ، والتي قد تكون محمية بواسطة الجلوكان أو بتأثيرات ستيريك تمنع التدهور الكامل للبروتينات المرتبطة بالجلوكان. الأهم من ذلك ، تم اختبار تجانس SβGs بشكل أكبر من قبل SEC ، وهي تقنية تحليلية قوية تستخدم لتنقية الجزيئات الذائبة حسب الحجم ، والتي أكدت نتائج البروتوكول.
بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام أطياف FTIR لقياس الاهتزازات الجزيئية المقابلة لروابط السكاريد التساهمية. كما هو موضح سابقا ، تم الحصول على أطياف مماثلة لجميع الفطريات الأربعة. أظهرت ميزة الأطياف وجود السكريات14 والأميد I 15 و β-glucans16. اقترح الامتصاص الضعيف بالقرب من 893 سم -1 التكوين β لوحدات السكر17. بشكل عام ، تم العثور على SβGs ليتم تشكيلها بشكل رئيسي من الكربوهيدرات المترافقة مع الحد الأدنى من البروتين. فيما يتعلق بالاهتمام باستخدام SβGs كجزيئات مناعية ، تجدر الإشارة إلى أن مجمعات بروتين السكاريد غالبا ما يتم ملاحظتها لفوائدها المناعية21.
أخيرا ، تمت دراسة ملف تعريف السكريات الأحادية ل SβGs بواسطة HPTLC و GC-MS. إن وجود كمية كبيرة من الجلوكوز D مع كميات أقل من D-galactose و D-mannose وآثار D-xylose و D-rhamnose و D-fucose يعني بدقة أن المكون السائد في SβGs هو β-glucan. ومع ذلك ، من المهم توضيح أن نظام التنقية لدينا ينتج عن تحسين الإجراءات الكلاسيكية المختلفة. نحن نعمل حاليا على تحسين عدة خطوات ، تركز بشكل أساسي على تقنيات الكروماتوغرافيا (استبعاد الحجم وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني).
فيما يتعلق بالهدف الرئيسي من هذا العمل ، وهو اختبار تأثير β-glucans على الخلايا المناعية ، بمجرد تنقية الأنواع الأربعة المختلفة من β-glucans بنجاح ، تم اختبار آثارها المحتملة على تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. تم استخدام التألق المناعي ضد علامتين قياسيتين ذهبيتين للانتشار وموت الخلايا المبرمج22,23.
على الرغم من عدم وجود اختلافات إحصائية في معدلات انتشار الورم ، تمكنت P. ostreatus (A) و H. erinaceus (C) من إسقاط تعبير Ki67 بنسبة تصل إلى 50٪. من المحتمل أن يكون عدم الأهمية بسبب التباين الكبير في الدراسة المتعلقة ب G. lucidum. علاوة على ذلك ، فإن تحريض موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية هو نهج علاجي مثير للاهتمام إلى حد ما ، وأظهر P. djamor (B) و H. erinaceus (C) تحريضا كبيرا لمستويات cCasp3 ، مما يشير إلى تنشيط برنامج موت الخلايا. كل هذه النتائج تتوافق مع الدراسات السابقة التي أظهرت التأثير المضاد للورم لهذه الفطريات في أنواع أخرى من الأورام24,25. تم إجراء التجارب في نسختين ، مع الحفاظ على نفس الظروف وبقيادة نفس المحققين. يدعم التحليل القائم على البرامج لنتائج دراسات التألق المناعي نهجا غير متحيز ويعزز الوصول المحتمل لهذه الدراسة.
بشكل عام ، تواجه هذه الدراسات تحديا رئيسيا فيما يتعلق باستخدام β-glucans ، وهو نقاء المركبات. من الضروري اتباع أعلى المعايير من أجل التأكد من أن التأثيرات الملحوظة ، بعد استخدامها في الدراسات المناعية ، يتم استفزازها حصريا بواسطة الكربوهيدرات ، وليس بسبب البروتينات أو الهياكل الأخرى التي قد تظل مرتبطة بها إذا لم يتم إجراء التنقية بشكل كاف. إحدى الخطوات الإضافية التي يمكن أخذها في الاعتبار في الدراسات المستقبلية هي استخدام تقنيات الكروماتوغرافيا (على سبيل المثال ، التبادل الأيوني أو استبعاد الحجم).
الاستنتاج العام بعد الدراسات يضع H. erinaceus كمرشح رئيسي كخيار علاجي مناعي محتمل لعلاج الورم الأرومي الدبقي ، نظرا لقدرته على إسقاط انتشار الورم (~ 50٪) والحث على تنشيط قوي لبرنامج موت الخلايا في خلايا الورم الأرومي الدبقي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا توجد مصالح متنافسة للإعلان.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتورة فاسيليكي إيكونوموبولوس على نصها الداخلي لقياس إشارة الاستيفاء في ImageJ. نود أيضا أن نشكر CITIUS (جامعة إشبيلية) وجميع موظفيها على دعمهم خلال المظاهرة. تم دعم هذا العمل من قبل FEDER I + D + i-USE الإسبانية ، US-1264152 من جامعة إشبيلية ، ووزارة العلوم ، Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).
- Ma, J., Chen, C. C., Li, M.
- Sevenich, L. Turning "cold" into "hot" tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers. Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).
- Niesel, K., et al. The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis. EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).
- McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses. Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).
- Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression. Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).
- Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. Journal of Hematology & Oncology. 2, 25 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Klaus, A., et al. Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune. Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).
- Soto, M. S., et al. STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction. Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).
- Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).
- Waterborg, J. H., Matthews, H. R. The Lowry method for protein quantitation. Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).
- Zhang, L., et al. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms. International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).
- Barbosa, J. S., et al. Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2. Food Chemistry. 330, 127173 (2020).
- Ma, Y. H., et al. Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).
- Nie, L., et al. Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro. Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).
- Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health. Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).
- Klaus, A., et al. The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).
- Kozarski, M., et al. Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification. Food Research International. 64, 53-64 (2014).
- Ayimbila, F., Keawsompong, S. Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus. 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).
- de Azambuja, E., et al. Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients. British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).
- Holubec, H., et al. Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).
- Borges, G. M., et al. Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180. Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).
- Sohretoglu, D., Huang, S. Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).
