Apresentamos aqui um protocolo de avaliação de um coração implantado heterotopicamente após preservação ex situ normotérmica no modelo de ratos.
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Artigo de método
Modelo de Transplante Cardíaco Heterotópico Perfundido Normothermic Ex-Situ em Rato
* These authors contributed equally
Neste artigo
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Resumo
Resumo
O transplante cardíaco é a terapia mais eficaz para a insuficiência cardíaca terminal. Apesar das melhorias nas abordagens terapêuticas e intervenções, o número de pacientes com insuficiência cardíaca à espera de transplante ainda está aumentando. A técnica de preservação ex situ normotérmica foi estabelecida como um método comparável à técnica convencional de armazenamento estático refrigerado. A principal vantagem dessa técnica é que os corações doados podem ser preservados por até 12 h em uma condição fisiológica. Além disso, essa técnica permite a ressuscitação dos corações doados após a morte circulatória e aplica as intervenções farmacológicas necessárias para melhorar a função do doador após o implante. Numerosos modelos animais foram estabelecidos para melhorar as técnicas normotérmicas de preservação ex situ e eliminar as complicações relacionadas à preservação. Embora os modelos animais de grande porte sejam fáceis de manusear em comparação com os modelos de animais pequenos, é caro e desafiador. Apresentamos um modelo de preservação do coração de doador ex situ normotérmico seguido de transplante abdominal heterotópico. Este modelo é relativamente barato e pode ser realizado por um único experimentador.
Introdução
O transplante cardíaco continua sendo a única terapia viável para insuficiência cardíaca refratária 1,2,3,4. Apesar do aumento constante do número de pacientes com necessidade de transplante cardíaco, não tem sido observado aumento proporcional na disponibilidade de órgãos doados5. Para abordar essa questão, novas abordagens para a preservação do coração dos doadores têm sido desenvolvidas com o objetivo de melhorar os desafios e aumentar a disponibilidade de doadores 6,7,8,9.
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Protocolo
O comitê de ética do Centro de Pesquisa em Animais de Laboratório do Hospital Universitário Nacional de Chonnam (aprovação nº. CNU IACUC - H - 2022-36) aprovou todos os experimentos com animais. Ratos machos da raça Sprague-Dawley (350-450 g), utilizados neste estudo, receberam cuidados de acordo com as orientações para os cuidados e uso dos animais de laboratório. Os ratos foram alojados em salas com temperatura controlada, com ciclo claro-escuro de 12 h, com ração padrão e água disponíveis.
1. Preparo
NOTA: Um único experimentador pode conduzir todos os procedimentos experimentais.
- Mo....
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Resultados
A Figura 1 ilustra o desenho experimental utilizado em modelo animal de pequeno porte. A Figura 2 mostra o aparelho de perfusão Langendorff modificado, que inclui um oxigenador animal de pequeno porte. A ordem das anastomoses para implante abdominal heterotópico é apresentada na Figura 3.
A Figura 4 mostra os parâmetros utilizados para avaliar a viabilidade do coração durante.......
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Discussão
Nosso foco no estabelecimento desse modelo foi replicar o transplante cardíaco humano normotérmico. Os modelos não ejetantes são a técnica comumente preferida para preservar o coração doador em ambiente ex situ16. Embora os modelos de ejeção ofereçam muitas vantagens na avaliação da função cardíaca durante a perfusão ex situ 17, eles não são adequados para modelos de transplante heterotópico. No transplante heterotópico, o coração do doador implantado prec.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa B2021-0991 do Chonnam National University Hospital Biomedical Research Institute e NRF-2020R1F1A1073921 da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema de evacuação ativa AES | Smiths medical | PC-6769-51A | Utilize CO2 e excesso de isoflurano |
| Máquina de anestesia | Smiths medical | PC-8801-01A | Mistura isoflurano e oxiegênio e entrega ao monitor de |
| paciente animal B20 | Sistemas médicos GE | B20 | para observar a pressão e temperatura aórtica média |
| de monitoramento homeotérmico | Aparelho Harvard | 55-7020 | Para monitorar e manter a temperatura do animal |
| Micro-1 Oxigenador de rato | Dongguan Kewei instrumentos médicos | Micro-MO | Para troca gasosa no circuito langendorff |
| Conjunto de introdutor de micropuntura | COOK medical | G48007 | para fornecer solução cardioplégica ao arco através da aorta abdominal |
| Microscópio | Amscope | MU1403 | Para zoom cirúrgico campo (Receptor) |
| Lupa cirúrgica | SurgiTel | L2S09 | Para zoom campo cirúrgico (Doador) |
| Bomba de seringa | AMP all | SP-8800 | Para fornecer solução cardioplégica |
| Sensor de fluxo transônico Sensor de fluxo transônico | ME3PXL-M5 | Sensor de fluxo do circuito de perfusão | |
| Módulo de fluxo de tubulação transônica | Sistema de | aquisição de fluxo | transônico TS410 |
| Watson - Bombas Marlow Aparelho | Harvard 010.6131.DAO | Bomba peristáltica usada para recircular perfusato | |
| WBC-1510A | JEIO TECH | Banho de aquecimento | |
| Ratos Sprague-Dawley | Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Coréia | ||
| Medicamentos | |||
| BioHAnce Gel Eye Drops | SENTRIX Cuidados com animais | pomadas molhadas para os olhos | |
| Cefazolina | JW farmacêutica | Para profilaxe | |
| Custodiol | DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH | Para colheita de coração | |
| Diclofenaco | Myungmoon Pharm. Co. Ltd | Para controle da dor | |
| Heparina | JW farmacêutica | Anticoagulante | |
| Insulina | JW farmacêutica | hormon terapia | |
| JW farmacêutica | Para terapia de hidratação |
Referências
- Langmuur, S. J. J., et al. Normothermic ex-situ heart perfusion with the organ care system for cardiac transplantation: A meta-analysis. Transplantation. 106 (9), 1745-1753 (2022).
- Ardehali, A., et al.
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 8/28/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.
Section 4 of the Protocol was updated from:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
to:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
- After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C.
NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments. - Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.
