Medindo o diâmetro do vaso retiniano a partir de imagens de angiografia fluorescente de camundongo

Possivelmente, o leito vascular mais pesquisado no corpo é a vasculatura retiniana. Com sofisticação técnica cada vez melhor, a vasculatura retiniana é facilmente fotografada em pacientes vivos e usada em muitos campos de pesquisa¹. Além disso, a vasculatura da retina do camundongo durante o desenvolvimento provou ser um sistema modelo muito eficaz para pesquisas sobre a biologia fundamental do crescimento vascular. O objetivo principal da vasculatura retiniana é fornecer suporte metabólico à porção interna da retina por meio de uma malha capilar laminar que permeia o tecido neural². No entanto, a condição da retina e, conseqüentemente, qualquer disfunção ou atrofia, pode ter efeitos significativos tanto nas bifurcações da vasculatura retiniana quanto no diâmetro das artérias, demonstrando uma interação entre as células da retina e a vasculatura ^3,4. Sabe-se que inúmeras doenças oculares, incluindo retinopatia da prematuridade (ROP), retinopatia diabética (RD), degeneração macular relacionada à idade (DMRI), glaucoma e neovascularização da córnea, podem resultar em angiogênese ocular anormal⁵. No caso da vasculatura retiniana, os modelos de camundongos com degeneração retiniana geralmente exibem alterações comparáveis às observadas nas doenças vasculares humanas ^6,7. A família de supergenes Myc de fatores de transcrição fundamentais hélice-alça-hélice-zíper inclui o gene do fator de transcrição associado à microftalmia (Mitf) expresso no epitélio pigmentar da retina (EPR) ^{8 , 9 , 10} .

Numerosos órgãos, incluindo olho, ouvido, sistema imunológico, sistema nervoso central, rim, osso e pele, demonstraram ser regulados pelo Mitf 9,11,12,13. Descobrimos que a estrutura e a função do EPR são afetadas em camundongos portadores de várias mutações no gene Mitf, resultando em alguns casos de degeneração da retina e, em última análise, perda de visão¹⁰. Recentemente, foi demonstrado que o número de vasos e o diâmetro dos vasos diferem significativamente entre camundongos mutantes Mitf e do tipo selvagem¹⁴. Pesquisadores e médicos agora podem quantificar com precisão a vasculatura da retina in vivo devido aos desenvolvimentos da imagem da retina. Desde 1800, pesquisadores e médicos têm aproveitado o benefício de visualizar a vasculatura retiniana, e a angiografia fluoresceínica (AF) mostrou tanto o fluxo sanguíneo retiniano quanto a degradação da barreira hemato-retiniana¹⁵.

Este artigo demonstra como analisar o diâmetro do vaso retiniano a partir de imagens de FA de camundongos com um código escrito sob medida no software MATLAB.

Todos os experimentos foram aprovados pela Autoridade Alimentar e Veterinária da Islândia (licença MAST nº 2108002). Todos os estudos em animais foram conduzidos de acordo com a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual. Camundongos C57BL/6J machos e fêmeas e Mitf^mi-vga9/+ foram utilizados neste estudo. Camundongos C57BL/6J (n = 7) foram usados como controle. Os tipos selvagens foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais), mas todos os camundongos mutantes (n = 7) foram criados e criados em instalações para animais no Centro Biomédico da Universidade da Islândia. No presente estudo, foram utilizados animais com 3 meses de idade; no entanto, o protocolo se aplica mesmo a animais de 1 mês ou mais.

1. Preparação experimental

1. Prepare a mistura anestésica. Tome uma ampola de uma solução estoque de cetamina de 2 mL (25 mg / mL) e 250 μL de solução estoque de xilazina (2%) para preparar uma solução de trabalho de mistura de cetamina / xilazina (25 mg / mL de cetamina e 20 mg / mL de xilazina) (ver Tabela de Materiais).
2. Anestesie o camundongo com uma injeção intraperitoneal da mistura de cetamina / xilazina, com um volume de fluido quatro vezes o peso corporal do camundongo; por exemplo, um camundongo com 20 g de peso precisa de 35 μL de solução de trabalho de xilazina / cetamina para obter uma dose de trabalho de xilazina (4 mg / kg de peso corporal) e cetamina (40 mg / kg de peso corporal).
3. Dilate as pupilas com um colírio de cloridrato de fenilefrina a 10% e tropicamida a 1% imediatamente após a anestesia.
4. Espere até que o animal esteja totalmente anestesiado e suas pupilas estejam amplamente dilatadas.
5. Prepare a solução salina de fluoresceína. Adicione 9 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS; 1x) a 1 mL de solução de fluoresceína (concentração estoque de 100 mg / mL) (consulte a Tabela de Materiais). A solução de trabalho de concentração final é de 10 mg/mL.

2. Imagem in vivo da vasculatura retiniana usando um sistema de imagem de retina de roedores

1. Administrar a solução de trabalho de fluoresceína por via intraperitoneal (5 μL/g de peso corporal) ao animal anestesiado.
2. Aplique uma gota de gel de metilcelulose a 2% na superfície da córnea e, em seguida, coloque o animal no estágio de posicionamento do sistema de imagem (consulte a Tabela de Materiais).
3. Posicione a lente da câmera de fundo de olho de imagem da retina para tocar a córnea do mouse direta e suavemente. Para colocar a cabeça do nervo óptico no meio do campo visual, ajuste levemente o alinhamento.
4. Mude para o canal fluorescente verde na câmera de fundo de olho.
5. Concentre-se nos vasos da retina para tirar imagens.
6. Para encontrar o ponto de tempo ideal, tire várias fotos em 1, 3, 5 e 10 min (mas não mais do que 10 min) após a injeção de fluoresceína.
   NOTA: O tratamento com ácido sulfúrico deve ser concluído em 10 minutos, pois após esse tempo a fluoresceína pode se tornar muito difusa e os vasos se tornarem indetectáveis.
7. Após a conclusão da imagem, enquanto o camundongo ainda está anestesiado, eutanasia-o por luxação cervical.

3. Análise do diâmetro do vaso retiniano

1. Abra o programa MATLAB (consulte Tabela de Materiais).
2. Baixe e salve o código "fundusDiameter.m" (consulte Arquivo de Codificação Suplementar 1, Arquivo de Codificação Suplementar 2 e Arquivo de Codificação Suplementar 3).
3. Abra a pasta onde o código foi salvo. Arraste o código e solte-o sobre a pasta atual no MATLAB.
4. Arraste e solte a imagem FFA (imagem de angiografia de fluorescência do fundo de olho) ou imagens que se deseja analisar na pasta atual no MATLAB.
5. Pressione a ferramenta Executar na barra de ferramentas do MATLAB.
6. Uma janela pop-up aparecerá. Escreva o nome do arquivo da imagem de interesse na caixa Digite o nome do arquivo e pressione OK.
   NOTA: Não altere ou modifique o restante dos parâmetros.
7. Selecione o centro do disco óptico e, em seguida, selecione a borda do disco óptico. O software agora calcula a intensidade dos pixels nas imagens do fundo do mouse em um círculo com um raio que é o dobro do disco óptico, no sentido horário a partir do centro do disco óptico (Figura 1).
8. Em seguida, certifique-se de que o software plote o diâmetro médio do vaso (em pixels) de cada vaso no fundo como uma função do número do vaso (Figura 2).
9. Em seguida, certifique-se de que o software transfira os dados de medição de cada embarcação para um documento Excel, onde a média, a mediana e o desvio padrão desses valores são calculados (Tabela 1 e Tabela 2).
10. Mova os valores da tabela de resultados para um programa de planilha selecionando todos os valores na tabela. Cole os valores na planilha.
11. Plote os gráficos e execute análises estatísticas usando os dados colados em um programa de planilha de sua escolha (consulte Tabela de Materiais).

A Figura 1 mostra o processo utilizado para analisar a vasculatura retiniana, que é aplicado às imagens FFA de camundongos de todos os camundongos testados. Um raio duas vezes maior que o disco óptico é usado para medir a intensidade dos pixels em uma direção circular no sentido horário a partir do centro do disco óptico. Ele marca pixels com um ponto inicial ou final quando se depara com pontos acima e abaixo de um limite especificado pelo usuário, respectivamente. Isso é repetido 30 vezes, cada vez indo um pouco mais longe do centro do disco óptico. As imagens FFA são tiradas 5 minutos após a injeção de fluoresceína (Figura 1A e Figura 1B). O software de análise calcula então a rota mais curta entre cada um dos 30 pontos finais relevantes e cada um dos pontos iniciais. O resultado desse processamento é uma figura com os pontos e as medidas representadas por uma linha branca entre eles; exemplos de tais imagens de um camundongo controle e mutante Mitf são mostrados na Figura 1A e na Figura 1B, respectivamente. No entanto, as setas pretas mostradas na Figura 1B são pequenos erros que podem ocorrer, mas o software não lê esses erros como vasos retinianos. Além disso, o programa calcula o diâmetro médio do vaso de cada vaso da retina em pixels com base nos 30 pontos finais determinados no vaso, começando do vaso central superior acima do disco óptico (como vaso 1) e depois no sentido horário ao redor do disco em ordem numérica. O software então apresenta o diâmetro médio do vaso em um gráfico em função do número do vaso; exemplos desses gráficos de um camundongo selvagem e mutante são exibidos na Figura 2A e na Figura 2B, respectivamente. Juntamente com os valores de medição para cada embarcação, ele também oferece um documento Excel com os cálculos de média, mediana e desvio padrão do diâmetro da embarcação em pixels. Essas tabelas são obtidas para todos os camundongos investigados neste estudo (Tabela 1 e Tabela 2) a partir do software; portanto, os valores não são copiados para outro programa. O valor "N" na Tabela 1 e na Tabela 2 corresponde ao número de pontos retirados de cada embarcação e calculados pelo programa. Quando esse valor é menor ou igual a 5, o software o lê como não aplicável (N/A) e, portanto, não corresponde a um vaso retiniano.

Figura 1: Imagens de angiografia fluoresceínica. As imagens de um camundongo controle (A) e mutante Mitfmi-vga9/+ (B) usadas neste estudo. Os pontos vermelhos correspondem ao centro e à borda do disco óptico. As linhas brancas nos vasos mostram onde as medições da distância mais curta entre os pontos são feitas. As setas pretas indicam possíveis erros no código. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: O diâmetro médio do vaso em função do número de vasos. Diâmetro médio dos vasos (em pixels ± desvio padrão [DP]) dos principais vasos da retina em uma imagem de fundo de olho de um camundongo mutante do tipo selvagem (A) e Mitfmi-vga9 / + (B). A abscissa em ambos os painéis indica o número de vasos de cada vaso, contando a partir do vaso central superior acima do disco óptico como o vaso número um e, em seguida, no sentido horário a partir desse vaso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Diâmetro médio dos vasos retinianos (em pixels) no fundo de um camundongo selvagem. Os valores na tabela são obtidos a partir do software de análise. Cada linha representa dados de um vaso, e a primeira linha é o vaso na parte central superior do fundo acima do disco óptico. Os vasos são então numerados no sentido horário a partir desse navio. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Diâmetro médio dos vasos retinianos (em pixels) no fundo de um camundongo mutante Mitfmi-vga9 / + . O mesmo procedimento é usado na Tabela 1. Os valores na tabela são obtidos a partir do software de análise. Cada linha representa dados de um vaso, e a primeira linha é o vaso na parte central superior do fundo acima do disco óptico. Os vasos são então numerados no sentido horário a partir desse navio. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo suplementar: código "fundusDiameter.m" para determinar o diâmetro do vaso retiniano. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores declaram que não existem interesses conflitantes.