O presente protocolo descreve como usar uma lesão mediada por FeCl3 para induzir trombose arterial e como coletar e preparar amostras de lesão arterial em vários estágios da trombose para análise por microscopia eletrônica.
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Artigo de método
Trombose Arterial Induzida por Cloreto Férrico e Coleta de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica 3D
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. A trombose aberrante é uma característica comum de condições sistêmicas, como diabetes e obesidade, e de doenças inflamatórias crônicas, como aterosclerose, câncer e doenças autoimunes. Na lesão vascular, geralmente o sistema de coagulação, as plaquetas e o endotélio atuam de forma orquestrada para evitar o sangramento, formando um coágulo no local da lesão. Anormalidades nesse processo levam a sangramento excessivo ou trombose descontrolada/atividade antitrombótica insuficiente, o que se traduz em oclusão do vaso e suas sequelas. O modelo de lesão carotídea induzida por FeCl3 é uma ferramenta valiosa para investigar como a trombose se inicia e progride in vivo. Esse modelo envolve dano endotelial/desnudamento e subsequente formação de coágulos no local lesado. Ele fornece um ensaio quantitativo altamente sensível para monitorar o dano vascular e a formação de coágulos em resposta a diferentes graus de dano vascular. Uma vez otimizada, esta técnica padrão pode ser usada para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à trombose, bem como as alterações ultraestruturais nas plaquetas em um trombo crescente. Este ensaio também é útil para estudar a eficácia de agentes antitrombóticos e antiplaquetários. Este artigo explica como iniciar e monitorar a trombose arterial induzida por FeCl3 e como coletar amostras para análise por microscopia eletrônica.
Introdução
A trombose é a formação de um coágulo sanguíneo que bloqueia parcial ou completamente um vaso sanguíneo, impedindo o fluxo natural do sangue. Isso leva a eventos cardiovasculares graves e fatais, como doença cardíaca isquêmica e acidentes vasculares cerebrais. As doenças cardiovasculares são a principal causa de morbidade e mortalidade, sendo responsáveis por uma em cada quatro mortes nomundo1,2,3. Embora a trombose se manifeste como um mau funcionamento do sistema vascular, pode ser resultado de uma infecção microbiana ou viral subjacente, distúrbio imunológico, malignidade ....
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Protocolo
Todos os experimentos aqui discutidos foram revisados e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade de Kentucky.
NOTA: Os instrumentos cirúrgicos estão listados na Figura 1 e na Tabela de Materiais. Foram utilizados camundongos C57BL/6J, com 8-10 semanas de idade, machos/fêmeas ou cepas geneticamente manipuladas (Knockout ou Knockin).
1. Lesão da artéria carótida induzida por FeCl3
- Indução da anestesia em camundongos
- Pese o mouse.
- Anestesiar o camundongo injetando 0,2 g/kg ....
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Resultados
Os dados são geralmente apresentados como tempo para a oclusão, ou tempo necessário para formar um trombo totalmente oclusivo. Esses dados podem ser plotados como uma curva de sobrevida de Kaplan-Meier (Figura 4A)19, um gráfico de pontos com barras mostrando o fluxo sanguíneo terminal no momento da cessação do fluxo sanguíneo ou do término de um experimento (Figura 4B), ou como um gráfico de linhas (Figura 4C).
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Discussão
A aplicação tópica de FeCl3 na vasculatura para induzir trombose é uma técnica amplamente utilizada e tem sido fundamental no estabelecimento de papéis para vários receptores plaquetários, vias de sinalização de ligantes e seus inibidores20,21,22,23. O mecanismo pelo qual a FeCl3 causa trombose é multifacetado; Anteriormente, o desnudamento endotelial era considerado causa.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse relacionados a este estudo.
Perfis ORCID: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos membros do Whiteheart Laboratory por sua cuidadosa análise deste manuscrito. O trabalho foi apoiado por subsídios do NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 e HL150818), e um Prêmio de Mérito do Departamento de Assuntos de Veteranos para S.W.W., R01 HL 155519 para B.S., e concessão do programa intramuros NIBIB para R.D.L.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,9% de solução salina | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl usado para fazer uma solução de solução salina a 0,9% |
| Seringa de 1 mL | Becton, Dickinson e Companhia | ||
| 190 Prova de Etanol | KOPTEC | V1101 | Usado para fazer uma solução de etanol a 70% para preparar o camundongo para a cirurgia |
| 2,2,2 Tribromoetanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| Sutura de Seda Trançada Preta de 25 Jardas (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| Agulha 26G x 3/8 | Becton, Dickinson e Companhia | 305110 | |
| 2-metil-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| Pipeta de transferência de 7,5 mL, graduada para 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Almofadas de Preparação de Álcool (70% Álcool Isopropílico) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Serviços de microscopia eletrônica | 10900 | |
| Placa de Cultura de Células 35mm X 10mm | Corning Incorporated | ||
| Balança Compacta | Ciência de Ward | 470314-390 | |
| Tesoura de Dissecação, 12,5 cm de comprimento | Instrumento de Precisão Mundial | 15922-G | |
| DMP-30 ativador | Serviços de microscopia eletrônica | 13600 | |
| Dodenil Succínico Anidrido / DDSA Serviços de | Microscopia Eletrônica | 13700 | |
| Sacos de cocô para cães/saco de descarte de carcaça de animal | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resina | Serviços de microscopia eletrônica | 14900 | |
| Álcool Etílico, anidro 200 provas | Serviços de microscopia eletrônica | 15055 | |
| Pinça de Curativo para Olhos, 4" Curvada Completa, Padrão, Pontas de 0.8mm de Largura | Integra Miltex | 18-784 | |
| Papel de Filtro | VWR | 28310-106 | |
| Tesoura Fina - Ferramentas de | Ciência Fina Afiadas e Sem Corte | 14028-10 | |
| Punções de Orelha com Alça de Dedo | Ferramentas de Belas Ciências | 24212-01 | |
| Esponjas de Gaze 2" x 2" - 12 Camadas | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldeído (solução a 10%)Serviços de | microscopia eletrônica | 16120 | |
| Integra Miltex Lâmina Cirúrgica de Aço Carbono #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Cloreto de Ferro (III) | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Cabo de Faca Miltex® Aço Inoxidável Extra Fino Tamanho 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| Ácido L-aspártico | Sigma Fisher | A93100 | |
| Ácido L-aspártico | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Nitrato de Chumbo | Fisher Scientific | Microscópio L-62 | |
| LEICA S8AP0 | LEICA Não está mais disponível | Não está mais disponível na empresa Suporte para | |
| Microscópio LEICA S8AP0 | LEICA | 10447255 | Não está mais disponível na empresa |
| Limpadores de lenços de papel leves | VWR | 82003-822 | |
| Pinça Micro Dissecante; 1x2 Dentes, Curva Completa; Largura da Ponta de 0,8 mm; Comprimento de 4" | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Tetróxido de Ósmio 4% solução aquosa | Serviços de microscopia eletrônica | 19150 | |
| Paraformaldeído (solução a 16%) | Serviços de microscopia eletrônica | 15710 | |
| Ferricianeto de potássio | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Óxido de propileno, reagente ACS | Serviços de microscopia eletrônica | Pipeta Clássica Rainin 20401 | |
| PR-10 Medidor de | Rainin | 17008649 | |
| Research | Sistemas Transônicos Inc. | T402B01481 | Modelo: T402 |
| Fita Invisível Mágica Escocesa, 3/4" x 1000", | Scotch Transparente | ||
| Almofada Aquecida para Pequenos Animais | K& H Fabricação Inc. | Modelo: HM10 | |
| Tampão de Cacodilato de Sódio 0.2M, pH7.4 | Serviços de Microscopia Eletrônica | 11623 | |
| Aplicadores Estéreis com Ponta de Algodão | Produtos Médicos Puritanos | 25-806 1WC | |
| Iluminador Steromaster | Fisher Scientific | 12-562-21 | Não está mais disponível na empresa |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Ferramentas de Belas Ciências | 11271-30 | |
| Tiocarbohidrazida (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Recargas de Ponta de Pipeta de Baixa Retenção Universal (0.1-10 µ L) | VWR | 76323-394 | |
| de acetato de uranila | 22400 | ||
| Veet Gel Creme Removedor de Pelos | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| Branco Antiestático Hexagonal Pesagem Barcos, Médio, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | Software S38975 | |
| WinDAQ/100 para Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Versão 3.38 | Disponível gratuitamente para download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
Referências
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al.
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Reimpressões e permissões
