A malária é transmitida através da inoculação do estágio de esporozoíto do Plasmodium por mosquitos infectados. O Plasmodium Transgênico nos permitiu compreender melhor a biologia da malária e contribuiu diretamente para os esforços de desenvolvimento de vacinas contra a malária. Aqui, descrevemos uma metodologia simplificada para gerar esporozoítos transgênicos de Plasmodium berghei .
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Artigo de método
Geração de Esporozoítos Geneticamente Modificados de Plasmodium berghei
Neste artigo
Resumo
Resumo
A malária é uma doença mortal causada pelo parasita Plasmodium e é transmitida através da picada de fêmeas de mosquitos Anopheles . O estágio de esporozoíto do Plasmodium depositado por mosquitos na pele de hospedeiros vertebrados passa por uma fase de desenvolvimento obrigatório no fígado antes de iniciar a malária clínica. Sabemos pouco sobre a biologia do desenvolvimento do Plasmodium no fígado; o acesso ao estágio de esporozoíto e a capacidade de modificar geneticamente tais esporozoítos são ferramentas críticas para estudar a natureza da infecção por Plasmodium e a resposta imune resultante no fígado. Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para a geração de esporozoítos transgênicos de Plasmodium berghei . Nós modificamos geneticamente o estágio sanguíneo de P. berghei e usamos essa forma para infectar mosquitos Anopheles quando eles tomam uma refeição de sangue. Após o desenvolvimento dos parasitas transgênicos nos mosquitos, isolamos o estágio de esporozoíto do parasita das glândulas salivares do mosquito para experimentação in vivo e in vitro . Demonstramos a validade do protocolo gerando esporozoítos de uma nova cepa de P. berghei expressando a proteína fluorescente verde (GFP) subunidade 11 (GFP11), e mostramos como ele pode ser usado para investigar a biologia da malária em estádio hepático.
Introdução
Apesar dos avanços no desenvolvimento de medicamentos e na pesquisa para prevenção e tratamento da malária, a carga global de doenças da malária permanece alta. Mais de meio milhão de pessoas morrem de malária a cada ano, com os níveis mais altos de mortalidade observados entre crianças que vivem em regiões endêmicas de malária, como a África Subsaariana1. A malária é causada pelo parasita Plasmodium, que é transmitido aos seres humanos através da picada de fêmeas de mosquitos Anopheles portadores do parasita em suas glândulas salivares. O estágio infeccioso do Plasmodium - os esporozoítos - são ....
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Protocolo
Todas as pesquisas envolvendo animais vertebrados em nosso laboratório foram realizadas de acordo com as diretrizes e protocolos de uso de animais da Universidade da Geórgia.
1. Geração de camundongos infectados por P. berghei
- Iniciar a infecção em estágio sanguíneo em camundongos C57BL/6 (B6) machos ou fêmeas com 6-8 semanas de idade usando parasitas selvagens de P. berghei. Para isso, transferir sangue criopreservado infectado por P. berghei (2 x 105 hemácias infectadas), reconstituído em 400 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), para um ou dois camundongos doadores por ....
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Resultados
Determinar a frequência e o desenvolvimento de esquizontos é fundamental para garantir que parasitas viáveis suficientes estejam no estágio ideal para transfecção. Esquizontes imaturos podem ser diferenciados de esquizontes totalmente maduros pela presença de menos merozoítos que não preenchem todo o espaço intracelular da hemácia (Figura 1B). É importante notar que, ao fazer esfregaços sanguíneos a partir de sangue cultivado, as hemácias infectadas podem se romper, resultando na observação .......
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Discussão
Utilizamos o protocolo acima em nosso laboratório para criar várias linhagens de parasitas transgênicos de P. berghei. Embora otimizado para P. berghei, também usamos com sucesso este protocolo para gerar esporozoítos transgênicos de P. yoelii. Depois de injetar os esquizontos transfectados em camundongos, os parasitas são detectáveis tipicamente no máximo 3 d.p.i. em todos os grupos, incluindo o controle sem plasmídeo. A seleção é iniciada somente após a detecção da parasitemia para garantir a.......
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Divulgações
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health grant AI168307 ao SPK. Agradecemos ao Núcleo de Citometria de Fluxo UGA CTEGD e ao Núcleo de Microscopia UGA CTEGD. Também agradecemos as contribuições de Ash Pathak, Anne Elliot e da equipe da UGA Sporocore na otimização do protocolo. Queremos agradecer ao Dr. Daichi Kamiyama por insights valiosos, discussões e os plasmídeos pais contendo GFP11 e GFP 1-10. Também gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Kurup por seu constante apoio, paciência e incentivo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 30 G x 1/2" Agulha de seringa | Exel international | 26437 | |
| Solução de Alsever | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Kit Nucleofector de Parasita Básico Amaxa 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoetanol) | TCI America | T1420 | |
| Tubos de coleta de sangue | BD bioscience | 365967 | para coleta de soro |
| Hematocitômetro descartável C-Chip | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Placa de Cultura de Células | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrífuga 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrífuga 5910R | Eppendorf | 5910R | Para centrifugação gradiente |
| Delta Vision II - Sistema de microscópio invertido | Olympus | IX-71 | |
| Dimetil Sulfóxido Sigma | D5879-500ml | ||
| Soro bovino fetal | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmídeo | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Gerado a partir do plasmídeo PL0017 |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 células | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Gerado a partir de células Hepa 1-6 (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Soro de | Usado para meios de dissecação de mosquitos | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1,5 M e 0,15 M para solução percoll |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Programa U-033 usado para eletroporação de hemácias | |
| Pipeta Pasteur | VWR | 14673-043 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (meio de estoque de gradiente de densidade) | Cytivia | 17-0891-02 | Detalhes no protocolo |
| PL0017 Plasmídeo | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pirimetamina (para administração oral) | Sigma | 46706 | Detalhes da preparação: Adicione 17,5 mg de pirimetamina a 2,5 mL de DMSO. Vórtice, se necessário, para se dissolver completamente; Ajuste o pH de 225 mL de dH2O para 4 usando HCL. Adicione pirimetamina em DMSO à água e leve a 250 mL. Adicione 10 g de açúcar para incentivar o consumo regular de água drogada. A pirimetamina é sensível à luz. Use uma garrafa escura ou uma garrafa coberta com papel alumínio ao tratar camundongos. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx software de microscopia | Precisão aplicada | v6.1.3 |
Referências
- WHO. Geneva. World Health Organization. , 1(2020).
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
- Crompton, P. D., et al.
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Reimpressões e permissões
