Artigo de método

Métodos para estudar a óptica, fisiologia e bioquímica do olho composto da mosca

24 de março de 2023

 , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

Neste artigo

Resumo

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ARTIGOS DISCUTIDOS:

Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling M. F., Stavenga, D. G. Mapeamento automatizado do espaço visual dos olhos compostos de moscas domésticas. Jornal de Experimentos Visualizados. (181), e63643 (2022).

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Estudando o tráfego de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas com eGFP. Jornal de Experimentos Visualizados. (179), e63375 (2022).

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Métodos eletrofisiológicos para medir os níveis de fotopigmento em fotorreceptores de Drosophila. Jornal de Experimentos Visualizados. (184), e63514 (2022).

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purificação de canais potenciais de receptores transitórios de Drosophila endógenos. Jornal de Experimentos Visualizados. (178), e63260 (2021).

Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Análise da sinalização lipídica em fotorreceptores de Drosophila usando espectrometria de massa. Jornal de Experimentos Visualizados. (181), e63516 (2022).

Editorial

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O olho composto da mosca é um importante sistema de modelo biológico para elucidar mecanismos biológicos fundamentais. Alguns dos mecanismos que foram estudados usando este sistema incluem o seguinte: visão ocular composta com um campo de visão quase panorâmico1; a biofísica, montagem de proteínas e biogênese do receptor acoplado à proteína G sensível à luz 2,3,4; o sistema de transdução de sinal mediado pela fosfolipase Cβ 5,6; ativação e modulação do canal TRP em tecido nativo 5,6; a montagem e função do complexo de sinalização multiproteico 7,8; a estrutura molecular, bioquímica e função da reciclagem de inositol-fosfolipídios 9,10; e a translocação subcelular mediada por sinal de proteínas sinalizadoras11,12. A estrutura anatômica única e a ótica do olho composto da mosca foram extensivamente estudadas, revelando mecanismos fundamentais de desenvolvimento e capacidades visuais.

Esta coleção de métodos compreende o trabalho dos principais cientistas que desenvolveram e refinaram métodos para estudar alguns dos mecanismos acima no olho composto da mosca. Muñoz et al. descrevem um método para analisar quantitativamente o arranjo óptico do olho da mosca que fornece um retrato preciso do olho composto e sua organização espacial13. Este método é essencial para estudar detalhadamente o processamento neuronal da informação visual. É importante ressaltar que houve muitas tentativas de produzir olhos artificiais bioinspirados, e estes se basearam em estudos quantitativos de olhos compostos existentes. Wagner et al. utilizam a pseudopupila profunda, um fenômeno óptico único do olho composto, e microscopia de alta amplificação com a neutralização óptica da córnea para localizar proteínas marcadas com eGFP dentro das células fotorreceptoras de Drosophila 14. Este método permite a detecção de defeitos estruturais nos rabdômeros devido à degeneração dos fotorreceptores e localização celular e tráfego de importantes proteínas de sinalização. Gutorov et al. utilizam medições eletrofisiológicas de todo o olho ou de células fotorreceptoras únicas para medir o nível de estados de fotopigmento in vivo e suas modulações por mutações específicas em proteínas de sinalização15. Este método explora os deslocamentos de carga dentro de um estado de pigmento visual (R) induzido pela absorção de fótons, o que resulta na formação de um segundo estado de pigmento que é estável no escuro (M). Um método adicional usa despolarização prolongada após o apagamento da luz (PDA) que explora as propriedades escuras biestáveis do pigmento visual e as diferenças nos espectros de absorção dos estados R e M da mosca. Como o PCA depende da conversão de uma grande quantidade de fotopigmento, mesmo o menor defeito na biogênese do fotopigmento pode levar a um PDA anormal facilmente detectável. De fato, os mutantes de Drosophila exibindo PDA anormal levaram à descoberta de novas proteínas de sinalização. Um exemplo notável disso é a descoberta do novo complexo proteico composto pela inativação da proteína de andaime, mas sem potencial posterior D (INAD), a proteína quinase C específica do olho (eyePKC), a fosfolipase Cβ (PLCβ) e o canal de potencial receptor transitório (TRP). Pela primeira vez, Liu et al. apresentam uma técnica para purificar o canalTRP 16 de Drosophila. Este método de purificação por afinidade modificado usa uma estratégia de competição baseada no mecanismo de montagem do complexo de sinalização INAD. Essa estratégia permite a purificação do canal TRP endógeno. De acordo com este método, primeiro um fragmento de PLCβ ligado a grânulos de Ni é marcado com histidina e usado para puxar para baixo o complexo de proteína INAD endógeno obtido de homogeneizados de cabeça de Drosophila. Em seguida, fragmentos de TRP marcados com glutationa S-transferase (GST) excessivamente purificada são adicionados aos grânulos de Ni para competir com o canal TRP endógeno ligado ao INAD. Finalmente, a cromatografia de exclusão de tamanho é usada para separar os fragmentos do canal TRP marcados no sobrenadante do canal TRP endógeno. Panda e col. relatam uma técnica sensível para identificar e quantificar várias classes de lipídios em células fotorreceptoras de Drosophila usando espectrometria de massa17. A ativação do PLCβ é crucial para a fototransdução, pois leva à hidrólise do fosfatidilinositol 4,5 bifosfato (PI(4,5)P2) na membrana superficial. Essa reação acaba levando à ativação do canal TRP. Além disso, a atividade do PLCβ resulta na geração de muitas espécies lipídicas. Foi proposto que várias dessas espécies lipídicas podem participar da ativação do TRP e desempenhar papéis fundamentais na organização funcional dos fotorreceptores para otimizar a transdução sensorial. No estudo de Panda et al.17, esses achados foram avaliados isolando-se mutantes de Drosophila que abrigam enzimas defeituosas que controlam os níveis de lipídios específicos.

O olho composto da mosca é um sistema experimental útil para elucidar mecanismos fundamentais em biologia. A poderosa metodologia genética desenvolvida em Drosophila pode ser usada para analisar e descobrir as proteínas de sinalização envolvidas na fototransdução de moscas. Esta coleção de métodos descreve em detalhes as principais técnicas para investigar os mecanismos fundamentais da visão da mosca, incluindo a análise anatômica e óptica do olho composto e os componentes moleculares e reações bioquímicas das células fotorreceptoras. Os artigos em vídeo também incluem conselhos importantes sobre as dificuldades inerentes a essas metodologias. Esta coleção de métodos também deve ser benéfica para cientistas fora deste campo de pesquisa, pois essas técnicas podem ser adaptadas a outras preparações biológicas.

Divulgações

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O autor não tem nada a divulgar.

Agradecimentos

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O autor não tem agradecimentos.

Referências

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  1. Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 202 (12), 839-851 (2016).
  2. Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
  3. Rosenbaum, E. E., et al. XPORT-dependent transport of TRP and rhodopsin. Neuron. 72 (4), 602-615 (2011).
  4. Vought, B. W., et al. Characterization of the primary photointermediates of Drosophila rhodopsin. Biochemistry. 39 (46), 14128-14137 (2000).
  5. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  6. Minke, B., Pak, W. L. The light-activated TRP channel: The founding member of the TRP channel superfamily. Journal of Neurogenetics. 36 (2-3), 55-64 (2022).
  7. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store-operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. The EMBO Journal. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  8. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  9. Raghu, P., Basak, B., Krishnan, H. Emerging perspectives on multidomain phosphatidylinositol transfer proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (9), 158984(2021).
  10. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  11. Bahner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
  12. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
  13. Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling, M. F., Stavenga, D. G. Automated charting of the visual space of housefly compound eyes. Journal of Visualized Experiments. (181), e63643(2022).
  14. Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Studying membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged proteins. Journal of Visualized Experiments. (179), e63375(2022).
  15. Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological methods for measuring photopigment levels in Drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments. (184), e63514(2022).
  16. Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of endogenous Drosophila Transient Receptor Potential channels. Journal of Visualized Experiments. (178), e63260(2021).
  17. Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Analysis of lipid signaling in Drosophila photoreceptors using mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (181), e63516(2022).

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DrosophilaPhotoreceptor CellsMembrane Protein TraffickingPhotopigment LevelsElectrophysiological MethodsEndogenous ChannelsLipid SignalingMass SpectrometryVisualized Experiments

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