Artigo de método

Geração de Organoides Hepáticos Endodérmicos Funcionais

DOI:

10.3791/65027

⸱

2 de maio de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Department of Histology and Embryology, Health Science Institute, Dokuz Eylul University, 3Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Izmir Tinaztepe University, 4Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 5Department of Pediatric Gastroenterology and Metabolism, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 6Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Koc University, 7Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve a geração de organoides hepáticos endodérmicos rápidos e reprodutíveis (eHEPOs). Com este protocolo, os eHEPOs podem ser produzidos em 2 semanas e expandir a longo prazo (mais de 1 ano) sem perder sua diferenciação e funcionalidade.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A tecnologia organoide nos permitiu gerar uma variedade de miniestruturas semelhantes a órgãos humanos, como fígado, cérebro e intestino, in vitro. Os notáveis avanços nos modelos organoides abriram recentemente uma nova era experimental para várias aplicações em modelagem de doenças, biologia do desenvolvimento e descoberta de medicamentos. Células-tronco adultas ou organoides hepáticos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) governam a geração de hepatócitos a serem usados em diversas aplicações. Aqui, apresentamos um protocolo robusto e reprodutível para geração de organoides hepáticos a partir de células-tronco pluripotentes. Este protocolo é aplicável a células saudáveis e derivadas de pacientes. Para obter organoides hepáticos derivados de endoderme 3D (eHEPOs), as iPSCs foram diretamente diferenciadas primeiro em células endodérmicas e, em seguida, células EpCAM-positivas enriquecidas com FACS (EpCAM +) foram usadas para estabelecer organoides hepáticos usando o meio de expansão. Fornecemos um método rápido e eficiente para gerar organoides hepáticos em 2 semanas. Os organoides gerados imitam as propriedades e funções essenciais dos hepatócitos, como secreção de albumina, armazenamento de glicogênio e atividade da enzima citocromo P450. Além das semelhanças de expressão gênica específicas do fígado, os eHEPOs compreendem células epiteliais polarizadas com canalículos biliares entre eles. Além disso, os eHEPOs podem ser expandidos e passagens seriadas a longo prazo (1 ano) sem perder sua capacidade de se diferenciar em hepatócitos maduros. Assim, os eHEPOs fornecem uma fonte alternativa para produzir hepatócitos funcionais.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoides são estruturas miniaturizadas semelhantes a órgãos cultivadas em condições de cultura tridimensionais que imitam o microambiente do órgão e incluem os fatores intrínsecos necessários para a auto-organização e auto-renovação no próprio desenvolvimento do órgão. Os organoides podem ser derivados de células-tronco pluripotentes (PSCs) ou células derivadas de tecidos adultos (células-tronco ou progenitoras)1. Embora sua organização precisa semelhante a um órgão e semelhança funcional com o órgão específico os tornem ferramentas valiosas para a modelagem de doenças, eles ainda precisam de melhorias adicionais em termos de padronização na cultura. Em particular, vários protocolos foram publicados para a geração de organoides hepáticos e diferem em sua complexidade e reprodutibilidade2. Por exemplo, os organoides de brotos hepáticos desenvolvidos por Takebe et al. assumem a forma de estruturas densas e multicelulares contendo as seguintes células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs): progenitores endodérmicos hepáticos, células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e células-tronco mesenquimais (MSCs). No entanto, esses organoides não têm capacidade de auto-renovação de longo prazo 3,4.

De uma perspectiva histórica, Huch et al. relataram pela primeira vez a produção de organoides epiteliais hepáticos humanos derivados de tecido adulto, nos quais as células polarizam e se especializam para reproduzir aspectos do epitélio nativo5. Em seguida, Guan et al. usaram organoides hepáticos derivados de iPSC para modelar a síndrome de Alagille (ALGS), um distúrbio genético raro associado à redução do ducto biliar no fígado6. Ambos os organoides têm capacidade de autorrenovação e podem ganhar funções maduras de hepatócitos, como secreção de bile e albumina, armazenamento de glicogênio e desintoxicação de drogas específicas para o fígado. Em um estudo recente, Ramli et al. introduziram um modelo organoide hepático derivado de PSC contendo redes funcionais de canalículos biliares entre células polarizadas semelhantes a hepatócitos (HLCs) que esvaziam drogas colestáticas em cistos biliares compostos de células semelhantes a colangiócitos (CLCs)7.

Este estudo apresenta uma cultura única para a geração de organoides hepáticos endodérmicos derivados de iPSC, chamados eHEPOs. A cultura de iPSC e a diferenciação em endoderme são descritas passo a passo, e a geração de eHEPOs a partir de progenitores enriquecidos de EpCAM+ é demonstrada. Por fim, é descrita a caracterização da funcionalidade e organização estrutural dos eHEPOs, bem como a criopreservação dos organoides.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As permissões relacionadas às etapas experimentais foram obtidas do Comitê de Ética em Pesquisa Clínica local da Faculdade de Medicina da Universidade Dokuz Eylul (2013/25-4, 12 de maio de 2013; 2016/30-29, 24 de novembro de 2016).

1. Preparação de soluções para cultura celular

  1. Prepare o meio de diferenciação endoderme misturando os seguintes componentes em uma capela de fluxo laminar: 1% B27, 100 ng/mL de Activina A, Wnt3a ou 30% wnt3a-CM e R-spo1 ou 10% R-spo1-CM (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Prepare o tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) com a seguinte composição: PBS, EDTA 1 mM, HEPES 25 mM, FBS 1%.
  3. Prepare o meio de expansão (EM): 1% N2, 1% B27, 1,25 mM N-acetil-L-cisteína, 50 ng/mL EGF, 10% R-spo1 meio condicionado, 100 ng/mL FGF 10, 10 mM de nicotinamida, 5 μM A8301 e 10 μM de forscolina (FSK) em Advanced DMEM/F-12. Adicione 10 nM Y-27632 e 0.3 nM WNT3a (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: Mantenha o meio completo por no máximo 2 semanas a 2-8 °C.
  4. Prepare o meio de diferenciação (DM): 1% N2, 1% B27, gastrina 10 nM, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF 10, 25 ng/mL HGF, 500 nM A8301, 10 μM DAPT, 25 ng/mL BMP7 e 30 μM dexametasona em Ad-DMEM/F-12 (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: Mantenha o meio completo por 2 semanas a 2-8 °C.

2. Descongelar os iPSCs na placa sem alimentador

  1. Cubra a placa de cultura de células com matriz de membrana basal (BMM).
    1. Descongele um frasco de uma alíquota de BMM durante a noite no gelo ou pelo menos 2 h antes de iniciar o revestimento. Adicione 6 mL de DMEM / F-12 frio em um tubo cônico de 15 mL, adicione imediatamente 80 μL de BMM descongelado e misture bem.
    2. Use placas de poço tratadas com cultura de tecidos, cubra a placa de cultura com solução BMM e dispense-a para cobrir a superfície da placa do poço. Incubar a placa numa incubadora a 37 °C durante, pelo menos, 1 h antes da utilização. Após o tempo de incubação, descarte a solução BMM e adicione imediatamente o meio específico para iPSC.
  2. Remova um frasco de iPSCs do armazenamento de nitrogênio líquido usando luvas criogênicas. Coloque imediatamente o frasco para injetáveis num suporte para tubos flutuante e mergulhe o suporte num banho-maria a 37 °C até que os cristais de gelo derretam.
    1. Remova o frasco do banho-maria e limpe bem a parte externa com etanol a 70%. Em seguida, coloque-o na coifa laminar. É importante ser rápido nesta etapa.
    2. Em condições assépticas, em uma coifa laminar, transfira as células descongeladas para um tubo cônico estéril de 15 mL contendo 5 mL de meio específico para iPSC.
      1. Centrifugue as células a 200 × g (à temperatura ambiente) durante 3 min. Rejeitar lentamente o sobrenadante, ressuspender as células em 2 ml de meio específico para iPSC pipetando muito suavemente algumas vezes com uma pipeta serológica de 5 ml e semear as células nos alvéolos revestidos.
    3. Mova a placa rapidamente para dispersar as células por toda a superfície do poço. Incubar a placa na incubadora a 37 °C, 5% de CO2 .
    4. Atualize o meio de cultura todos os dias.

3. Diferenciação da endoderme

  1. Cubra uma nova placa de poço com BMM 1 h antes de dividir as iPSCs, conforme mencionado na seção 2.
  2. Controle a integridade e viabilidade das iPSCs sob microscopia de luz. As iPSCs indiferenciadas são células com núcleos grandes, citoplasma pequeno e colônias de células compactas com bordas distintas.
    NOTA: Existem duas soluções enzimáticas para dividir células. No caso de uso de dispase (1 U/mL), áreas de células diferenciadas devem ser removidas. Se uma enzima específica for usada, não há necessidade de diferenciar manualmente as regiões com raspagem ou sucção. Mantenha a enzima específica à temperatura ambiente.
  3. Aqueça o iPSC em temperatura média a ambiente. Aspire o meio e lave a placa iPSC com DMEM/F-12 ou D-PBS. Adicione 1 mL da enzima específica a um poço de uma placa de 6 poços, incube por 1 min à temperatura ambiente e, em seguida, aspire a enzima específica e incube a placa a 37 ° C por 5-7 min.
    NOTA: O tempo ideal de tratamento com enzimas deve ser otimizado com base na linha iPSC usada.
  4. Após o tempo de incubação, adicione 1 mL de meio iPSC pré-aquecido e bata suavemente na lateral da placa para separar os agregados de colônias indiferenciadas da superfície da placa. O tamanho ideal dos agregados é de 50-200 μM.
    1. Com uma pipeta sorológica de 5 mL, misture suavemente a suspensão e, em seguida, semeie a suspensão celular na densidade desejada no poço revestido com BMM. Incubar as células a 37 °C durante 3-5 dias para atingir uma confluência de 70%.
  5. Antes de iniciar a diferenciação, substitua o meio iPSC pelo meio endoderme (etapa 1.1). Atualize o meio todos os dias. Controle as mudanças morfológicas das células durante as etapas de diferenciação. As interações célula-célula começam a aparecer após a diferenciação e as células ganham uma forma pontiaguda.

4. Estabelecimento eHEPO

  1. Realizar o enriquecimento das células endodérmicas EpCAM+ com FACS.
    1. Descongele um frasco de BMM específico para organoides (consulte a Tabela de Materiais) em gelo antes do experimento de classificação de células. Pré-aqueça as placas de cultura de tecidos a 37 °C durante a noite antes do experimento de classificação de células.
    2. Enxágue as células endodérmicas com 1x PBS. Adicione 300 μL de tripsina e incube por 5 min na incubadora. Adicione 3 mL de DMEM-F12 frio e pipete com pontas de filtro de 1.000 μL para gerar células individuais.
    3. Recolha a suspensão celular num tubo cónico de 15 ml. Centrifugue as células a 300 x g (à temperatura ambiente) por 5 min. Descarte o sobrenadante e lave o pellet com 10 mL de tampão FACS (etapa 1.2).
    4. Para fazer uma suspensão unicelular, filtre as células primeiro com um filtro de malha de 100 μm e depois com um filtro de malha de 40 μm.
      NOTA: Antes de usar o filtro, enxágue a superfície do filtro com 1 mL de tampão FACS.
    5. Centrifugue a suspensão da célula a 300 x g (à temperatura ambiente) por 5 min. Conte o número da célula com Trypan Blue8.
    6. A proporção para coloração é de 1:11. Por exemplo, ressuspenda 15 x 106 células com 105 μL de tampão FACS e adicione 45 μL de FcR e 15 μL de EpCAM (consulte a Tabela de Materiais). Incubar as células durante 10 min a 40 °C e proteger o tubo da luz. Após a incubação, adicione 500 μL de tampão FACS para lavar a suspensão celular. Centrifugue as células a 300 x g (à temperatura ambiente) por 5 min.
    7. Ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão FACS. Adicione DAPI (0,5 μM / 1 mL, concentração final) à suspensão celular para quantificar as células mortas. Mantenha as células no gelo até iniciar a etapa de classificação das células.
  2. Incorpore o EpCAM e classifique as células no BMM. Após a classificação das células, centrifugue as células a 300 x g por 5 min para retirar o tampão FACS. Remova o sobrenadante e ressuspenda 3.000-5.000 células em 20 μL de BMM.
    1. Semeie as células adicionando uma gota de BMM ao centro de cada placa de 48 poços. Incubar as células durante 2 min a 37 °C até que o BMM esteja solidificado. Reverta cuidadosamente a placa e mantenha-a na incubadora por mais 10 min. Cubra a gota com o meio de expansão (250 μL por poço para uma placa de 48 poços).
    2. Atualize o meio organoide a cada 3 dias. Nos dias 10-11, o tamanho do organoide será maior que 100 μm.
  3. Realize a dissociação e diferenciação mecânica do eHEPO.
    1. Divida cada gotícula organoide na proporção de 1:4. Para dividir, descarte o meio organoide e adicione 500 μL de Ad-DMEM/F12 frio. Com pontas de filtro de 1.000 μL, pipete vigorosamente as gotículas de BMM.
    2. Colete no máximo 10 gotículas de BMM em tubos cônicos de 15 mL e adicione 5 mL de Ad-DMEM / F12 frio. Mantenha o tubo no gelo por 3-5 min.
    3. Centrifugar as células a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante até restar 1 mL. Pipetar vigorosamente o pellet celular 30-40 vezes utilizando pontas de filtro de 200 μL. Verifique o tamanho do organoide sob microscopia de luz, evitando cuidadosamente a formação de uma suspensão unicelular.
    4. Após dissociação mecânica, adicione 5 mL de Ad-DMEM / F12 frio e centrifugue as células a 200 x g por 5 min a 4 ° C.
    5. Descarte o sobrenadante e mantenha a suspensão no gelo até semear as células.
    6. Semeie uma gota de 50 μL de BMM (contendo 35 μL de BMM + 15 μL de células e Ad-DMEM/F-12 por poço para uma placa de 24 poços).
    7. Adicione BMP7 (25 ng/mL, consulte a Tabela de Materiais) ao meio EM e cultive por 3 dias. No dia 4, substitua o meio pelo meio de diferenciação (etapa 1.4). Atualize o meio a cada 3 dias e cultive as células por pelo menos 14 dias.

5. Caracterização de eHEPOs

  1. Realize exames histológicos.
    1. Execute a incorporação de parafina.
      1. Remova o meio, adicione 1-2 mL de PBS 1x frio e ressuspenda suavemente o BMM no PBS 1x frio. Transfira cuidadosamente os organoides para um tubo de centrífuga de 15 mL. Deixe os organoides assentarem sob a gravidade e, em seguida, aspire cuidadosamente o PBS. Repita a etapa de lavagem três vezes.
      2. Adicione 10 mL de fixador fresco (10% de formalina tamponada neutra) aos organoides e incube por 30 min. Remova suavemente o fixador, adicione 10 mL de PBS 1x frio e incube por 10 min. Aspire cuidadosamente o PBS.
      3. Manchar os organoides em solução de eosina a 0,5% (ver Tabela de Materiais) dissolvida em etanol a 96% por 30 min à temperatura ambiente.
        NOTA: Se a imunocoloração for feita, não cove com eosina.
      4. Desidrate os organoides lavando com uma série de álcool (70% de etanol, 80% de etanol e 96% de etanol) por 5 min cada em temperatura ambiente. Mergulhe os organoides em etanol 100% (etanol absoluto) por 30 min.
      5. Limpe os organoides usando xileno (consulte a Tabela de Materiais) três vezes por 20 minutos de cada vez9.
        CUIDADO: O xileno é um composto muito tóxico e inflamável, portanto, manuseie-o usando equipamentos de segurança apropriados. Evite trabalhar em grandes quantidades.
      6. Transfira suavemente os organoides para um molde de base de metal pré-aquecido (consulte a Tabela de Materiais) com parafina derretida usando uma pipeta de plástico. Manter os organoides em parafina derretida três vezes durante 30 minutos cada numa incubadora a 65 °C (substituí-la por uma nova parafina fresca derretida a cada mudança).
      7. Em seguida, incorpore os organoides em uma nova parafina fresca. Mova os organoides suavemente para o meio do molde da base de metal.
        NOTA: Para esta etapa, é crucial trabalhar rapidamente porque a parafina solidifica à temperatura ambiente.
      8. Transfira o molde da base de metal para a placa fria por 10-20 s para estabilizar os organoides. Em seguida, despeje parafina derretida para cobrir o molde de base de metal e adicione um de tecido (consulte a Tabela de Materiais) na parte superior do molde de base de metal para rotulagem. Certifique-se de que haja parafina suficiente no molde e deixe-os solidificar na placa fria. Remova o molde da base de metal.
      9. Corte seções de 5-7 μm de espessura usando um micrótomo padrão (consulte a Tabela de Materiais). Coloque seções de parafina em série em lâminas adesivas de microscópio. Deixe as lâminas secarem durante a noite.
    2. Realize a coloração de hematoxilina e eosina (H & E) e ácido periódico de Shiff (PAS).
      1. Coloque as lâminas embebidas em parafina em uma incubadora a 63 ° C durante a noite para desparafinização. No dia seguinte, coloque as lâminas em xileno três vezes por 20 minutos de cada vez. Não deixe as lâminas secarem.
      2. Reidrate as lâminas com uma série de álcool graduado (100% etanol, 96% etanol, 80% etanol e 70% etanol) por 2 min. Em seguida, coloque as lâminas na água destilada por 1 min.
      3. Para coloração H&E, execute as etapas a seguir.
      4. Coloque as lâminas em solução de hematoxilina por 5 min. Enxágue as lâminas em água corrente da torneira por 5 min. Manchar as lâminas com solução de eosina Y a 1% (ver Tabela de Materiais) durante 10 s.
      5. Desidrate as seções com uma série de etanol a 80%, etanol a 96% e duas trocas de etanol a 100% por 30 s cada.
      6. Coloque as lâminas no xileno para limpar três vezes por 20 minutos de cada vez.
      7. Monte cuidadosamente as lamínulas nas seções das lâminas de vidro com um meio de montagem (consulte a Tabela de Materiais). Certifique-se de que não haja mais bolhas.
      8. Para a coloração PAS, execute as etapas 5.1.2.4-5.1.2.6, seguidas dos procedimentos para a coloração PAS conforme relatado por Akbari et al.10. Em seguida, monte cuidadosamente as lamínulas nas seções das lâminas de vidro com o meio de montagem. Certifique-se de que não haja mais bolhas.
    3. Realize a coloração imuno-histoquímica (IHQ).
      1. Execute a etapa 5.1.2.1 e a etapa 5.1.2.2 no protocolo de coloração H&E.
      2. Aqueça as lâminas em tampão citrato 0,1 M (pH 6,0) no micro-ondas por 10 min.
      3. Segure até que as lâminas esfriem até a temperatura ambiente (aproximadamente 20 min) e enxágue as lâminas com água destilada.
      4. Coloque as lâminas em 3% H2O2 recém-preparadas em metanol por 10 min em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue as lâminas em água destilada por 1 min.
      5. Bloqueie a ligação não específica de anticorpos primer incubando as seções com uma solução de bloqueio (soro a 2% + Triton X-100 a 0,1% + BSA a 0,1%) à temperatura ambiente por 1 h.
      6. Remova cuidadosamente a solução de bloqueio e adicione os anticorpos primários (E-CAD, ALB, EpCAM, A1AT, CK19) (consulte a Tabela de Materiais) diluídos na solução de bloqueio a 4 ° C durante a noite.
      7. No dia seguinte, enxágue cuidadosamente as lâminas duas vezes por 10 min (.
      8. Adicione os anticorpos secundários (Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-Mouse) (consulte a Tabela de Materiais) por 1 h em temperatura ambiente e enxágue as lâminas em água destilada por 5 min (três vezes).
      9. Prepare a solução de tetracloridrato de diaminobenzidina 3'3 (DAB, consulte a Tabela de Materiais) (deve ser preparada 30 minutos antes do uso).
      10. Aplique a solução DAB nas lâminas por 1-5 min e enxágue as lâminas em água destilada por 5 min (três vezes).
      11. Contra-corar as secções com hematoxilina durante 1 min e enxaguar as lâminas em água corrente da torneira durante 1 min.
      12. Desidrate as seções com uma série de etanol a 80%, etanol a 96% e duas trocas de etanol a 100% por 30 s cada.
      13. Coloque as lâminas em xileno por 20 min (três vezes).
      14. Monte cuidadosamente a lamínula na seção da corrediça de vidro com um meio de montagem. Certifique-se de que não haja mais bolhas.
    4. Execute a incorporação de OCT.
      1. Fixe os organoides usando PFA a 4% frio recém-preparado durante a noite a 4 °C. Remova cuidadosamente o fixador e lave com 1x PBS por 15 min (três vezes).
      2. Prepare uma solução de sacarose a 30% (p / v) usando água destilada. Remova o 1x PBS e adicione a sacarose a 30% para desidratar os organoides.
      3. Incubar os organoides a 4 °C durante a noite. Inicialmente, a maioria dos tecidos flutua em sacarose a 30% e afunda assim que a permeação estiver completa. A crioproteção pode ser considerada completa neste momento.
      4. Prepare gelo seco ou nitrogênio líquido para o processo de incorporação.
      5. Coloque duas a três gotas de OCT (consulte a Tabela de Materiais) em criomoldes de plástico. Coloque os organoides em cima na orientação correta para o corte.
      6. Despeje lenta e cuidadosamente o OCT em cima dos organoides. Tenha cuidado para evitar bolhas. Deixe os organoides assentarem sob gravidade por 10-15 min em temperatura ambiente.
      7. Rotule os criomoldes antes da etapa de congelamento. Coloque os moldes em gelo seco ou nitrogênio líquido para congelamento rápido. Transfira os criomoldes para −80 °C e armazene-os lá até o processo de seccionamento.
    5. Realize a coloração por imunofluorescência (IF).
      1. Execute a coloração da seção congelada.
        1. Seque ao ar as seções criogênicas por 20-30 min em temperatura ambiente. Reidrate as lâminas com água destilada por 5 min (três vezes). Cerque o tecido com uma barreira hidrofóbica usando uma caneta de papanicolau (consulte a Tabela de Materiais).
        2. Adicione 200-300 μL de Triton X-100 a 0,2% por seção. Lave cuidadosamente as lâminas por 5 min (três vezes). Certifique-se de que as seções não caiam das corrediças durante as etapas de lavagem.
        3. Adicione solução de bloqueio (soro a 2% + Triton X-100 a 0,1% + BSA a 0,1%) por 1 h em temperatura ambiente.
        4. Remova suavemente a solução de bloqueio, adicione os anticorpos primários (E-CAD, A1AT, HNF4α) diluídos na solução de bloqueio (consulte a Tabela de Materiais) e incube as lâminas durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, lave cuidadosamente as lâminas por 10 min (duas vezes).
        5. Adicione anticorpos secundários adequados (Alexa Fluor 488 [Mouse], Alexa Fluor 594 [Mouse], Alexa Fluor 594 [Rabbit]) por 1 h em temperatura ambiente (consulte a Tabela de Materiais) e enxágue as lâminas em água destilada por 5 min (três vezes).
        6. Adicione 100-200 μL de corante nuclear Hoechst ou DAPI por seção por 3 min, lave as lâminas com 1x PBS e repita a etapa de lavagem três vezes.
        7. Monte as lamínulas nas seções em lâminas de vidro com um meio de montagem anti-desbotamento. Mantenha as lâminas durante a noite a 4 °C e proteja-as da luz até o processo de imagem.
      2. Execute a coloração de montagem inteira.
        1. Execute as etapas 5.1.1.1 e 5.1.1.2 no procedimento de incorporação de parafina.
        2. Adicione solução de bloqueio (0,1% -1% Triton X-100, 1% DMSO, 1% BSA e 1% de soro de cabra em 1x PBS, consulte a Tabela de Materiais) e incube os organoides com solução de bloqueio por 2-3 h em temperatura ambiente.
        3. Remova cuidadosamente a solução de bloqueio e adicione os anticorpos primários (CK19, CK18, ZO-1, ALB) diluídos na solução de bloqueio durante a noite a 4 ° C (consulte a Tabela de Materiais).
        4. No dia seguinte, remova suavemente a solução e adicione 1x PBS. Deixe os organoides assentarem sob gravidade por até 10 min. Remova a solução com cuidado e repita a etapa de lavagem três vezes.
        5. Incube os organoides com os anticorpos secundários (Alexa Fluor 594 [Mouse], Alexa Fluor 488 [Rabbit], Alexa Fluor 488 [Mouse]) por pelo menos 1 h em temperatura ambiente. Remova a solução com cuidado e repita a etapa de lavagem quatro vezes.
        6. Para coloração nuclear, incubar os organoides com corante nuclear Hoechst ou DAPI durante 10 min. Lave os organoides adicionando 1x PBS e repita a etapa de lavagem três vezes. Deixe os organoides assentarem no fundo do tubo.
        7. Usando uma pipeta Pasteur de plástico, remova os organoides do tubo e coloque-os em lâminas de vidro. Certifique-se de fazê-lo com o mínimo de danos aos organoides.
        8. Remova o excesso de PBS e adicione uma quantidade (uma a duas gotas) de meio de montagem. Monte cuidadosamente as lamínulas nos organoides nas lâminas de vidro com o meio de montagem. Mantenha as lâminas a 4 °C e proteja-as da luz até o processo de imagem.
  2. Realize microscopia eletrônica.
    1. Fixe os organoides usando solução de Karnovsky (glutaraldeído tamponado a 2,5% + paraformaldeído a 2% em tampão fosfato de sódio 0,1 M [tampão de Sorensen], pH 7,4, consulte a Tabela de Materiais) durante a noite a 4 ° C.
    2. Lave os organoides com tampão de Sorenson 0,1 M + sacarose 0,1 M (1:1) por 15 min (três vezes). Em seguida, fixe os organoides em tetróxido de ósmio tamponado com fosfato de sódio a 2% (consulte a Tabela de Materiais) por 90 min.
    3. Incorpore os organoides em ágar quente a 2%. Corte o excesso de ágar ao redor dos organoides usando uma lanceta. Lave os organoides no tampão de Sorensen por 15 min (três vezes).
    4. Desidratar com acetona a 50% por 15 min (duas vezes).
    5. Contraste durante a noite usando acetona a 70% + ácido fosfotúngstico a 1% + acetato de uranila a 0,5% (consulte a Tabela de Materiais) a 4 ° C.
    6. No dia seguinte, desidrate os organoides usando uma série de acetona (80% de acetona, 90% de acetona, 96% de acetona e 100% de acetona) por 15 min (duas vezes).
    7. Limpe os organoides usando óxido de propileno por 10 min (duas vezes) e, em seguida, coloque os organoides em uma mistura de óxido de propileno (consulte a Tabela de Materiais) por 30 min em temperatura ambiente.
    8. Adicione uma nova solução de epon aos organoides e incube durante a noite a 4 °C.
    9. No dia seguinte, coloque uma nova solução de epon fresca no molde de base e, em seguida, incorpore os organoides. Colocar numa incubadora durante 48 h a 65 °C para polimerização.
    10. Corte os blocos de epon organoide com um ultramicrótomo ajustado para uma espessura de seção de 50-100 nm. Coloque as seções em grades cobertas de formvar.
  3. Meça a atividade enzimática do CYP3A4.
    1. Meça a atividade do CYP usando um kit disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.
      NOTA: As enzimas CYP convertem o substrato em um produto intermediário detectável 11,12,13. Existem duas opções (lítica celular e não lítica) para medir a atividade da enzima CYP. O kit fornece um aplicativo para analisar as atividades basais do CYP e as atividades induzidas do CYP após o tratamento com compostos.
    2. Execute o experimento em triplicado. Leia a luminescência com um luminômetro e calcule o sinal. Para normalizar, tripsinize os organoides e conte o número de células.
  4. Realize a quantificação da albumina humana.
    1. Substituir o meio de cultura celular por um meio novo 24 h antes do teste ELISA. Após 24 h de incubação, recolher o meio de cultura celular (300-500 μl) e centrifugar a 500 x g (a 4 °C) durante 2 minutos para remover os restos celulares e as partículas. Aliquotar o sobrenadante e armazenar as amostras a -80 °C (até 3 meses).
    2. Execute o padrão e a amostra em duplicata. Organoides amadurecidos secretam albumina no meio de cultura; quantificar esta albumina com um kit de quantificação ELISA (ver Tabela de Materiais). Medir a absorvância com um leitor de placas ELISA a 450 nm no prazo de 30 minutos após a interrupção da adição da solução. Tripsinize os organoides e conte o número de células a serem normalizadas.
  5. Realizar o ensaio de eliminação do amoníaco.
    1. Realize o ensaio de eliminação de amônia seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Resumidamente, adicione 1,5 mM NH4Cl ao meio de cultura e incube por 24 h.
    2. Após a incubação, determine a concentração de amônia com um kit de ensaio de amônia (consulte a Tabela de Materiais). Calcule as medições usando um leitor multimodo de várias placas e normalize os valores para os números das células.
  6. Realize o ensaio de colilgilglicilamido-fluoresceína (CLF).
    1. Resumidamente, trate os organoides com 10 μmol/L CLF (consulte a Tabela de Materiais) e incube por 1 h em uma incubadora a 37 °C. Após a incubação, lave os organoides com 1x PBS. Realize imagens usando microscopia de fluorescência.
  7. Realize a análise da expressão gênica.
    1. Siga as instruções do kit RNeasy (consulte a Tabela de Materiais) para isolar o RNA total dos eHEPOs.
    2. Configure a reação de PCR usando uma mistura principal disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais), seguindo as instruções do fabricante. Depois de preparar a mistura de PCR para cada conjunto de primers, coloque 10 μL de cada amostra nas placas de qPCR de 96 poços (Tabela 1).
    3. Sele as placas com selante adesivo e, em seguida, centrifugue as placas a 1.000 x g por 2 min em temperatura ambiente. Carregue as placas em uma máquina de PCR. Normalize a expressão gênica relativa a um controle interno (RPL41, Tabela 1) e analise usando o método 2−ΔΔCt 14.

6. Criopreservação dos eHEPOs

  1. Rotule os criotubos com um marcador resistente ao nitrogênio. Verificar o nível de isopropanol do recipiente de congelação e mantê-lo a 4 °C durante 15-30 minutos antes de iniciar a experiência.
  2. Congele uma gota de 50 μL de BMM em uma criogenia. Prossiga com a dissociação mecânica organoide conforme descrito na etapa 4.3. Após a dissociação, ressuspenda o agregado celular em 500 μL de meio de congelamento frio, depois transfira suavemente a suspensão para criogeniais e mantenha-os no recipiente de congelamento.
  3. Transfira o recipiente de congelamento da célula para -80 ° C e, após 24 h, transfira os criogenianos para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

7. Descongelamento dos eHEPOs

  1. Pré-aqueça um banho-maria e Ad-DMEM/F12 a 37 °C.
  2. Remova um frasco de eHEPOs do armazenamento de nitrogênio líquido usando luvas criogênicas. Colocar o frasco para injetáveis num banho-maria a 37 °C até os cristais de gelo derreterem. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 200 x g por 5 min a 4 ° C.
  3. Aspire o sobrenadante e prossiga para a semeadura dos eHEPOs conforme descrito na seção 4. Cubra a gota BMM com o meio de expansão suplementado com 10 μM Y-27632 (consulte a Tabela de Materiais). Atualize o meio a cada 3 dias e remova o inibidor de ROCK após 3 dias.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Em primeiro lugar, células de fibroblastos humanos ou células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram cultivadas e convertidas em iPSCs por meio de reprogramação epissómica. O soro nocaute fresco foi essencial para a obtenção de iPSCs saudáveis. Em seguida, as iPSCs foram semeadas nas placas de cultura revestidas com BMM com 50%-60% de confluência. Ter colônias de iPSC de tamanho pequeno/médio melhorou a eficiência de diferenciação. Em seguida, as iPSCs foram diferenciadas em endoderme definitivo com mei...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo descreve um método abrangente para gerar, expandir e congelar/descongelar organoides hepáticos a partir de iPSCs. Este protocolo abrange todas as etapas, incluindo a cultura das iPSCs na cultura alimentadora e livre de alimentador, diferenciação de endoderma bidimensional, enriquecimento das células progenitoras com FACS e formação de organoides e geração de organoides que ganham função. Além disso, também são fornecidas instruções detalhadas para validar e caracteri...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar. Os autores não têm conflitos de interesse a declarar. Esra Erdal é cofundadora da empresa ORGANO-ID Biotechnology.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi apoiada pelo Conselho de Pesquisa Científica e Tecnológica da Turquia (TÜBİTAK) por meio dos projetos SBAG-115S465 e SBAG-213S182. A Figura 1 foi gerada usando BioRender.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de centrífuga cônicos de 15 mLCorning430052
37 &graus; C banho-mariaNü ve210.NB9
37 &graus; C, 5 % CO2 incubadoraMemmertINCO 153
Tubos de centrífuga cônicos de 50 mLCorning430290
70 µ m e 40 µ m Filtro de célulaFalcão352350/ 352340
70% de etanolSigma1009832511
A1ATAbcamab166610Diluição: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (TGF-β inibidor)Tocris Biosciene2939
AcetonaIsolab9,01,026
Corrediça adesiva do microscópioHistobondC981040
DMEM-F12 avançadoGibco12634-010
AFPAbcamAB3980Diluição: 1/25 (IHC)
ÁgarEMS10200
ALVAAbcamAB10241Diluição: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Alexa Flour 488 (Mouse)InvitrogenA11001Diluição: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 488 (Coelho)InvitrogenA110034Diluição: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 594 (Mouse)InvitrogenA11005Diluição: 1/1000 (IF)
Farinha Alexa 594 (Coelho) InvitrogenA11037Diluição: 1/1000 (IF)
Kit de ensaio de amôniaSigma-AldrichMAK-310
Cloreto de amônioSanta CruzSC-202936
Suplemento B27 50xGibco12587010
Molde de baseSakura4216
b-FGFPeprotech100-18B
Biossegurança, CLASSE II, ARMÁRIO DE SEGURANÇAThermoSEGURO 2020
Pipetas calibradasGilsonF167380
CentrifugaEppendorf5702
Colilglicila-fluoresceínaCorning451041
Tampão citrato pH 6,0Bio-óptica15-M103
CK-18Santa CruzSC-51582Diluição: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19Santa CruzSC-6278Diluição: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Microscópio ConfocalZeissLSM880
Luvas de manuseio criogênico e proteção para os olhosCryokit5274
CriostatoLeicaCM 1950
Tubos crioviaisCorning430659
DABRoche11718096001
DAPTSigma-AldrichRolamento A5942
DexametasonaSigma-AldrichD4902
Exibir Tecnologias de células-tronco7923
DMEM F12Gibco31330038
E-CADSanta CruzSC-8426Diluição: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTAInvitrogen15575-020
Microscópio eletrónicoZeissSigma500
Kit ELISAFortis ciências da vida betilE88-129
Kit de incorporação do Embed 812EMS14121
EntellanMerck107961
Eosina Y %1Sigma-AldrichHT110332
EpCAMMiltenyi Biotec130-059-901Diluição: 1/11 (FACS)
EtanolMerck1,00,98,32,511
Soro fetal bovino (FBS)Gibco26010066
Forscolina (FSK)Tocris Biosciene1099
Recipiente de congelamento (Sr. Frosty)Thermo5100-0001
Meio de congelamentoGibco12648010
Pipeta Pasteur de vidroIsolab084.01.001
Glutamamax 100xGibco35050-068
Gluteraldeído %25, grau EMEMS16210-1L
HRP anti-rato de cabraThermo Fisher62-6520Diluição: 1/1000 (IHC)
HRP Anti-Coelho de CabraThermo Fisher31460Diluição: 1/1000 (IHC)
Soro de cabraGibco162-10-072
H2O2Merck107209
HematoxilinaMilliporeHX86017674
HEPES, 1 MGibco15630-056
HNF-4&alfa;AbcamAB55223Diluição: 1/50 (IHC)
Gelo e gelo secocaseirocaseiro
Incubadora (65 &graus; C)Nü veEN 400
IsopropanolSigma-Aldrich24137
Leu15 Gastrin I humanoSigma-AldrichG9145
LuminómetroBerthold TechLB 960
Master mix Biossistemas Aplicados43676659
Matriz de matrigel, qualificada por hESCCorning354277
Matriz matrigel, sem vermelho de fenolCorning356231
MetanolMerck179337
Tubos de microcentrífugaAxygen321-02-501
MicroscópioZeissAXIO VERT A1
Lâmina de micrótomoPenaS35, C35
mTeSR1Tecnologias de células-troncoSC-05850
Placas de cultura de suspensão de vários poçosSarstedt83,39,21,500
Suplemento N2 100xGibco17502048
N-acetilcisteínaSigma-AldrichRolamento A9165
Formalina tamponada neutra %10TekkimTK.60161.05001
NicotinamidaSigma-AldrichN0636
Aminoácido não essencial (NEAA)Gibco11140050
OUTUBROTecido-Tek4583
Tetróxido de ósmioEMS19110
Kit de Ensaios P450-Glo PromegaV9001
Pap-canetaSigmaZ377821-1EA
ParafinaTekkimTK.200661.01002
Kit de coloração PASAbcamAB150680
PBSLonzabe17-516
Penicilina/estreptomicinaGibco15630-056
Ácido fosfotungusticoTed Pella19402
Auxiliar de pipetaAxygenMotopet-1
Leitor de placas varioskan flash Thermo5250040
Prolongar o Mountant AntifadeInvitrogenPág. 36980
Óxido de propileno, grau EMEMS20401
Sistema de PCR em tempo realBiossistemas Aplicados7500 Rápido 
Ativina A humana recombinanteR& D338-AC-050
BMP7 humano recombinantePeprotech120-03
EGF humano recombinantePeprotechAF-100-15
FGF10 humano recombinantePeprotech100-26
FGF19 humano recombinantePeprotech100-32
HGF humano recombinantePeprotech100-39
Inibidor de Rho quinase, dicloridrato de Y-27632Sigma-AldrichY0503
Tubo de 1,5 mL livre de RNase/DNaseAxygen31108101
Pontas de filtro livres de RNase / DNaseSarstedt703031255
Micrótomo RotativoLeicaRM 2245
RPMI 1640 MédioGibco61870010
Meio condicionado por Rspo1Caseiro
Slide mestreBio-óptica15-MEQ001
Sorenson' s Tampão de fosfatoEMS11600-10
SpinnerThermoMINHA RODADA 6
Pipetas serológicas estéreisFalcão357543
de tecidoLeica3802240
PodãoLeicaEM TRIM2
Tritão X-100Thermo Científico28314
Enzima TrypLE ExpressGibco12605010
Tripsina-EDTAGibco25200-056
UltramicrótomoLeicaEM UC7
UranilacetatoEMS22400
VórticeThermo88880018
Proteína de fusão Wnt Surrogate-FcImunoPrecisoN001
XilenoSigma 16446
ZO-1Invitrogen40-2200Diluição: 1/400 (IF)

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  2. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  3. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  4. Takebe, T., et al. Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).
  5. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  6. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  7. Ramli, M. N. B., et al. Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease. Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).
  8. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3(1997).
  9. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).
  10. Akbari, S., et al. long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling. Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).
  11. Meisenheimer, P. L., et al. Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition. Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).
  12. Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).
  13. Cali, J. J., et al. Luminogenic cytochrome P450 assays. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  15. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  16. Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
  17. Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. Next-generation liver medicine using organoid models. Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345(2019).
  18. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. Histological organization in hepatocyte organoid cultures. American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).
  19. Shinozawa, T., et al. High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids. Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).
  20. Wu, F., et al. Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Organoides Endod rmicosC lulas Tronco PluripotentesTecnologia de OrganoidesModelagem de Doen asDiferencia o de Hepat citosEnriquecimento por FACSC lulas EpCAM PositivasSecre o de AlbuminaAtividade do Citocromo P450

Artigos relacionados