Estimulação Multimodal Automatizada e Gravação Neuronal Simultânea de Múltiplos Pequenos Organismos

Resumo

Apresentamos um método para a estimulação química flexível e multimodal e registro da atividade neural simultânea de muitos vermes Caenorhabditis elegans . Esse método usa microfluídica, hardware e software de código aberto e análise automatizada supervisionada de dados para permitir a medição de fenômenos neuronais como adaptação, inibição temporal e crosstalk de estímulos.

Resumo

Indicadores fluorescentes de cálcio codificados geneticamente têm contribuído muito para a nossa compreensão da dinâmica neural, desde o nível de neurônios individuais até circuitos cerebrais inteiros. No entanto, as respostas neurais podem variar devido à experiência prévia, estados internos ou fatores estocásticos, gerando a necessidade de métodos que possam avaliar a função neural em vários indivíduos ao mesmo tempo. Enquanto a maioria das técnicas de registro examina um único animal de cada vez, descrevemos o uso de microscopia de campo largo para ampliar registros neuronais para dezenas de Caenorhabditis elegans ou outros organismos de escala submilimétrica ao mesmo tempo. Hardware e software de código aberto permitem grande flexibilidade na programação de experimentos totalmente automatizados que controlam a intensidade e o tempo de vários tipos de estímulos, incluindo estímulos químicos, ópticos, mecânicos, térmicos e eletromagnéticos. Em particular, os dispositivos de fluxo microfluídico fornecem controle preciso, repetível e quantitativo de estímulos quimiossensoriais com resolução de tempo inferior a um segundo. O pipeline de análise de dados semi-automatizado do NeuroTracker extrai respostas neurais individuais e populacionais para descobrir mudanças funcionais na excitabilidade e dinâmica neural. Este artigo apresenta exemplos de medidas de adaptação neuronal, inibição temporal e crosstalk de estímulos. Essas técnicas aumentam a precisão e a repetibilidade da estimulação, permitem a exploração da variabilidade populacional e são generalizáveis para outros sinais fluorescentes dinâmicos em pequenos biossistemas, desde células e organoides até organismos inteiros e plantas.

Introdução

Técnicas de imagem com cálcio têm permitido o registro não invasivo da dinâmica neural in vivo em tempo real utilizando microscopia de fluorescência e indicadores de cálcio codificados geneticamente, expressos em células-alvo ^1,2,3. Esses sensores normalmente usam uma proteína fluorescente verde (GFP), como a família do peptídeo GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), para aumentar a intensidade da fluorescência após a ativação neuronal e níveis elevados de cálcio intracelular. A imagem do cálcio tem sido especialmente poderosa no nematoide C. elegans para examinar como neurônios e circuitos neurais funcionam em animais vivos e comportados 4,5,6,7,8,9,10, pois sua natureza transparente significa que nenhum processo cirúrgico é necessário para o acesso óptico^{, e} promotores gênicos específicos de células têm como alvo a expressão para as células de interesse. Essas técnicas frequentemente utilizam dispositivos microfluídicos, que fornecem ambientes precisamente controlados para estudar fenômenos biológicos, químicos e físicos em pequena escala física^11,12. Dispositivos microfluídicos são abundantes para medir a atividade neural, com novos projetos continuamente em desenvolvimento, e eles são prontamente fabricados no laboratório de pesquisa. No entanto, muitos delineamentos aprisionam um único animal de cada vez, limitando o rendimento experimental ^7,9,13. As respostas neurais geralmente variam substancialmente entre os animais devido a diferenças na experiência anterior, estados internos, como estresse ou fome, ou fatores estocásticos, como níveis de expressão gênica. Essas diferenças estabelecem a necessidade de métodos que possam simultaneamente estimular e observar muitos animais e extrair informações dos^indivíduos4.

Além disso, certos fenômenos neuromodulatórios tornam-se aparentes apenas sob condições específicas de estimulação, como a inibição temporal¹⁴, que se refere à supressão breve das respostas quando a estimulação ocorre em rápida sucessão. Sistemas eletrofisiológicos podem conduzir a atividade neural através de um amplo espaço de estímulo para esse fim, modulando, por exemplo, a corrente de pulso elétrico, tensão, frequência, forma de onda, ciclo de trabalho e tempo de trens de estímulos periódicos. A estimulação indireta por estímulos naturalmente detectados ou sistemas optogenéticos se beneficiaria de uma amplitude semelhante de mecanismos de controle. Atualmente, muitos estímulos naturais são apresentados de forma simples "on-off", como apresentação e remoção de odores, utilizando sistemas comerciais que têm demorado a agregar flexibilidade. No entanto, microcontroladores de baixo custo agora podem automatizar a entrega de vários tipos de estímulos de uma maneira personalizável às necessidades dos pesquisadores. Combinados com a microfluídica, esses sistemas alcançaram o objetivo de aumentar o rendimento experimental e a flexibilidade, permitindo que respostas neurais a uma variedade de estímulos precisos fossem medidas simultaneamente em muitos animais ^4,6. A estimulação multimodal pode ser usada para interrogar ainda mais os circuitos neuronais, como por exemplo, monitorando mudanças na excitabilidade neural ao estimular consistentemente antes, durante e após uma perturbação ortogonal, como a exposição a drogas⁴. Os benefícios de sistemas de microscopia abertos e de baixo custo são claros para o avanço da pesquisa científica, mas, na prática, a necessidade de fornecimento de peças, construção e validação de desempenho pode impedir a adoção dessas técnicas.

Este protocolo visa atenuar alguns destes desafios técnicos. Considerando que protocolos anteriores enfocaram o uso de dispositivos microfluídicos e estimulação básica 9,15,17^, descrevemos aqui a construção e o uso de um sistema flexível, automatizado e multimodal de liberação de estímulos para imagens neurais em C. elegans ou outros pequenos organismos utilizando dispositivos microfluídicos previamente descritos⁴. O sistema de código aberto é programado através de arquivos de texto simples para definir os experimentos, e o programa de análise de dados NeuroTracker extrai semi-automaticamente os dados de atividade neural dos vídeos do microscópio. Demonstramos esse sistema com exemplos de avaliação de inibição temporal, desinibição e crosstalk de estímulos utilizando o neurônio quimiossensorial AWA, que se despolariza em resposta a diferentes odores alimentares ou em resposta à luz ao expressar canais iônicos optogenéticos sensíveis à luz ^5,6.

Protocolo

1. Equipamento de imagem neural

NOTA: Veja Lawler e Albrecht¹⁵ para obter instruções detalhadas sobre a construção do sistema de imagem e estimulação, que controla o tempo de iluminação do microscópio, a aquisição da imagem e a entrega de estímulos (Figura 1). Um controlador de estímulo Arduino Nano de baixo custo aciona as válvulas fluídicas através de sinais digitais para um controlador de válvulas e controla a iluminação optogenética através de sinais de tensão analógicos para um controlador LED. Outros estímulos, como motores de vibração e aquecedores térmicos, podem ser controlados por meio de sinais digitais ou analógicos. O controlador de estímulo sincroniza a estimulação e a gravação das imagens por meio de sinais de câmera, conforme especificado pelo software de controle de microscópio Micro-Manager de código aberto (μManager)¹⁶. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes, equipamentos e organismos utilizados neste protocolo.

1. Montar o equipamento de imagem neural, incluindo um microscópio de epifluorescência com óptica GFP, uma câmera sCMOS com um sinal de saída de exposição digital e um controlador de estímulo¹⁵.
2. Conecte o controlador de estímulo aos sistemas desejados através de sinais digitais ou analógicos. Para os exemplos apresentados a seguir, são utilizados os seguintes sistemas:
   1. Use um controlador de válvula para estimulação química. Conecte o controlador de válvula a válvulas solenoides ou pinças fluídicas (Figura 1)¹⁵.
   2. Use um LED vermelho de 615 nm e um controlador para estimulação optogenética, montado acima do estágio do microscópio.
3. Configure o computador com o software de controle do microscópio, crie uma Predefinição de Configuração com as configurações do equipamento e garanta o funcionamento adequado do controle do estímulo¹⁵.

2. Fabricação de dispositivos microfluídicos

NOTA: Ver Lagoy et ^al.17 para obter informações detalhadas sobre a obtenção ou fabricação dos moldes mestres e a produção, uso e limpeza dos dispositivos microfluídicos. Essas etapas são resumidas a seguir.

1. Obter ou fabricar um molde mestre usando o arquivo de projeto microfluídico fornecido (albrechtlab.github.io/microfluidics)¹⁷. Para adultos jovens de C. elegans, certifique-se de que a altura do canal seja de 55-70 μm.
2. Combine a base PDMS e o agente de cura em uma proporção de 10:1 por peso e misture completamente com pipetas de transferência.
3. Desgaseifique por 30-60 min em um exsicador a vácuo até que as bolhas desapareçam.
4. Coloque o molde mestre em uma placa de Petri grande (150 mm de diâmetro) e despeje o PDMS desgaseificado até uma profundidade de 4-5 mm (~100 g). Inspecione e remova qualquer poeira ou bolhas com uma pipeta de transferência.
5. Asse a 65 °C em uma prateleira nivelada do forno por 3 h até a noite.
6. Uma vez curado, use um bisturi para cortar o PDMS do molde e uma lâmina de barbear reta para separar os dispositivos.
7. Perfure os orifícios de entrada e saída usando um punch dérmico de 1 mm e limpe-os com dH 2 O, etanol e novamente comdH₂O. Seque o dispositivo em uma corrente de ar (ver Figura 2A).
8. Limpe ambos os lados do dispositivo PDMS com fita adesiva, removendo qualquer poeira ou detritos.
9. Preparar as lâminas de vidro para completar o dispositivo microfluídico conforme descrito¹⁷. Faça furos de entrada na lâmina superior usando uma broca de diamante e torne a lâmina inferior hidrofóbica por exposição a vapores TFOCS ou aplicando tratamento de vidro repelente de água (Figura 2B).
10. Monte o sanduíche do dispositivo PDMS de vidro em uma braçadeira (Figura 2C).

3. Preparo dos animais

1. Obter ou criar animais com indicadores de cálcio geneticamente codificados expressos nos neurônios de interesse.
   Observação : por exemplo, linha NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p: :d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) expressa GCaMP e o canal catiônico sensível à luz vermelha Chrimson no par de neurônios sensoriais AWA⁶. Ambos os transgenes são integrados ao genoma para uma expressão estável em todos os animais.
2. Um dia antes da experimentação, colocar pelo menos 20 larvas L4 em estágio de C. elegans por experimento em uma placa de ágar meio de crescimento de nematódeo (NGM) semeada com um gramado OP50 E. coli. Quando mantido a 20 °C, sincronizará os animais selvagens na fase de adulto jovem no dia seguinte.
   NOTA: Para transgenes de matriz, escolha animais usando um estereoscópio de fluorescência para garantir a expressão de transgenes nos animais escolhidos.

4. Preparação da solução

1. Preparar 1x S tampão basal (100 mM NaCl e 0,05 M KPO₄, pH 6,0) a partir de uma solução estoque de 10x.
2. Preparar tampão tetramisole 1 mM diluindo 1 M em 1x S Basal. Use este buffer paralítico para preparar todos os estímulos. Um experimento normalmente usa cerca de 150 mL.
3. Adicionar 0,1-1 μg/mL de fluoresceína aos reservatórios tampão "controle" para visualizar o fluxo.
4. Crie soluções de estímulo por diluição seriada até a concentração final desejada. Por exemplo, crie uma diluição de 10−⁷ de atrativo de diacetil criando primeiro um estoque de 10⁻³ .
   NOTA: Uma pequena quantidade de fluoresceína (0,1–1 μg/mL) pode ser adicionada ao estímulo ou solução tampão para verificar o tempo do estímulo, mas a concentração deve ser mínima para evitar artefatos na fluorescência neural.

5. Preparação do dispositivo microfluídico

NOTA: Veja Reilly et ^al.9 para um protocolo de vídeo mostrando a geração do reservatório, a configuração do dispositivo e o carregamento dos animais. Ver também Lagoy et ^al.17 para um protocolo escrito incluindo muitas dicas úteis.

1. Prepare três ou mais reservatórios de fluidos. Para cada um, anexe um reservatório de seringa de 30 mL ou 60 mL, uma seringa de priming de 3 mL e um stub de agulha a uma válvula Luer de três vias (Figura 2D). Conecte a agulha à tubulação de microfuro equipada com um tubo de metal na extremidade. Rotule os reservatórios, monte-os em um rack acoplado a um suporte de anel e preencha-os com o buffer ou fluidos de estímulo correspondentes (Figura 2E).
2. Desgaseifique o dispositivo microfluídico montado em um exsicador a vácuo por ~1 h.
3. Encha e remova as bolhas de ar da tubulação do reservatório usando a seringa de escorvamento. Encha a tubulação de saída com tampão.
4. Retire o dispositivo microfluídico do vácuo e insira rapidamente a tubulação de saída e injete o fluido através do dispositivo até que uma gotícula saia de uma entrada.
5. Nessa entrada, use uma conexão "drop-to-drop"¹⁷ para inserir o tubo de entrada fluídico correspondente (Figura 2F). Certifique-se de que as gotas de líquido estejam presentes na tubulação de entrada e no orifício da porta do dispositivo para evitar a introdução de uma bolha.
6. Injete mais líquido da saída, conecte o próximo tubo de entrada e repita até que todas as entradas estejam cheias. Insira um pino de bloqueio sólido em todas as entradas não utilizadas e na porta de carregamento do worm.
7. Inicie o fluxo abrindo as válvulas Luer de entrada e saída. Inspecione o dispositivo em busca de vazamentos nas entradas e na base de vidro. Inspecione o dispositivo em busca de bolhas dentro dos canais de fluxo ou entradas usando o software de captura de imagem do microscópio no modo ao vivo.
   NOTA: Se houver bolhas, aguarde até que elas sejam absorvidas pelo material do PDMS.

6. Carregamento de animais

NOTA: Ver Lagoy et ^al.17.

1. Transfira animais adultos jovens para uma placa de ágar NGM sem sementes usando uma "picareta" com ponta de arame.
2. Inundar a placa com aproximadamente 5 mL de tampão basal 1x S para que os animais estejam nadando.
3. Desenhe os vermes para uma seringa de carga (seringa de 1 mL ou 3 mL com tubo anexado que tenha sido pré-preenchida com 1x S Basal).
   1. Usando um estereoscópio, mova a extremidade da tubulação abaixo da superfície líquida com uma mão para cada animal desejado e desenhe-a para dentro da tubulação usando a seringa segurada na outra mão.
   2. Desenhe os vermes apenas para dentro da tubulação, não para a seringa.
      NOTA: A tubulação normalmente contém apenas cerca de 100 μL. Os animais podem ser expelidos para uma área local e, em seguida, atraídos novamente para a tubulação com um pequeno volume.
4. Feche a linha de saída, remova o pino de carregamento do worm e conecte a seringa de carregamento do worm ao dispositivo usando uma conexão drop-to-drop.
5. Fluir suavemente os animais para dentro da arena, estabelecer fluxo tampão e permitir até 1 h para imobilização por tetramisole.
   NOTA: Durante o período de imobilização, certifique-se de que apenas o fluido tampão entre na arena. Os reservatórios de estímulo e controle podem ser desligados durante esse período, mas abertos, e verificam o fluxo correto antes de executar as tentativas de estimulação.

7. Estimulação automatizada e registro neuronal

1. Crie um arquivo de texto de definição de estímulo chamado "User Defined Acquisition Settings.txt" com um editor de texto (por exemplo, Bloco de Notas) contendo as configurações de estimulação para a aquisição automatizada de imagens (veja exemplos na Figura 3). As configurações são divididas em duas seções:
   1. Configurações de aquisição do microscópio: Defina o tipo de experimento (Single-Stimulus ou Multi-Pattern), o tempo de exposição e excitação, a duração e os intervalos do teste e salve o diretório.
   2. Configurações de estimulação: Definir os parâmetros de controle de estímulo. Um "comando de estimulação" especifica as ações que ocorrem em determinados quadros de vídeo com a sintaxe , onde os códigos das letras são A = válvula1, B = válvula2, C = válvula3, L = luz LED; Além disso, maiúsculas = ativadas e minúsculas = desativadas. A intensidade do LED é definida com a letra código "i" e um valor de 0 (desligado) a 255 (brilho máximo).
      NOTA: O valor de intensidade do LED de 0 a 255 define a tensão analógica de saída de 0 V a 5 V. O controlador de corrente usado aqui tem uma escala de intensidade linear, e outros devem ser calibrados com um medidor de potência leve.
      1. Para um experimento de estímulo único com apenas um comando de estimulação repetido, use o formato da Figura 3A.
      2. Para um experimento Multi-Pattern com múltiplos comandos de estimulação, use o formato na Figura 3B. Inclua uma "Sequência de Padrões" de dígitos que represente a ordem dos padrões de estímulo. Para cada padrão, insira um comando de estimulação em uma linha separada.
         NOTA: Uma sequência pseudoaleatória ou sequência m pode ser útil para investigar a dependência da história do estímulo.
2. Execute o software de controle do microscópio. Verifique se todas as entradas fluídicas estão abertas, se o fluxo está conforme desejado dentro da arena (ver Figura 2H) e se os neurônios de interesse estão em foco dentro da janela ao vivo.
3. Feche a janela ao vivo e execute o script "MultiPattern_RunScript.bsh" dentro do software.
   NOTA: É útil executar um experimento de teste sem animais para verificar o fluxo e a estimulação adequados. A substituição de uma concentração diferente de fluoresceína para cada fluido de estímulo pode ajudar a visualizar e documentar novos padrões de estímulo.
4. Após a experimentação, desmonte o dispositivo microfluídico e lave todas as superfícies, tubulações e reservatórios com água.
   NOTA: Todos os componentes podem ser reutilizados dezenas de vezes se mantidos limpos. Certifique-se de que reservatórios, tubulações e dispositivos microfluídicos sejam mantidos úmidos ou totalmente secos em uma corrente de ar para evitar a cristalização do sal, que pode entupir e é difícil de remover. Os dispositivos podem ser mantidos em etanol para esterilização, mas devem ser totalmente secos antes da reutilização (>1 h a 65 °C)¹⁷.

8. Análise de dados utilizando o NeuroTracker

NOTA: NeuroTracker 4,18,19 é um plugin de software ImageJ/FIJI²⁰ para rastrear a intensidade de fluorescência de vários neurônios e animais^, mesmo quando eles se movem durante os testes. Este plugin salva dados como arquivos de texto com a posição de cada neurônio e intensidade de fluorescência corrigida pelo fundo (F). Os dados de fluorescência são normalizados para a fluorescência basal (F 0), por exemplo, a média de vários segundos antes da estimulação, como Δ F/F 0 = (F -F 0)/F ₀, que pode ser calculada em média entre as populações.

1. Instale scripts do NeuroTracker conforme as instruções (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
2. Execute o NeuroTracker clicando em Plugins | Rastreamento | NeuroTracker.
3. Selecione a pasta que contém o arquivo . Arquivos de vídeo TIF a serem rastreados e selecione as configurações desejadas.
   Observação : se apenas um subconjunto dos arquivos de vídeo devem ser rastreados, selecione o intervalo numérico dos arquivos para analisar no prompt. As configurações de rastreamento padrão são apropriadas para animais não móveis com resolução de 250 pix/mm. Ajuste os parâmetros proporcionalmente para outras resoluções. Consulte o Guia do Usuário¹⁹ para obter mais informações sobre configurações.
4. Defina o limiar de intensidade de forma que os neurônios fiquem visíveis para seleção (Figura 4).
5. Abra as janelas de controle Brilho/Contraste (B/C) e Limite usando a Imagem | Ajustar menu.
6. Na janela B/C , ajuste os controles deslizantes Mínimo e Máximo até que os neurônios estejam claramente distinguíveis (Figura 4A).
7. Na janela Limite , marque Fundo escuro e Não redefinir intervalo.
8. Deslize o controle deslizante do quadro para observar o movimento do neurônio e as mudanças de intensidade, observando quaisquer animais a serem excluídos do rastreamento, como devido à sobreposição com outros animais.
9. Identifique os neurônios para rastreamento.
10. Para cada animal, ajuste o nível de limiar de tal forma que a área de limiar vermelha acima do neurônio seja visível em todos os quadros antes, durante e após a estimulação.
11. Clique no neurônio para registrar sua posição e nível de limiar.
12. Repita o ajuste e a seleção do limiar para cada animal e neurônio a ser rastreado. Consulte a Figura 4C para obter um bom exemplo de nível de limite e a Figura 4D,E para obter exemplos acima e abaixo do limite. Os neurônios previamente selecionados são indicados por uma pequena caixa.
13. Quando todos os neurônios estiverem selecionados, pressione a barra de espaço para iniciar o rastreamento.
    NOTA: Para obter exemplos adicionais do NeuroTracker, consulte as referências anteriores ^4,19.
14. Monitore o processo de rastreamento de cada animal e faça as correções necessárias.
15. Se o NeuroTracker pausar, ele perdeu o neurônio. Clique novamente no neurônio, ajustando o nível de limiar conforme necessário.
16. Se a caixa de integração saltar para outro animal próximo ou estrutura não neuronal, pressione a barra de espaço para pausar, mova o controle deslizante de volta para o primeiro quadro errôneo e clique novamente na localização correta do neurônio.

9. Exploração e visualização dos dados

NOTA: O script de análise MATLAB é usado para processamento e visualização de dados e para gerar PDFs de resumo para cada análise.

1. Execute o arquivo "NeuroTrackerSummary_pdf.m" no MATLAB e selecione a pasta que contém os arquivos de texto de dados do NeuroTracker.
2. Aguarde a produção de um PDF resumido, permitindo a verificação do processo de rastreamento (Figura 5). Os animais são identificados por um número (Figura 5A), e as respostas neurais de cada animal e ensaio podem ser visualizadas para avaliar a variabilidade populacional (Figura 5B).
3. Use a função "databrowse.m" para explorar os dados neurais, por exemplo, agrupando por número de ensaio (Figura 5C), por número de animais (Figura 5D), por padrão de estimulação ou por outra categoria.

Resultados

Apresentamos vários exemplos de padrões de estímulos que avaliam diferentes fenômenos neurais, incluindo inibição temporal, adaptação e desinibição. A inibição temporal é a supressão momentânea de uma resposta neural à apresentação de um segundo estímulo que ocorre logo após a apresentação inicial¹⁴. Para testar esse fenômeno, em um experimento de pulso pareado, oito padrões consistindo de dois pulsos odorantes de 1 s separados por um intervalo que variava de 0 s a 20 s foram apre...

Discussão

Neste protocolo, descrevemos um sistema de microscopia de acesso aberto para a avaliação de fenômenos de atividade neural usando a entrega temporalmente precisa de diferentes padrões de estímulo. A plataforma microfluídica fornece estímulos repetíveis enquanto mantém dezenas de animais no campo de visão do microscópio. Poucos pacotes de software de microscopia comercial permitem a fácil programação de vários padrões de temporização de estímulos, e aqueles que o fazem geralmente exigem a entrada manual de cada padrão ou f...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
cepas bacterianas
E.  coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	Cat# OP50
Modelos experimentais: Organismos/cepas
C.  cepas elegans expressando GCaMP (e, opcionalmente, Chrimson) em neurônios desejados	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ou autores correspondentes do trabalho publicado	NZ1091, por exemplo
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanodiona	Sigma-Aldrich	Cat# B85307	diacetil, exemplo químico estímulo
Cloreto de cálcio, CaCl2	Sigma-Aldrich	Cat# C3881
Fluoresceína, Sal de sódio	Sigma-Aldrich	Cat# F6377
Repelente de água de vidro	Rain-X	Cat #800002250	tratamento hidrofóbico de vidro (uso único)
Cloreto de magnésio, MgCl2	Sigma-Aldrich	Cat# M2393
Ágar Meio de Crescimento de Nematóides (NGM)	Genesee	Cat #: 20-273NGM
Placas de Petri (60  mm)	Tritech	Cat #T3305
Poli (dimetil siloxano) (PDMS): Sylgard 184	Dow Chemical	Cat# 1673921
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	Cat# P5655
Fosfato de potássio dibásico	Sigma-Aldrich	Cat# P8281
Cloreto de sódio, NaCl	Sigma-Aldrich	Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil)triclorossilano (TFOCS)	Gelest	CAS# 78560-45-9	tratamento hidrofóbico de vidro (durável)
Software e algoritmos
Arduino IDE	Arduino	https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager	Micro-manager	https://micro-manager.org/
Software de controle de microscópio	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker software de análise de dados	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Microscópio Automatizado e Sistema de Estimulação
Axio Observer.A1 microscópio invertido configurado para epifluorescência (cubos de filtro GFP, 5&vezes; objetiva ou similar)	Zeiss	Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS Iluminador LED	Excelitas Cat	#XYLIS
Orca Flash 4.0 Câmera digital sCMOS	Hamamatsu	Cat #C11440-22CU
Arduino nano	Arduino Cat	#A000005
Válvula de isolamento diapragma em miniatura de 3 vias (LQX12)	Parker	Cat #LQX12-3W24FF48-000	Válvula 1: Controle
2 vias normalmente fechadas (NC) Válvula de aperto	Bio-Chem Valve Inc	Cat #075P2-S432	Válvula 2:
Válvula de aperto de 3 vias	NResearch	Cat #161P091	Valve 3: Stimulus seleção
LED e controlador de estimulação optogenética (615 nm)	Mightex	Cat #PLS-0625-030-S e #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 controlador de válvula digital/manual	AutoMate Scientific	Cat #01-18
Fios e conectores	vários	Consulte a Fig. 2 do Protocolo Cell STARS (Lawler, 2021)
Preparação do dispositivo microfluídico
Cortador rotativo de velocidade variável Dremel 4000	Dremel	Cat #F0134000AB	Defina a velocidade para 5k RPM para cortar vidro
Estação de trabalho de ferramentas rotativas de furadeira Dremel	Dremel	Cat #220-01
	Dremel	Cat #7134
Slide de vidro, 1  mm de espessura	VWR	Cat #75799-268
Scriber de vidro (Diamond scriber)	Ted Pella	Cat #54468
Luer torneira de 3 vias	Cole-Parmer	Cat #EW-30600-07
Luer 23 G agulha romba	VWR	Cat #89134-100
Dispositivo microfluídico	Correspondente autor ou fabricação a partir de arquivos CAD associados a este artigo	N/A
Grampo de dispositivo microfluídico	Warner Instruments (ou oficina de máquinas)	P-2
Tubulação microfluídica, 0.02″ ID	Cole-Parmer	Cat #EW-06419-01
Tubo 19 G, 0.5″	Gato de tubo pequeno New England	#NE-1027-12