Artigo de método

Preparo de Matrizes 3D Descelularizadas de Músculo Esquelético de Camundongos Fetais para Cultura Celular

DOI:

10.3791/65069

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3 de março de 2023

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1Centre for Ecology, Evolution and Environmental Changes and Global Change & Sustainability Institute, Department of Animal Biology, Faculty of Sciences, University of Lisbon

Neste artigo

Resumo

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Neste trabalho, um protocolo de decelularização foi otimizado para obter matrizes descelularizadas do músculo esquelético fetal de camundongos. Os mioblastos C2C12 podem colonizar essas matrizes, proliferar e diferenciar-se. Este modelo in vitro pode ser utilizado para estudar o comportamento celular no contexto de doenças musculares esqueléticas, como as distrofias musculares.

Resumo

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A matriz extracelular (MEC) desempenha um papel crucial no fornecimento de suporte estrutural para as células e na transmissão de sinais que são importantes para vários processos celulares. Modelos bidimensionais (2D) de cultura de células simplificam demais as complexas interações entre células e a MEC, pois a falta de um suporte tridimensional completo (3D) pode alterar o comportamento celular, tornando-as inadequadas para a compreensão de processos in vivo . Deficiências na composição da MEC e nas interações célula-MEC são importantes contribuintes para uma variedade de diferentes doenças.

Um exemplo é a distrofia muscular congênita LAMA2 (LAMA2-CMD), onde a ausência ou redução funcional das lamininas 211 e 221 pode levar a hipotonia grave, detectável no nascimento ou logo após o nascimento. Trabalhos anteriores usando um modelo murino da doença sugerem que seu início ocorre durante a miogênese fetal. O presente estudo teve como objetivo desenvolver um modelo 3D in vitro que permita o estudo das interações entre as células musculares e a MEC muscular fetal, mimetizando o microambiente nativo. Este protocolo utiliza músculos profundos das costas dissecados de fetos de camundongos E18.5, tratados com tampão hipotônico, detergente aniônico e DNase. As matrizes decelularizadas resultantes (dECMs) retiveram todas as proteínas da MEC testadas (laminina α2, lamininas totais, fibronectina, colágeno I e colágeno IV) em comparação com o tecido nativo.

Quando os mioblastos C2C12 foram semeados sobre essas dECMs, eles penetraram e colonizaram as dECMs, o que apoiou sua proliferação e diferenciação. Além disso, as células C2C12 produziram proteínas da MEC, contribuindo para o remodelamento de seu nicho dentro das dECMs. O estabelecimento desta plataforma in vitro fornece uma nova abordagem promissora para desvendar os processos envolvidos no aparecimento da LAMA2-CMD, e tem o potencial de ser adaptada a outras doenças musculares esqueléticas onde deficiências na comunicação entre a MEC e as células musculares esqueléticas contribuem para a progressão da doença.

Introdução

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A matriz extracelular (MEC) é um dos principais constituintes dos tecidos, representando seu componente não celular. Essa estrutura tridimensional (3D) não apenas fornece suporte físico para as células, mas também desempenha um papel crucial nos processos bioquímicos envolvidos no desenvolvimento dos organismos1. A formação de uma MEC tecido-específica ocorre durante o desenvolvimento, como resultado das complexas interações entre as células e seus nichos, influenciadas por diversos estímulos intra e extracelulares. A MEC é uma estrutura altamente dinâmica que sofre rearranjos químicos e mecânicos de forma espaço-temporal e impacta diretamente o destino dascélulas2. Uma das características mais notáveis da MEC é sua diversidade funcional, pois cada MEC tecidual apresenta uma combinação única de moléculas que fornecem diferentes topologias e propriedades adaptadas às células que contém1.

A sinalização e o suporte da MEC são cruciais para o desenvolvimento e a homeostase e, quando interrompidos, podem levar a múltiplas condições patológicas 3,4. Um exemplo é a distrofia congênita deficiente em LAMA2 (LAMA2-CMD), que é a forma mais comum de distrofia muscular congênita. O gene LAMA2 codifica a cadeia α2 da laminina, que está presente na laminina 211 e na laminina 221, e quando mutada pode levar à LAMA2-CMD 5. A laminina 211 é a principal isoforma encontrada na membrana basal que envolve as fibras musculares esqueléticas. Quando a laminina 211 é anormal ou ausente, a ligação entre a membrana basal e as células musculares é rompida, levando ao aparecimento da doença6. Pacientes com LAMA2-CMD apresentam um fenótipo leve a grave, dependendo do tipo de mutação no gene LAMA2.

Quando a função da proteína α2 da laminina é afetada, os pacientes podem experimentar hipotonia muscular grave ao nascimento e desenvolver inflamação crônica, fibrose e atrofia muscular, levando a uma redução da expectativa de vida. Até o momento, nenhum tratamento direcionado foi desenvolvido e as abordagens terapêuticas limitam-se a aliviar os sintomas da doença7. Portanto, a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes envolvidos no aparecimento dessa doença é crucial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticasapropriadas6,8. Trabalhos anteriores utilizando o camundongo dyW 9, modelo para LAMA2-CMD, sugerem que o início da doença inicia-se no útero, especificamente durante a miogênese fetal10. Uma melhor compreensão de como o defeito da miogênese fetal emerge seria um divisor de águas na geração de novas abordagens terapêuticas para LAMA2-CMD.

Sistemas in vitro fornecem um ambiente controlado para o estudo de interações célula-célula e célula-MEC, mas os modelos de cultura 2D carecem da complexidade dos tecidos nativos. A descelularização dos tecidos produz arcabouços acelulares de MEC específicos para o estágio de desenvolvimento e tecido que mimetizam com mais precisão o microambiente celular natural em comparação com modelos 2D e arcabouços artificiais/sintéticos. As matrizes decelularizadas (dECMs) têm o potencial de preservar as pistas moleculares e mecânicas do tecido hospedeiro, tornando-as melhores modelos alternativos para o entendimento de processos in vivo11.

Existem várias técnicas, reagentes e condições que podem ser utilizadas para a descelularização12,13. Neste estudo, um protocolo de descelularização para o coração fetal de camundongos, descrito por Silva et al.14,15, é adaptado ao músculo esquelético fetal de camundongos e retém todos os componentes da MEC testados (laminina α2, lamininas totais, fibronectina, colágeno I e colágeno IV). O protocolo inclui três etapas: lise celular por choque osmótico (tampão hipotônico), dissolução da membrana plasmática e dissociação proteica (dodecil sulfato de sódio a 0,05% [SDS]) e destruição enzimática do DNA (tratamento com DNase). Até onde sabemos, este é o primeiro protocolo estabelecido para a descelularização do músculo esquelético fetal de camundongos.

Para utilizar este sistema 3D in vitro para o estudo do LAMA2-CMD, é crucial manter a cadeia α2 da laminina após a decelularização. Portanto, um protocolo de otimização foi implementado onde diferentes detergentes (SDS e Triton X-100) e concentrações (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% e 0,5%) foram testados (dados não mostrados). A escolha ideal para remoção celular e preservação da proteína α2 da laminina foi SDS a 0,05%. Células C2C12, uma linhagem bem estabelecida de células mioblásticas16,17, foram usadas para semear as dECMs. Essas células invadem a dMEC, proliferam e se diferenciam no interior desses arcabouços, sintetizando novas proteínas da MEC. A produção bem-sucedida deste modelo in vitro 3D oferece uma nova abordagem para a compreensão dos processos moleculares e celulares envolvidos na miogênese fetal, no início da LAMA2-CMD, e pode ser estendida a outras doenças musculares onde a comunicação entre a MEC e as células musculares esqueléticas é interrompida.

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Protocolo

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Todas as metodologias descritas foram aprovadas pela Comissão de Bem-Estar Animal (ORBEA) da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa e pela Direção-Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022), e estão em conformidade com a Diretiva Europeia 2010/63/UE.

1. Preparação de tampões e reagentes de decelularização

NOTA: Todas as soluções utilizadas durante o protocolo de descelularização devem ser esterilizadas por autoclavagem e armazenadas por até 3 meses, salvo indicação em contrário.

  1. Preparar solução salina tamponada com fosfato 10x (10x PBS) adicionando cloreto de sódio (NaCl) a 137 mM, cloreto de potássio (KCl) a 2,68 mM, fosfato de potássio-dihidrogênio (KH 2 PO 4) a 8,1 mM e dissódico-hidrogênio-fosfato di-hidratado (Na 2 HPO4) a 1,47 mM à água desmineralizada (dH2O) eajustar o pH para 6,8. Adicione 100 mL de 10x PBS a 900 mL de H2O desmineralizado para gerar 1x PBS. Autoclave e armazenamento em temperatura ambiente (TR). Adicionar solução estoque estéril de penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL de penicilina e 10 mg/mL de estreptomicina [caneta/estreptococo]) a uma concentração final de 1% antes do uso.
  2. Preparar o tampão hipotónico dissolvendo 1,21 g de Tris(hidroximetil)aminometano (Tris base) e 1 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em 1 L de dH2O (10 mM Tris base 0,1% EDTA). Use um agitador magnético até dissolver e ajuste o pH para 7,8 com NaOH/HCl. Esterilizar em autoclave e armazenar em RT. Adicionar caneta/strep a uma concentração final de 1% antes de usar.
  3. Preparar o tampão de lavagem hipotónico dissolvendo 1,21 g de Tris base em 1 L de dH2O (10 mM Tris base). Use um agitador magnético até dissolver e ajuste o pH para 7,8 com NaOH/HCl. Autoclave e armazenar em RT. Adicione caneta/strep a 1% antes de usar.
  4. Preparar o tratamento com detergente aniónico adicionando 0,05 g de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 100 ml de tampão de lavagem hipotónico para produzir uma solução de tratamento SDS a 0,05%. Filtrar através de um filtro de membrana de 0,22 μm. Armazene na RT por até 1 mês.
    NOTA: A solução de SDS não deve ser autoclavada, pois o SDS precipita e degrada após a autoclavagem.
  5. Preparar a solução de tratamento DNase dissolvendo 1,21 g de Tris base em 0,5 ml de dH 2 O e adicionar1 ml de cloreto de magnésio 1 M (MgCl2). Ajustar o pH para 7,8 com NaOH/HCl. Autoclave e armazenar em RT. Adicionar DNase I antes de usar (50 U/mL).

2. Coleta de amostras

NOTA: Camundongos selvagens C57/BL6 foram utilizados no estudo. Todas as técnicas foram conduzidas em capela de fluxo laminar sob condições estéreis.

  1. Eutanásia de camundongos fêmeas adultas prenhes no dia embrionário (E) 18,5 de prenhez utilizando inalação de isoflurano seguida de deslocamento cervical. Submeter os camundongos à dissecção terminal para extrair os fetos.
    1. Borrifar o abdómen do rato com etanol a 70%.
    2. Com o uso de pinça cirúrgica e tesoura, levantar uma prega de pele no abdome inferior e fazer uma incisão em U para expor a cavidade abdominal18.
    3. Coletar os cornos uterinos contendo os fetos E18.5 cortando os ovidutos e o colo do útero e transferi-los imediatamente para uma placa de Petri com PBS 1x gelado com caneta/strep 1% 1%.
    4. Retirar rapidamente os fetos do útero e dos tecidos extraembrionários e eutanasiá-los por decapitação com tesoura18.
  2. Transfira um feto de cada vez para uma placa de Petri com 1x PBS gelado. Usando um microscópio estéreo, remova a pele e corte os membros. Do lado ventral, corte a caixa torácica e remova o esterno e os órgãos subjacentes.
  3. Vire o dorsal do tronco fetal para cima. Remova a porção cervical da coluna vertebral, os depósitos de gordura dorsal e o tecido conjuntivo no topo dos músculos profundos das costas.
  4. Use pinça cirúrgica para ancorar a caixa torácica e raspe e desconecte cuidadosamente os músculos profundos das costas dos tecidos circundantes usando um microbisturi10. Esse procedimento resulta no isolamento de duas peças musculares por feto (esquerda e direita), ambas compostas primariamente pelos músculos longuíssimo e iliocostal, incluindo alguns músculos transversoespinhal e elevador costar.
  5. Armazenar as amostras de músculo em 1x PBS com caneta/strep a 1% a 4 °C para armazenamento de curto prazo (<1 semana), ou a -80 °C por períodos mais longos.
    NOTA: Use amostras recém-coletadas para obter melhores resultados. Amostras congeladas por longos períodos (>3 meses) apresentam menor eficiência de decelularização e maior degradação proteica. Massas musculares epaxiais foram usadas para os experimentos de decelularização, mas outros músculos (por exemplo, músculos dos membros) podem ser processados para descelularização usando o mesmo protocolo.

3. Descelularização do músculo esquelético fetal

OBS: Todas as técnicas foram conduzidas em capela de fluxo laminar sob condições estéreis. Para obter uma representação esquemática detalhada, consulte a Figura 1A. Todos os passos foram realizados com agitação em um agitador orbital com diâmetro de 120 mm (165 rpm) a 25 °C, salvo indicação em contrário. Adicionar 1% de caneta/strep às soluções antes de usar. Ao remover as soluções, aspirar cuidadosamente para evitar o aprisionamento da amostra na pipeta.

  1. Dia 1 - Preparar aproximadamente 2 mm x 1 mm x 1 mm (~3,5 mg) fragmentos de tecido das massas musculares epaxiais. Adicionar 3 mL de tampão hipotônico com caneta/strep a 1% a cada poço de uma placa de 12 poços e adicionar um fragmento de tecido muscular inteiro por poço.
    1. Incubar os fragmentos de tecido em tampão hipotônico com agitação por 18 h (durante a noite) (O/N).
  2. Dia 2 - Aspirar o tampão hipotônico com pipeta de ponta fina e lavar as amostras 3 x 1 h com 3 mL de PBS 1x cada vez com agitação.
    1. Incubar as amostras por 24 h com 3 mL de solução detergente SDS 0,05% com agitação.
      NOTA: (CHECK POINT) Após a incubação em SDS, as amostras devem ter aparência transparente. As amostras apresentam uma consistência semelhante à gelatina e, portanto, são mais propensas a aderir à pipeta ao remover os líquidos.
  3. Dia 3 - Retirar a solução detergente SDS com pipeta de ponta fina e lavar os fragmentos de tecido 3 x 20 min com 3 mL de tampão de lavagem hipotônico cada vez com agitação.
    NOTA: (PONTO DE PAUSA) As amostras podem ser mantidas em tampão de lavagem hipotônico a 4 °C por 18 h (O/N). Certifique-se de que o SDS seja bem removido durante as etapas de lavagem, pois o SDS residual pode ser citotóxico.
    1. Incubar os fragmentos de tecido durante 3 h com 2 ml de solução de DNase com agitação a 37 °C.
    2. Remover a solução de DNase com uma pipeta de ponta fina e lavar os fragmentos de tecido 3 x 20 min com 3 mL de PBS 1x cada vez com agitação. Por fim, lave O/N com agitação (60 rpm).
      NOTA: Após o tratamento com DNase, as dECMs tornam-se pegajosas devido à presença de resíduos de DNA. Portanto, a lavagem cuidadosa é necessária.
    3. Armazenar as dECMs em 1x PBS com caneta/strep a 1% a 4 °C até a recelularização (<1 semana). Para outros usos, conservar a -80 °C.

4. Avaliação da qualidade da decelularização

NOTA: A quantificação de DNA, a coloração DAPI/verde de metila e a coloração com faloidina foram realizadas para avaliar a presença de conteúdo celular residual após a descelularização. Análises imunoistoquímicas e de western blot foram realizadas para avaliar a retenção de proteínas-chave da MEC após a descelularização.

  1. Quantificação do DNA presente na dECM
    NOTA: As dECMs devem ser comparadas com o tecido nativo para detectar a presença de DNA.
    1. Antes da descelularização, pesar um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL em balança digital de alta precisão. Antes de transferir a amostra muscular para o tubo, remova todos os 1x PBS restantes usando uma toalha de papel. Pesar o tubo com a amostra. Calcular o peso húmido das amostras utilizando a equação (1):
      Peso úmido da amostra = tubo de pesocom amostras -peso do tubo vazio (1)
    2. Descelularizar as amostras seguindo o protocolo descrito na seção 3.
    3. Colocar as amostras em tubos de microcentrífuga de 2 mL.
      NOTA: As amostras podem ser mantidas a -20 °C até à extracção e quantificação do ADN.
    4. Realizar extração de DNA das dECMs e amostras de tecido nativo usando um kit baseado em coluna de spin. Adicione o tampão de digestão de acordo com as instruções do fabricante.
    5. Homogeneizar as amostras em um moinho de contas duas vezes por 2,5 min cada vez (virando os suportes) usando um grânulo de carboneto de tungstênio por tubo (use suportes de tubo refrigerados).
    6. Adicionar proteinase K e incubar O/N com agitação lenta a 56 °C.
    7. Prossiga com o protocolo conforme descrito nas instruções do fabricante.
    8. Eluir com o tampão fornecido pelo fabricante e centrifugar 2 x 1 min a ≥6.000 x g, cada vez a 4 °C para aumentar o rendimento de DNA.
      NOTA: O ADN pode ser armazenado a -20 °C até à quantificação.
    9. Quantifique o DNA presente nas amostras usando um kit de detecção de dsDNA fluorescente seguindo as instruções do fabricante.
    10. Normalizar o conteúdo de DNA como nanogramas de DNA por miligrama de peso úmido original da amostra.
    11. Analise os dados por meio do teste t de Student bicaudal e expresse como média ± erro padrão da média (EPM).
  2. Imuno-histoquímica
    NOTA: As soluções 1, 2 e 3 e a solução fixadora devem ser preparadas antes do uso e podem ser mantidas congeladas por até 6 meses. Todos os anticorpos e corantes utilizados e respectivas diluições estão listados em Tabela 1.
    1. Preparação de soluções
      1. Preparar a solução fixadora adicionando 2 g de paraformaldeído (PFA), 8 g de sacarose e 24 μL de CaCl 1 M 2 a 77 mL de 0,2 M Na 2 HPO 4 e 23 mL de 0,2 MNaH 2 PO 4, a um volume final de 200 mL adicionando dH2 O.Ajuste o pH para7,4.
      2. Preparar tampão fosfato 0,12 M adicionando 13,5 g de Na 2 HPO 4 e3,2 g de NaH 2 PO 4 a 1 L de dH2O. Ajustar o pH para7,4.
      3. Preparar a solução 1 adicionando 4 g de sacarose a 100 ml de tampão fosfato 0,12 M.
      4. Preparar a solução 2 adicionando 15 g de sacarose a 100 ml de tampão fosfato 0,12 M.
      5. Preparar a solução 3 adicionando 15 g de sacarose e 7,5 g de gelatina a 100 ml de tampão fosfato 0,12 M. Aqueça a 37 °C até dissolver a gelatina.
      6. Preparar solução-mãe verde metilo (pó verde metílico a 2% dissolvido em dH2O)19.
    2. Imunodetecção
      1. Fixar as amostras utilizando a solução fixadora durante, pelo menos, 4 h a 4 °C.
      2. Lave as amostras 2x por 10 min com 1x PBS.
      3. Conservar O/N, ou durante 1 dia, na solução 1 a 4 °C.
      4. Lavar e manter O/N ou durante 1 dia na solução 2 a 4 °C. Deixe as amostras aquecerem até RT.
      5. Incubar durante 3 h na solução 3 a 37 °C. Conservar a solução extra 3 a 37 °C para ser utilizada mais tarde.
      6. Molde recipientes pequenos (2 cm x 1 cm x 1 cm) em papel alumínio. Coloque uma fina camada de solução 3 no recipiente moldado e deixe assentar. Colocar as amostras sobre a solução solidificada 3 e cobrir com a solução quente 3. Orientar as amostras e deixá-las solidificar. Marque o local na solução solidificada 3 com uma caneta colorida.
      7. Congelar colocando os recipientes na superfície de isopentano seco refrigerado a gelo ou azoto líquido.
      8. Usando o composto de temperatura de corte ideal (O.C.T.), fixe os cubos de gelatina congelados contendo as amostras no suporte de criostato.
      9. Seccione os cubos de gelatina congelados e transfira os cortes de tecido para as lâminas. Deixe secar por 60 min.
      10. Use um marcador hidrofóbico para traçar uma linha ao redor das seções.
      11. Lave as lâminas 3 x 10 min em 1x PBS.
      12. Cobrir os cortes com albumina de soro bovino (BSA) a 1%, soro caprino a 1% e Triton X-100 a 0,05% diluído em 1x PBS (solução de bloqueio) por 30 min (etapa de bloqueio).
      13. Diluir os anticorpos primários em solução de bloqueio e cobrir as secções. Incubar O/N a 4 °C numa caixa fechada, com papel húmido, para evitar que as secções sequem.
      14. Lave as lâminas 3 x 10 min com 1x PBS.
      15. Diluir os anticorpos secundários em solução de bloqueio e cobrir as secções. Incubar por 1,5 h no TR no escuro.
        NOTA: Evite a exposição à luz para evitar a degradação do fluoróforo.
      16. Lave as lâminas 3 x 10 min com 4x PBS.
        NOTA: Maior concentração de PBS pode ser usada quando um fundo forte está presente.
      17. Submergir as lâminas em solução DAPI (5 μg/mL 1,4-diazabiciclo-2,2,2-octano em Triton X-100/1x PBS a 0,1%) por 30 s cada.
      18. Enxágue em 1x PBS.
      19. Monte as seções em meio anti-desbotamento (50 mg/mL de n-propil-galato em 1x PBS:glicerol [1:9]) e sele com uma lamínula. Conservar a 4 °C até observação e aquisição das imagens em microscópio de fluorescência20.
        NOTA: Para os experimentos de imunohistoquímica in toto , o mesmo protocolo (ver etapas 4.2.2.12-4.2.2.18) foi usado, exceto que as amostras foram previamente fixadas em PFA a 4% diluído em 1x PBS por 3 h na RT. A coloração de DNA foi realizada pela adição de verde de metila à solução de anticorpos secundários. Todos os anticorpos e corantes utilizados, e suas respectivas diluições, estão listados na Tabela 1. As amostras foram então montadas em meio anti-desbotamento entre duas lamínulas separadas por anéis de aço, coladas com cera de abelha, e pilhas de imagens de 100 μm foram adquiridas usando um microscópio confocal21.
  3. Análise de Western blot
    NOTA: Todos os anticorpos utilizados e respectivas diluições estão listados em Tabela 1.
    1. Preparação de soluções
      1. Preparar o tampão de carregamento 2x SDS-PAGE adicionando 20 mL de glicerol, 4 g de SDS e 0,2 mL de azul de bromofenol a 80 mL de solução base de Tris 100 mM. Ajuste o pH para 6,8. Adicione ditiotreitol fresco (DTT) antes de usar.
      2. Preparar o tampão de lavagem salino tamponada Tris com solução de Tween 20 (TBST) adicionando 2,4 g de Tris base, 8,8 g de NaCl e 1 mL de Tween-20 a dH2O para um volume final de 1 L. Ajuste o pH para 7,4-7,6 usando HCl.
      3. Preparar o tampão de corrida (RB) de 10x adicionando 30,2 g de Tris base, 144,2 g de glicina e 10 g de SDS a 1 L de dH2O. Antes de usar, adicione 100 mL de 10x RB a 900 mL de dH2O para preparar 1x RB (solução de trabalho).
        NOTA: Enquanto 10x RB pode ser armazenado no RT por vários meses, 1x RB pode ser reutilizado em execuções diferentes.
      4. Preparar o tampão de transferência (TB) adicionando 5,82 g de Tris base, 2,93 g de glicina e 0,5 g de SDS a 800 mL de dH2O. Depois que os componentes estiverem dissolvidos, adicionar 200 mL de metanol. Frio a 4 °C.
        NOTA: O TB deve ser preparado na hora antes de cada uso.
    2. Extração de proteínas
      1. Coletar músculos epaxiais de camundongos E18.5 e colocá-los imediatamente em um tubo de microcentrífuga (2 mL) contendo 2x tampão de carregamento SDS-PAGE com TDT recém-adicionado (100 mM TDT). Processo E18.5 dECM da mesma forma.
      2. Adicione um grânulo de carboneto de tungstênio por tubo. Homogeneizar 2x em um moinho de contas por 2,5 min cada vez (vire as montagens).
      3. Sonicar as amostras por 5 min em um banho de ultrassom.
      4. Aquecer as amostras durante 10 min a 50 °C.
      5. Centrifugar as amostras a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C.
      6. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mL.
      7. Quantificar a proteína usando um espectrofotômetro de microvolume.
      8. Conservar a -20 °C até nova utilização.
    3. Eletroforese em gel de poliacrilamida
      1. Use gel de gradiente de acrilamida pré-moldada (4%-20%)
      2. Monte o gel no tanque de eletroforese. Retire o pente com cuidado. Adicione 1x RB até a linha exibida no tanque de eletroforese. Certifique-se de que os poços estão cheios de RB.
      3. Carregar 100 μg de proteína por amostra nos poços. Carga de 12 μL de proteína padrão de alto peso molecular.
      4. Execute por um total de 100 min com tensão constante (10 min a 150 V e 90 min a 185 V).
    4. Transferência
      1. Mergulhe as almofadas de filtro e as esponjas com TB refrigerada (4 °C) enquanto o gel estiver funcionando.
      2. Corte as membranas de difluoreto de polivinilideno até o tamanho do gel. Ativá-los com metanol e lavar com dH2O. Mergulhe no TB.
      3. Monte o de transferência com as esponjas, almofadas de filtro, géis e membranas ativadas de acordo com as instruções do fabricante.
      4. Coloque o no tanque de eletroforese contendo o TB resfriado (em um leito de gelo). Adicione a unidade de resfriamento. Corra por 90 min a 100 V.
      5. Após a transferência, corar com um substituto azul Coomassie para avaliar a qualidade da transferência.
    5. Imunodetecção
      1. Preparar a solução de bloqueio (TBST com 5% de leite desnatado). Incubar as membranas com agitação por 1 h na RT.
      2. Enxágue 3 x 5 s com TBST.
      3. Incubar as membranas O/N com os anticorpos primários diluídos em TBST com BSA a 2% e azida sódica a 0,02% (3 mL por membrana) em câmara fria (4 °C) com agitação.
      4. No dia seguinte, lave 3 x 5 min com TBST.
      5. Incubar as membranas com anticorpos secundários conjugados à horseradish peroxidase (HRP) diluídos em TBST com leite desnatado a 5% (5 mL para cada membrana) por 1 h no TR.
      6. Lave as membranas com TBST 3 x 5 min. Mantenha no TBST até a etapa de detecção.
      7. Visualize a proteína usando um kit de revelação disponível comercialmente. Adicione reagentes de detecção de acordo com as instruções do fabricante. Adquirir imagens das bandas.
      8. Para testar mais de um anticorpo por membrana, após a etapa de detecção, retirar os anticorpos anteriores com três lavagens (5 min cada) usando TBST e repetir os passos 4.3.5.2-4.3.5.7.

Tabela 1: Anticorpos e corantes utilizados na análise imunohistoquímica e western blot e respectivas diluições. Clique aqui para baixar esta tabela.10,22

5. Cultura celular em matrizes decelularizadas

OBS: Todas as técnicas foram realizadas em condições estéreis em capela de fluxo laminar. Todas as incubações foram realizadas a 37 °C e com 5% de CO2.

  1. Preparar o meio de cultura celular, meio Dulbecco's Modified Eagle com glicose alta com glutamina estável e com piruvato de sódio (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de pen/strep (meio de cultura completo).
  2. Colocar as dECMs em uma placa de Petri em PBS 1x com caneta/strep a 1% em uma capela de fluxo laminar e separá-las em pedaços de aproximadamente 500 μm x 500 μm x 250 μm, usando um microbisturi e uma pinça.
    NOTA: Os dECMs têm uma textura macia e, portanto, muitas vezes é mais fácil usar pinças para separá-los em pedaços aproximadamente do mesmo tamanho em vez de cortá-los com o microbisturi.
  3. Transferir os fragmentos para uma placa de 96 poços (três ou quatro pedaços por poço) com 200 μL de meio de cultura completo, previamente aquecido a 37 °C. Incubar por 2 h na incubadora.
  4. Adicionar 500 μL de tripsina a um frasco T25 semeado com células C2C12 subconfluentes (~70%). Ressuspender em 1 mL de meio completo.
  5. Adicionar 10 μL da ressuspensão a 10 μL do corante azul de Tripano e carregar em um hemocitômetro. Conte e calcule o número de células e confirme a viabilidade celular.
  6. Aspirar o meio da placa de 96 poços contendo as dECMs e adicionar 200 μL de meio de cultura completo contendo 50.000 células C2C12 viáveis.
  7. Incubar por 2 dias e, em seguida, com pinças, transferir as dECMs (com as células) para uma placa de 48 poços com 400 μL de meio de cultura completo. A cada 2 dias, aspirar cuidadosamente o meio com uma micropipeta para evitar que as dECMs se desprenda do fundo do poço e adicione meio fresco até o 8º dia.
    NOTA: As matrizes são mantidas por 2 dias em placas de 96 poços para promover a adesão das células C2C12 às dECMs, e são então transferidas para uma placa de 48 poços para permitir o acesso a um maior volume de meio com nutrientes. Os dECMs devem aderir ao fundo dos poços.
  8. Para o experimento de diferenciação, substituir o meio de cultura completo por meio de diferenciação (DMEM suplementado com 2% de soro de cavalo e 1% de pena/estreptococo) no 8º dia, seguido de incubação em meio de diferenciação por 4 dias até o 12º dia.

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Resultados

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O objetivo do protocolo de decelularização é produzir dECMs que se assemelhe à composição do tecido nativo. Para determinar a eficácia do processo de decelularização, vários métodos foram empregados, incluindo exame da morfologia tecidual, medição dos níveis de DNA, coloração para F-actina e análise dos principais componentes da MEC usando técnicas de imunohistoquímica e western blotting. Especificamente, cinco componentes principais da MEC do tecido muscular esquelético foram analisados.

Ao l...

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Discussão

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A MEC é uma rede complexa de macromoléculas que está presente em todos os tecidos e desempenha um papel crucial na regulação do comportamento e função celular2. A MEC atua como um arcabouço físico para as células se ligarem e fornece pistas que modulam ativamente os processos celulares, como proliferação, motilidade, diferenciação e apoptose. Assim, a formação e manutenção adequadas da MEC são essenciais tanto para o desenvolvimento quanto para a homeostase1.

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pela Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; contrato nº 23049), pelo projeto MATRIHEALTH e pela unidade cE3c UIDB/00329/2020. Agradecemos ao nosso doador Henrique Meirelles que optou por apoiar o Projeto MATRIHEALTH. Este trabalho beneficiou das infraestruturas do Centro de Microscopia da Faculdade de Ciências, um nó da Plataforma Portuguesa de BioImagem (referência PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), e agradecemos a Luís Marques pela sua assistência na aquisição e processamento de imagens. Finalmente, agradecemos a Marta Palma pelo apoio técnico e à nossa equipa de investigação pelas generosas contribuições.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de Cultura de Células de 12 Poços, Plana, TC, Abdos EstérilLabwareP21021
4′,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridratoMerckD8417
4– Placa de Cultura de Células de 48 Poços de Gel Pré-moldado Mini-PROTEAN TGXBio-Rad4561093
Plana, TC, Material deLaboratório AbdosP21023
Placa de Cultura de Células de 96 Poços, Plana, TC, Material de LaboratórioAbdosP21024
Albumina de Soro Bovino, Fração VNZYtechMB04601
BX60Olympus
Criostato CM1860 UVLeica
DitiotreitolThermoFisherR0862
DMEM glicose alta com glutamina estável com piruvato de sódioBiowestL0103-500
DNase IPanReac AppliChemA3778
DNeasy Blood & Kit de lenços Qiagen69506
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Merck108418
Soro fetal bovinoBiowestS1560-500
Pipeta de transferência de ponta finaThermoFisher15387823
Soro de cabraBiowestS2000-100
Hera Guard Flow CabinetHeraeus
Heracell 150 Incubadora de CO2Thermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein StandardInvitrogen
Horse Serum, origem neozelandesaGibco16050122
HRP-α- Rabbit IgGabcamab205718
HRP-α- Rat IgGabcamab205720
HRP-α- Mouse IgGabcamab205719
ImageJ v. 1.53t
Metil VerdeSigma-Aldrich67060
MM400 Tissue LyserRetsch
NanoDrop ND-1000 Espectrofotômetro ThermoFisher
Paraformaldeído, 16% p/v aq. soln., sem metanolAlfa Aesar043368-9M
Penicilina-Estreptomicina (100x) GRiSPGTC05.0100
Faloidina Alexa 488 Thermo Fisher Sci.A12379
Placa de Petri de Poliestireno 60x15mm com aberturas (estéril)Greiner Bio-One628161
Qubit dsDNA HS kitThermo ScientificQ32851
Qubit™ 3 FluorômetroInvitrogen15387293
S6E Zoom Microscópio Estéreo Leica
Dodecil Sulfato de SódioMerck11667289001
SuperFrost® Lâminas de adesão PlusThermo Scientific631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Substrato QuimioluminescenteThermo Scientific15626144
TCS SPE microscópio confocalLeica
Tris-(hidroximetil) aminometano (base Tris) ≥ 99%VWR Chemicals28811.295
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Solução Azul de Tripano, 0.4%Gibco15250061
Tripsina-EDTA (0.05%) em DPBS (1X)GRiSPGTC02.0100
TWEEN 20 (Solução 50%)ThermoFisher3005
WesternBright PVDF-CL rolo de membrana (0.22µ m)AdvanstaL-08024-001
α-Colágeno Iabcamab21286
&alfa;-Colágeno IVMilliporeAB756P
α-Colágeno IVSanta Cruz Biotecnologiasc-398655
&alfa;-FibronectinaSigmaF-3648
&alfa;-Laminina &alfa; 2 SigmaL-0663
α-MHCD.S.H.B.MF20
α-Mouse Alexa 488Sondas MolecularesA11017
α-Mouse Alexa 568Sondas MolecularesA11019
α-pan-LamininaSigmaL- 9393
&alfa;-fosfo-histona 3Merk Millipore06-570
α-Rabbit Alexa 568Sondas MolecularesA21069
α-Rabbit Alexa 488Sondas MolecularesA11070
α-Rato Alexa 488Sondas MolecularesA11006
20%, Estéril Estéril Microscópio de fluorescência

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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