Um modelo animal apropriado é necessário para entender os mecanismos patológicos subjacentes à estenose da valva aórtica (SVA) e avaliar a eficácia das intervenções terapêuticas. O presente protocolo descreve um novo procedimento para o desenvolvimento do modelo de AVS em coelhos através de uma lesão direta por balão in vivo.
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Artigo de método
Modelo de estenose da valva aórtica de coelho induzida por lesão direta por balão
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Modelos animais estão emergindo como uma ferramenta importante para entender os mecanismos patológicos subjacentes à estenose da valva aórtica (SVA) devido à falta de acesso a fontes confiáveis de valvas aórticas humanas doentes. Dentre os vários modelos animais, os modelos de coelhos AVS são um dos mais comumente utilizados em estudos com grandes animais. No entanto, os modelos tradicionais de AVS em coelhos requerem um longo período de suplementação dietética e manipulação genética para induzir estenose significativa na valva aórtica, limitando seu uso em estudos experimentais. Para abordar essas limitações, um novo modelo de EVA em coelhos é proposto, no qual a estenose é induzida por uma lesão direta por balão na valva aórtica. O presente protocolo descreve uma técnica bem sucedida de indução de SVA em coelhos brancos da raça Nova Zelândia (NZW), com procedimentos passo a passo para o preparo, o procedimento cirúrgico e os cuidados pós-operatórios. Este modelo simples e reprodutível oferece uma abordagem promissora para o estudo do início e progressão da EVA e fornece uma ferramenta valiosa para investigar os mecanismos patológicos subjacentes da doença.
Introdução
É cada vez mais reconhecido que o uso de modelos animais apropriados pode contribuir para uma melhor compreensão dos mecanismos patológicos subjacentes à estenose valvar aórtica (SVA) devido à falta de acesso a fontes confiáveis de valvas aórticas humanas doentes associadas à progressão da estenose aórtica (EA). Dentre os vários modelos animais para o estudo da SVA, o coelho é um dos modelos de SVA de grande porte mais comumente usados, e o modelo de coelho com SVA é induzido por meio de suplementação de colesterol/vitamina D2 ou manipulação genética 1,2,3,4.
Embora os modelos de SVA em coelhos tenham fornecido informações significativas sobre o desenvolvimento e a progressão da SVA, ainda permanece desafiador induzir a SVA de forma consistente e reprodutível, como visto em nossos experimentos preliminares.
Além de modelos animais induzidos por dieta e geneticamente suscetíveis, um novo modelo de SVA foi estabelecido por meio de lesão mecânica direta em camundongos 5,6. O modelo de lesão mecânica induz com sucesso estenose aórtica e representa um modelo AVS simples e reprodutível em camundongos selvagens. Até onde sabemos, não há estudos prévios examinando os efeitos de uma lesão mecânica na valva aórtica em modelos de coelhos. Assim, este estudo fornece um novo procedimento para indução de EVA em coelhos brancos machos da raça Nova Zelândia através de uma lesão direta por balão na valva aórtica, que pode mimetizar com precisão a condição de estenose aórtica valvar. Esse protocolo inclui descrições passo a passo do preparo, do procedimento cirúrgico e dos cuidados pós-operatórios, que são úteis para induzir modelos reprodutíveis de coelhos da SVA.
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Protocolo
Todos os procedimentos de pesquisa com animais foram aprovados e realizados de acordo com a Lei de Bem-Estar dos Animais de Laboratório, o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e as Diretrizes e Políticas para Experimentação Animal fornecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) na Faculdade de Medicina da Universidade Católica da Coreia (número de aprovação: CUMC-2021-0176-05). O presente estudo utilizou coelhos machos da raça Nova Zelândia (NZW), com 3 meses de idade, pesando entre 3,5 e 4,0 kg, os quais foram mantidos em condições padronizadas em gaiolas individuais. Os coelhos foram alimentados com uma dieta normal ou uma dieta enriquecida com 0,5% de colesterol suplementada com 50.000 U de vitamina D2 (ver Tabela de Materiais). O planejamento experimental e os métodos de análise para a indução do modelo de coelhos AVS estão representados na Figura 1.
1. Preparação para a operação
- Certifique-se de que todos os instrumentos médicos e cirúrgicos (consulte a Tabela de Materiais) estejam esterilizados no início da operação.
- Prepare o conjunto de cateteres-balão de dilatação seguindo os passos abaixo.
- Conecte o dispositivo de in-deflação preenchido com uma mistura de soro fisiológico e meio de contraste comercialmente disponível (1:1) à parte luer lock do cateter-balão (ver Tabela de Materiais).
- Encha o balão com solução de insuflação e remova qualquer ar do cateter do balão.
NOTA: Para o presente estudo, a solução de insuflação consistiu de iodixanol a 30% com solução salina a 0,9% (ver Tabela de Materiais). - Verifique a inflação adequada do balão purgando o lúmen do balão com a solução de insuflação.
2. Procedimento cirúrgico para a lesão valvar aórtica
- Administrar uma injeção intramuscular de tiletamina &zolazepam (15 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) (ver Tabela de Materiais) para anestesiar o animal.
OBS: Antes da administração da anestesia, os coelhos foram pré-tratados com injeção subcutânea de glicopirrolato (0,05 mg/kg) como agente anticolinérgico pré-anestésico. O nível adequado de anestesia foi determinado por uma combinação de critérios, incluindo ausência de resposta a uma pinça dos dedos dos pés e uma frequência respiratória constante. - Inserir um cateter intravenoso (IV) de 24 G na veia auricular marginal e conectar um conjunto de infusão com solução salina heparinizada (100 U/kg de heparina).
- Conecte o coelho com um monitor veterinário multiparamétrico (consulte Tabela de Materiais) para monitorar continuamente os sinais vitais, como o sinal de saturação de oxigênio (SpO2), temperatura e pressão arterial.
NOTA: Para o monitoramento da SpO 2, conecte o sensor de SpO2 à língua do coelho. Para o monitoramento da temperatura, insira a sonda no reto do coelho. Para a monitorização da pressão arterial, coloque o manguito no membro anterior. - Colocar o coelho em decúbito dorsal sobre uma mesa cirúrgica equipada com fluoroscopia em arco C (ver Tabela de Materiais) e remover os pelos da área ventral do pescoço com cortadores de pelos de animais (Figura 2A).
- Esterilizar a área da incisão com iodo e cobrir o coelho com toalhas cirúrgicas.
- Posicione o coração do coelho no centro da imagem do arco em C.
NOTA: Todos os pesquisadores devem usar equipamento de proteção com dosímetros termoluminescentes (TLDs) acoplados para reduzir a exposição à radiação durante a realização da cirurgia guiada pelo arco em C.- Ligue o arco em C e selecione o modo fluoroscópico para imagens cardíacas.
- Ajuste a posição do coelho para garantir que o coração esteja no centro do campo de imagem.
- Faça uma incisão longitudinal de aproximadamente 3 cm na pele do pescoço e use tesoura cirúrgica para cortar a fáscia e o tecido adiposo.
- Expor a artéria carótida comum esquerda (ACCE) separando cuidadosamente os músculos até que aproximadamente 3-3,5 cm da ACCE sejam expostos (Figura 2B).
- Ligate a ACEC com um fio de seda 3-0 (ver Tabela de Materiais) na parte superior e final da ACEC exposta para interromper o fluxo sanguíneo.
- Insira um cateter IV de 22 G na ACEC e introduza um fio-guia (0,016 pol., ver Tabela de Materiais) no ventrículo esquerdo (VE) através do cateter IV, garantindo que a ponta do cateter esteja posicionada corretamente no campo de imagem do arco em C.
NOTA: Ao inserir o cateter IV, solte cuidadosamente a sutura da ligadura no caminho até a válvula aórtica para permitir o avanço do cateter. - Retirar o cateter endovenoso, deixando o fio-guia, e colocar uma bainha 4-F (ver Tabela de Materiais) sobre o fio-guia na ACCE para introduzir o cateter-balão (Figura 2C).
NOTA: Após a substituição do cateter IV pela bainha, qualquer ar aprisionado deve ser removido do dispositivo de bainha. - Inserir cuidadosamente o cateter-balão de 8 mm sobre o fio-guia na valva aórtica sob orientação fluoroscópica do arco em C (Figura 2D).
- Colocar a ponta do cateter-balão aproximadamente 1-2 cm distal à valva aórtica e inflar o balão purgando a solução de insuflação com um inflador de pressão a 6 atm.
- Avançar o balão para o ápice do VE e puxá-lo de volta para a saída do VE. Repita esse procedimento cinco vezes e, em seguida, esvazie o balão (Figura 2E, F).
- Repita os passos 2,8-2,9 três vezes para garantir lesão valvar adequada.
- Retirar o cateter-balão e o fio-guia. Remover lentamente a bainha da ACCE e amarrar imediatamente a ACCE com a sutura no caminho até a valva aórtica.
- Limpe a área da incisão com soro fisiológico para remover os coágulos sanguíneos e inspecione o local puncionado em busca de sangramento arterial.
- Feche o músculo e a pele com uma sutura inabsorvível 3-0 e esterilize todos os lados da ferida com iodo.
3. Cuidados pós-operatórios
- Remova os adesivos e clipes de monitoramento e mantenha o coelho em uma incubadora de terapia intensiva.
NOTA: Após a cirurgia, os coelhos foram observados de perto por 1 dia em uma incubadora de terapia intensiva e, em seguida, transferidos para uma gaiola domiciliar. - Controlar a dor pós-operatória com 5 mg/kg de tramadol e 3 mg/kg de cetoprofeno e administrar antibióticos (4 mg/kg de gentamicina) duas vezes ao dia por 3 dias por injeção subcutânea (ver Tabela de Materiais).
NOTA: O tratamento da dor pós-operatória deve seguir as diretrizes veterinárias e da IACUC (por exemplo, opioide, AINE, anestésico local ou combinação). - Alimente-se com uma dieta enriquecida com 0,5% de colesterol com 50.000 U de vitamina D2 (HC + VitD2) por 8 semanas.
4. Ecocardiografia
- Após 8 semanas da lesão com balão, anestesiar o coelho usando o mesmo procedimento descrito no passo 2.1.
- Visualize as valvas aórticas usando cortes transtorácicos bidimensionais e grave imagens em modo M em cortes de eixo curto e eixo longo.
- Coloque o coelho em decúbito dorsal sobre uma mesa de eco.
- Faça a barba na região do peito usando cortadores e creme de depilação.
- Aplique o gel do transdutor de ultrassom (ver Tabela de Materiais) no tórax.
- Ajustar o transdutor para obter a visão paraesternal eixo longo e paraesternal eixo curto da valva aórtica.
- Use imagens em modo M para gravar imagens da válvula aórtica em cortes de eixo longo e eixo curto e salve as imagens para análise posterior.
5. Análise histológica
- Após o ecocardiograma, eutanasiar o coelho administrando-se uma injeção intravenosa de cloreto de potássio (KCl, 3 g/20 mL, 1 mL).
- Abrir a cavidade torácica, colher o coração com a aorta ascendente7 e colocá-lo sobre gelo em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Imergir imediatamente o coração em uma solução de paraformaldeído (PFA) a 4% e incorporá-lo em um bloco de parafina (consulte a Tabela de Materiais).
- Cortar o bloco cardíaco embebido em parafina em cortes de 4 μm de espessura usando micrótomo e corar os cortes com tricrômico de Masson (MT), vermelho de alizarina e von Kossa (ver Tabela de Materiais) para avaliar a deposição de colágeno e a calcificação valvar, respectivamente 8,9.
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Resultados
Modelo de EVA de coelho induzida por lesão valvar aórtica
Para induzir o modelo de EVA de coelhos, coelhos machos NZW pesando 3,5-4,0 kg foram utilizados para este estudo. De acordo com os procedimentos cirúrgicos descritos no passo 2 (Figura 2), o modelo AVS foi estabelecido por lesão valvar aórtica, que resultou em degeneração e calcificação valvar aórtica mecânica. O grupo controle incluiu coelhos alimentados com uma dieta enriquecida com 0,5% de colesterol (colesterol...
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Discussão
Modelos animais de SVA são comumente usados para estudar os aspectos patológicos da SVA, incluindo o início e a progressão da EVA. Este protocolo introduz um novo modelo de EVA de coelho induzida por lesão direta por balão na valva aórtica. Neste estudo, o modelo de lesão valvar aórtica mostrou espessamento e calcificação importantes dos folhetos. Comparada ao modelo de EVA leve induzida pela suplementação dietética, a valva aórtica no modelo de lesão direta por balão foi seletivamente lesada, levando a cúspides espessad...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse associados a este trabalho.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Research Foundation of Korea (NRF) financiada pelo governo coreano (MSIT) (No. 2020R1A4A3079570), pelo Ministério da Educação (No. 2021R1I1A1A01051425) e pelo Programa de Desenvolvimento Tecnológico Estratégico Industrial (No. 20014873) financiado pelo Ministério do Comércio, Indústria e Energia, República da Coreia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 3-0 Sutura de seda | AILEE | SK312 | |
| 4% paraformaldeído (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Solução vermelha de alizarina | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE | do fio de guia | ASAHI | |
| Yuhan kimberly | 80101-30 | ||
| Dispositivo de deflação de balão | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Monitor veterinário | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Certified Rabbit Diet | Purina | 5322 | 4,7% de óleo de coco hidrogenado, 0,5% de colesterol e 1% Molasse |
| Curadle Smart Incubator | Autoelex | CS-CV206 | Unidade de Terapia Intensiva (UTI) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | Vitamina D2 |
| Fórceps de conjuntiva Fechtner titânio | Instrumento de PRECISÃO MUNDIAL | WP1820 | |
| Fórceps | HEBU | HB203 | |
| Gentamicina | Shin Poong | ||
| Glicopirrolato | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Solução salina normal 500 mL | |
| hematoxilina | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparina | JW farmacêutica | 25.000 U | |
| Conjunto de infusão para uso único | SWOON MEDICAL | ||
| Iodo | Verde farmacêutico | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Solução de inflação (agente de contraste) |
| Cateter IV 22 G | BD | ||
| cateter IV 24 G | BD | 382412 | |
| Cetoprofeno | Seringa SamChunDang | ||
| Luer-Lok 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok 3 mL | Microscópio Médico | ||
| OLYMPUS SZ61 | |||
| Microtomo | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT kit de coloração | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Porta-agulha | Solco | 009-1304 | |
| Porta-agulha com trava e sutura | JEUNGDO BIO & PLANTA | H-1222-18 | |
| Parafina | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Cloreto de potássio 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelúdio Bainha hidrofílica ideal | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | Bainha 4F |
| PTA Cateter de dilatação por balão | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Cateter balão 8.0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| gaze estéril | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| Luvas cirúrgicas | Ansell | Ansell | |
| Bata cirúrgica | Yuhan kimberly | 90002-02 | |
| Tesoura cirúrgica | Nopa, Alemanha | AC020 / 16 | |
| Fita cirúrgica | 3M micopore | 1530-1 | |
| Seringa 1 mL | Shin Chang Medical | ||
| Seringa 10 mL | Shin Chang Medical | ||
| de tecido | Scilav korea | Cas3003 | |
| Transdutor gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Tramadol HCl | |
| Philps | Affiniti 50 | ||
| Kit de coloração Von Kossa | Abcam ab105689 | ||
| Zoletil 50 | Virbac Coréia | Tiletamina e zolazepam |
Referências
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Reimpressões e permissões
