Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kvantifiering av globala histonförändringar efter translationella modifieringar med hjälp av intranukleär flödescytometri i isolerade mikroglia i mushjärna

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65080
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Djavad Mowafaghian Centre for Brain Health, University of British Columbia, 2Graduate Program in Neuroscience, Djavad Mowafaghian Centre for Brain Health, University of British Columbia

Summary

Detta arbete beskriver ett protokoll för kvantifiering av globala histonmodifieringar med hjälp av intranukleär flödescytometri i isolerade hjärnmikroglia. Verket innehåller även det protokoll för isolering av mikroglia som användes för datainsamlingen.

Abstract

Kontroll av genuttryck sker delvis genom modifieringar i kromatinstrukturen, inklusive tillägg och avlägsnande av posttranslationella modifieringar av histonsvansar. Histone post-translational modifications (HPTM) kan antingen underlätta genuttryck eller repression. Till exempel neutraliserar acetylering av histonsvanslysinrester den positiva laddningen och minskar interaktioner mellan svansen och negativt laddat DNA. Minskningen av interaktioner mellan histonsvans och DNA resulterar i ökad tillgänglighet av det underliggande DNA:t, vilket möjliggör ökad tillgång till transkriptionsfaktorer. Acetyleringsmärket fungerar också som en igenkänningsplats för bromodomäninnehållande transkriptionsaktivatorer, vilket tillsammans resulterar i förbättrat genuttryck. Histonmärken kan regleras dynamiskt under celldifferentiering och som svar på olika cellulära miljöer och stimuli. Medan nästa generations sekvenseringsmetoder har börjat karakterisera genomiska platser för enskilda histonmodifieringar, kan endast en modifiering undersökas samtidigt. Med tanke på att det finns hundratals olika HPTM:er har vi utvecklat ett kvantitativt mått på globala HPTM:er med hög genomströmning som kan användas för att screena histonmodifieringar innan vi genomför mer omfattande genomsekvenseringsmetoder. Detta protokoll beskriver en flödescytometribaserad metod för att detektera globala HPTM och kan utföras med hjälp av celler i odling eller isolerade celler från in vivo-vävnader . Vi presenterar exempeldata från isolerade mikroglia i mushjärna för att demonstrera analysens känslighet för att upptäcka globala förändringar i HPTM som svar på en bakterie-härledd immunstimulus (lipopolysackarid). Detta protokoll möjliggör snabb och kvantitativ bedömning av HPTM och kan tillämpas på alla transkriptionella eller epigenetiska regulatorer som kan detekteras av en antikropp.

Introduction

Epigenetik är studiet av de mekanismer som reglerar genuttryck utan att förändra den underliggande DNA-sekvensen. Epigenetisk reglering av genuttryck är dynamisk i celler och kan möjliggöra snabba och samordnade svar på olika miljöstimuli. Den dynamiska regleringen sker delvis på grund av förändringar i kromatinstrukturen på nukleosomnivå, som består av histonproteiner (H2A, H2B, H3, H4) sammansatta till en oktamerkärna tätt lindad av DNA1. Interaktionerna mellan histonproteinerna och DNA:t kan styra tillgängligheten av DNA till transkriptionsmaskineriet, vilket i slutändan kan styra genuttryck och andra aspekter av kromatinbiologi2. Histonproteiner har ostrukturerade svansar som har positivt laddade rester som bildar elektrostatiska interaktioner med den negativt laddade DNA-ryggraden. Dessa interaktioner resulterar i tät packning av DNA och minskad DNA-tillgänglighet. Kovalenta modifieringar av histonsvansarna, så kallade histon post-translational modifications (HPTM), kan reglera dessa interaktioner 3,4. Några av de mest välkarakteriserade HPTM:erna inkluderar histonsvansacetylering och metylering, vilket kan förändra affiniteten hos elektrostatiska interaktioner mellan histonsvansarna och DNA, vilket resulterar i differentiell tillgänglighet till det underliggande DNA:t och rekrytering av transkriptionsfaktorer som känner igen dessa HPTM på specifika platser. HPTM regleras av tre viktiga klasser av enzymer som kallas läsare - som känner igen, författare - som deponerar och suddgummi - som tar bort HPTM. Således kan rekrytering eller upplösning av läsar-, skrivar- eller suddgummienzymer i slutändan förändra landskapet för HPTM och styra kromatinets struktur och funktion, vilket gör deras reglering och avläsning avgörande för att förstå cellulär biologi och funktion 3,4.

Cellerna i det centrala nervsystemet (CNS) är epigenetiskt flexibla eftersom de ändrar sitt transkriptom för att anpassa sig till miljöstimuli. Ackumulerade bevis tyder på att förändringar i epigenomet, såsom DNA-metylering, icke-kodande RNA och HPTM, spelar en viktig roll i minnesbildning och synaptisk funktion5. Att störa HPTM-dynamiken genom manipulation av relevanta läsare, skribenter eller suddgummin kan blockera eller förbättra associativ inlärning och långsiktig potentiering 6,7,8. Mikroglia, den inneboende immuncellen i CNS, reglerar snabbt sitt transkriptom som svar på immunstimulering genom dynamiska förändringar i deras epigenom 9,10,11. Denna höga nivå av anpassning till den lokala hjärnmiljön gör dem svåra att undersöka i ett isolerat sammanhang, eftersom studier har visat att mikroglias epigenom och transkriptom förändras redan efter några timmar i odlingsmedia efter avlägsnande från hjärnmiljön11. Dessutom, eftersom mikroglia bara utgör 10 % av hjärnans celler, saknar mätningar som undersöker förändringar på hela vävnadsnivå sensitivitet och specificitet12,13. Som ett resultat av detta måste mikroglia snabbt isoleras för att undersöka de epigenetiska förändringarna, såsom HPTM-nivåer, ex vivo.

De metoder som vanligen används för att undersöka HPTM inkluderar kromatin-immunoprecipitationssekvensering (ChIP-seq) och klyvning under targets och tagmentationssekvensering (CUT&Tag-seq)4. Även om dessa tekniker är mycket specifika för en enskild HPTM och kan informera om förekomsten av HPTM inom ett specifikt genomiskt sammanhang, kan de bara undersöka en av de många möjliga HPTM inom ett enda experiment11,14 Innan man går vidare med sådana experiment, som kräver en betydande investering i tid och pengar, är det därför mycket värdefullt att begränsa listan över potentiellt intressanta HPTM för vidare undersökning genom att först undersöka förändringar i globala nivåer av HPTM. De två huvudsakliga metoderna för att undersöka globala HPTM-nivåer är immunhistokemi och western blot-analys, men båda metoderna är endast semikvantitativa, har låg genomströmning och kräver ett stort antal vävnadssnitt eller isolerade celler15,16. Således syftade vi till att utveckla en mycket känslig, kvantitativ metod som kunde användas för att undersöka de globala HPTM-nivåerna snabbt och på encellsnivå.

Protokollet som presenteras möjliggör snabb detektion av globala HPTM-nivåer med hjälp av intranukleär flödescytometri. Tidigare studier på cancerceller har motiverat vikten av att undersöka globala nivåer ur ett kliniskt perspektiv17,18. Det är också vanligt att studier använder globala nivåer som en screeningmetod innan man bedömer genomisk lokalisering av specifika HPTM av intresse19,20. För mikroglia är det svårt att bedöma globala nivåer efter isolering på grund av det låga cellutbytet. Pan et al presenterar globala HPTM-nivåer från isolerade mikroglia, där mikroglia från tre djur poolades för att möjliggöra detektion av proteinnivåer med western blot19. Med hjälp av vårt protokoll kan vi upptäcka globala förändringar med mycket lägre cellingångar, vilket möjliggör screening av flera markeringar per djur och eliminerar behovet av att poola prover.

Här beskriver vi ett protokoll för att snabbt detektera HPTM-nivåer via kvantitativ intranukleär flödescytometri i isolerade mikroglia. Även om vi fokuserar specifikt på HPTM-kvantifiering för korthetens skull, kan detta protokoll användas på samma sätt för att kvantifiera globala nivåer av läsar-, skrivar- och suddgummienzymer. Protokollet levereras i två delar: för det första isoleringsmetoden för mikroglia och för det andra den flödescytometribaserade metoden för bestämning av HPTM-nivåer. Isoleringsmetoden ger celler som kan användas för både RNA-isolering och bedömning av HPTM-nivå, vilket gör det möjligt att utvärdera genuttryck och HPTM-nivåer från samma prov. Dessutom kan metoden för HPTM-bedömning användas på andra celltyper som anges i protokollet.

Protocol

Alla djurvårdsprotokoll godkändes av University of British Columbias djurvårdskommitté i enlighet med Canadian Council on Animal Cares riktlinjer.

1. Hjärnans matsmältning för isolering av mikroglia

Figure 1
Figur 1: Enkelt flödesschema över protokollet. Mössen perfunderas först transkardiellt med HBSS och hjärnan dissekeras. Hjärnan dissocieras sedan genom kemisk nedbrytning och mekanisk störning för att resultera i ett enda cellhomogenat. Den immunanrikade fraktionen samlas in via diskontinuerlig densitetsgradient, varefter cellerna färgas för P2RY12. Färgade celler är antingen 1) sorterade via fluorescerande aktiverad cellsortering (FACS) för att leda till RNA-analys eller nedströms proteinanalys och/eller 2) fixerade, permeabiliserade och färgade för intranukleära proteiner. Proteinnivån kvantifieras genom medianfluorescensintensiteten i den kanal som är av intresse och som bestäms med flödescytometri. Lådor färgade i blått är en del av protokollsteg 1) Hjärnans matsmältning för mikrogliaisolering. Lådor färgade i rött är en del av protokollsteg 2) Intranukleär flödesfärgning för analys av proteinuttryck. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Beredning av reagenser
    OBS: Om du planerar en extraktion för att samla in både RNA och celler för HPTM-analys, se avsnitt 1.7.1 för modifieringar för att inkludera transkriptions- och translationshämmare. Detta är dock inte nödvändigt om man bara bedömer proteinsignalen eftersom cellerna i stort sett är vilande när de hålls på is.
    1. Fluorescensaktiverad cellsorteringsbuffert (FACS) (20 ml per prov): Lös upp bovint serumalbumin (BSA) i 1x Hanks balanserad saltlösning (HBSS) för att skapa en 2% BSA-lösning. Lös EDTA till en slutlig koncentration av 1 mM i 2% BSA-lösningen. Sterilisera filtret med ett 0,2 μm filter och förvara vid 4 °C i upp till 1 vecka före användning.
    2. Uppslutningsbuffert (1 ml per prov): Bered en injektionsflaska papain i HBSS till en slutlig koncentration av 20 E/ml i 1 mM L-cystein med 0,5 mM EDTA. Aktivera vid 37 °C i minst 10 minuter eller tills vävnaden är redo att smältas. Strax före användning, tillsätt DNas I till den aktiverade papainlösningen till en slutlig koncentration av 200 E/ml. Förbered detta på experimentdagen och förvara det inte.
    3. Isoton densitetsgradientlösning (5,5 ml per prov): Tillsätt 10x HBSS till gradientmediet med kall densitet till en slutlig koncentration av 1x HBSS, vilket resulterar i en slutlig densitet på 1,117 g/ml. Virvla för att blanda i minst 30 s före användning. Lägg på is fram till användning.
    4. 37 % densitetsgradientlösning (4 ml per prov): Tillsätt isoton densitetsgradient till 1x HBSS för att göra en slutlig koncentration på 37 % med en slutlig densitet på 1,043 g/ml. Tillsätt 20 μL fenolrött för varje ml gradient med 37 % densitet för att göra en rosa lösning för visualisering under skiktning. Vred i minst 30 s före användning. Lägg på is fram till användning.
    5. 70 % densitetsgradientlösning (2 ml per prov): Tillsätt isoton densitetsgradient till 1x HBSS för att göra en slutlig koncentration på 70 % med en slutlig densitet på 1,082 g/ml. Tillsätt 5 μL trypanblått för varje ml medium med 70 % densitet för att göra en blå lösning för visualisering under skiktning. Vred i minst 30 s före användning. Lägg på is fram till användning.
  2. Perfusion och hjärndissektion
    OBS: Perfusionsprotokollet liknar Posel et al. som innehåller videoskildring av mustorakotomi, transkardiell perfusion och avlägsnande av hjärnan21. Här använder vi vuxna C57BL/6J han- och honmöss (10-15 veckor gamla, 20-30 g), men detta protokoll kan användas för att utföra en torakotomi för alla möss. Alla djurförsök måste godkännas av institutionens etiska kommitté innan försök utförs.
    1. Musanestesi: Bedöva möss med 4 % isofluran i 100 % syre tills de har passerat det kirurgiska anestesiplanet, vilket kan bekräftas med ett nyp i tån, eller brist på reflex när man klämmer fast musens fot. Placera musen på rygg och fäst stadigt dess fyra tassar i den kirurgiska dissektionsbrädan som placeras lutad i en plastbricka, se till att nosen sitter fast i isofluorannoskonen. Efter överföringen, se till att djuret fortfarande är förbi det kirurgiska anestesiplanet innan du fortsätter.
    2. Mustorakotami: Ta tag i och lyft bukhuden med hjälp av en pincett och gör ett grunt snitt genom huden och bukväggen för att exponera xyfoiden utan att skada den nedåtgående aortan eller några underliggande organ.
    3. Ta tag i xyfoiden med en pincett och gör laterala snitt under bröstkorgen för att exponera diafragman och levern. Gör försiktiga grunda snitt genom diafragman längs bröstkorgens längd med en fin sax och genom bröstkorgen med hjälp av en vävnadssax och nåla fast bröstbenet på operationsstationen nära mushuvudet för att exponera hjärtat och lungorna för transkardiell perfusion.
    4. Transkardiell perfusion: Förbered en peristaltisk perfusionspump och fäst en 26,5 G nål på ena änden av slangen. Förbered slangen för proceduren genom att föra in ena änden av slangen i en injektionsflaska med kall 1x HBSS och slå på pumpen för att helt fylla slangen med 1x HBSS.
    5. Medan du håller hjärtat med en trubbig pincett, för in spetsen på en 26,5 G nål med den bifogade perfusionsslangen i hjärtats vänstra kammare och gör ett litet snitt i höger förmak. Slå på perfusionspumpen för att försiktigt perfusionera musen med en hastighet av ~2-4 ml/min med minst 15-20 ml kall 1x HBSS.
      OBS: En fullständig perfusion är ofta indicerad när levern börjar rensa blod och får samma färg som hjärtat.
    6. Hjärnborttagning: Halshugg musen med en vävnadsdissekerande sax och gör ett snitt i mittlinjen i hårbotten från nacke till näsa. Dra av hudflikarna åt sidorna för att exponera skallen och ta bort överflödig vävnad och ben i svansänden av skallen med en dissekerande sax.
    7. Skjut försiktigt in ett blad på saxen under skallen i foramen magnum med den vassa sidan mot benet och klipp försiktigt upp mittlinjen mot näsan. Gör sidosnitt vid både skallbasen och nära näsan med dissekerande sax. Med hjälp av en fin pincett kan du liva skallen från mittlinjen till utsidan för att knäcka skallbitarna och exponera hjärnan. Lyft försiktigt upp hjärnan med en spatel och lägg på dissektionspapper.
    8. Hjärndissektion: Placera hjärnan på en bit dissektionspapper fuktat med 1x HBSS ovanpå en stängd petriskål fylld med is. Ta bort lillhjärnan och dela hjärnhalvorna i två delar med ett rent rakblad.
    9. Ta bort hjärnstammen, striatum och den vita substansen från varje halvklot, samtidigt som hippocampus och överliggande cortex hålls intakta. Överför halvkloten som innehåller isolerad cortex och hippocampusvävnad till ett 15 ml rör med 5 ml kall 1x HBSS och håll på is.
      OBS: Det är viktigt att utföra dissektionerna så snabbt som möjligt så att vävnaden förblir kall med högst 2 minuter mellan halshuggning och slutlig placering av dissekerad vävnad i 1x HBSS på is. Om man isolerar mikroglia från flera djur kan hjärnorna lagras på is i 1x HBSS i ~1 timme innan man fortsätter med att bearbeta hela kohorten av djur för matsmältning etc.
  3. Hjärnans matsmältning och homogenisering
    1. Mekanisk och kemisk dissociation: Placera hjärnvävnaden från varje mus och 1 ml matsmältningsbuffert i enskilda petriskålar på is. Använd ett rent skalpellblad och hacka hjärnan ordentligt i små bitar (<1 mm).
    2. Skär av spetsen på en plastöverföringspipett och överför försiktigt var och en av de malda hjärnorna till separata brunnar i en 24-hålsplatta på is. Täck plattan med genomskinlig flexibel film och inkubera på is i 30 min.
      OBS: När den hackas på rätt sätt liknar hjärnvävnaden välhackad vitlök.
    3. Dounce homogenisering: Överför smält hjärnlösning från varje brunn till individuella 7 ml glashomogenisatorer på is, var och en fylld med 5 ml kall FACS-buffert. Sug försiktigt ut varje hjärna med den lösa mortelstöten (A), cirka 30-40 gånger, tills en enda cellsuspension erhålls. Efter att ha duschat med A-stöten, skölj försiktigt med den täta stöten (B) 3-4 gånger för att säkerställa en encellssuspension.
      OBS: Tryck inte ner mortelstöten mer än 3/4 av vägen för att undvika att krossa vävnaden i botten av homogenisatorn. Den slutliga lösningen ska vara ogenomskinlig och mjölkaktig.
      OBS: Om du smälter flera hjärnor i ett enda experiment, tajma överföringen av hjärnsmältan till FACS-bufferten så att varje sample bara är i digestbufferten i 30 minuter. Översmältning kan resultera i klyvning av ytproteiner, vilket minskar antikroppsbindning och signal nedströms.
  4. Erhållande av immunberikat fragment
    1. Fastställande av densitetsgradient: Överför homogenatet från varje hjärna till separata 15 ml polypropenrör och tillsätt 2,125 ml isoton densitetsgradient och toppa till 8,5 ml med FACS-buffert för var och en för att få en slutlig koncentration på 25 % densitetsgradient. Vänd försiktigt upp 15 ml-tuberna 20 gånger så att de blandas ordentligt.
    2. Använd en smalgraderad överföringspipett och lägg försiktigt 4 ml 37 % densitetsgradient till varje rör, var mycket noga med att skapa rena lager. Byt överföringspipetter och lägg försiktigt 2 ml 70 % densitetsgradient (figur 2A). Överför till en centrifug som kyls till 4 °C och centrifugera med 500 x g i 20 minuter med bromsrampen inställd på noll.
    3. Samla in immunberikat fragment: Använd rena överföringspipetter, aspirera försiktigt myelinet från toppen av volymen i 15 ml-röret med en ren överföringspipett och kassera. Samla försiktigt upp det övre fragmentet av densitetsgradienten i ett rent 15 ml polypropenrör med hjälp av en överföringspipett.
    4. Samla försiktigt upp det immunberikade fragmentet (1,5 ml ovanför och 1,5 ml nedanför där 70 % och 37 % densitetsgradientskikten möts) i ett nytt 15 ml polypropenrör (figur 2B). Tillsätt 10 ml FACS-buffert till det immunberikade provet för att späda ut densitetsgradientmediet och vänd försiktigt röret 20 gånger för att blanda ordentligt.
      OBS: Eftersom celler tenderar att fastna på sidorna av röret, se till att samla alla celler i sample under uppsamlingsstegen genom att långsamt cirkla pipetten längs rörets sidor medan du samlar upp vätskan.
    5. Pelletera cellerna i det immunberikade provet genom att centrifugera 15 ml-rören i en 4 °C centrifug vid 500 x g i 10 minuter med nedförsbackens rampbroms inställd på noll. Omedelbart efter slutet av centrifugeringen, ta försiktigt bort supernatanten och lämna cirka 300 μL vätska i 15 ml röret, var försiktig så att du inte stör pelleten (som kanske inte syns).
    6. Samla upp supernatanten i ett annat 15 ml rör för att säkerställa att cellerna pelleterades i spinnet (kassera denna fraktion när verifieringen med cellräkningen för den återsuspenderade pelleten är gjord). Efter att ha suspenderat cellpelleten i 300 μL-volymen med hjälp av en P1000-pipett, räkna cellerna med en hemacytometer för att uppskatta det totala cellutbytet.

Figure 2
Figur 2: Erhållande av det immunberikade fragmentet genom diskontinuerlig densitetsgradient. (A) Hjärnhomogenatet görs till 25 % densitetsmedium, underlägg 4 ml 37 % densitetsmedium färgat rosa via fenolrött och 2 ml 70 % densitetsmedium färgat blått via trypanblått. B) Efter centrifugeringen har fraktionerna separerats. Microglia befinner sig i gränsytan mellan 37 % och 70 % densitetsfragment. Myelinfragmentet är högst upp på 15 ml-röret och kommer att kasseras. Det översta fragmentet samlas in som säkerhetskopia om spinnet misslyckas och inga celler återställs. Om det inträffar kan gradienten upprepas med detta bråk. Den immunanrikade fraktionen samlas upp nedströms. Den nedersta fraktionen som innehåller röda blodkroppar stannar kvar i röret och kasseras. (C) Exempelfigur som visar hela lager. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Extracellulär antikroppsfärgning
    1. Blockering: Överför cellerna till en rundbottnad 96-brunnsplatta på is och centrifugera vid 500 x g med broms för att pelletera cellerna. Ta snabbt bort supernatanten i diskbänken genom att snärta plattan för att göra dig av med supernatanten, lämna cellpelleten intakt i botten av brunnen.
    2. Återsuspendera cellerna i 50 μL FACS-buffert med anti-mus CD16/32 FC-receptorblockerande reagens med hjälp av en P200-pipett (slutlig koncentration 10 μg/ml, spädningsfaktor 1:50) för att förhindra icke-specifik bindning av antikroppar till monocyter eller andra FcR-bärande celler. Inkubera i 10 min på is.
    3. Antikroppsfärgning: Bered lämplig volym av en 2x masterblandning innehållande P2RY12-allophycocyanin (APC; spädningsfaktor 1:50, koncentration 4 μg/ml för en slutlig brunnskoncentration på 1:100, koncentration 2 μg/ml) och violett 525 levande död fläck (utspädningsfaktor 1:50 för en slutlig brunnskoncentration på 1:100). Tillsätt 50 μl av färgblandningen till cellsuspensionen (erhålls efter blockering enligt punkt 1.5.1) och inkubera plattan i 30 minuter i mörker på is.
      OBS: För detta protokoll presenterar vi färgning av cellerna med P2RY12. För det första är P2RY12 en homeostatisk markör för mikroglia som kan nedregleras i vissa sjukdomssammanhang. Till exempel har 5XFAD Alzheimers modellmöss nedreglerade P2RY12-nivåer, vilket kan göra dem svåra att identifiera22. Alternativa betser som kan användas för isoleringen är Tmem119, Cd11b och CD4523. För det andra kan det konjugerade fluorokrom-APC:t justeras för att passa den önskade antikroppspanelen. Att välja en ljus fluorokrom, såsom APC eller PE, kommer dock att bidra till att säkerställa att de positiva och negativa populationerna är lätta att urskilja.
    4. Efter färgning tillsätts 200 μL FACS-buffert direkt i varje brunn för att tvätta cellerna. Centrifugera i 500 x g vid 4 °C för att ta bort supernatanten genom att snärta. Återsuspendera cellerna i 200 μL FACS-buffert med en P200-pipett, centrifugera vid 500 x g vid 4 °C och snärta plattan för att ta bort bufferten från brunnarna.
    5. Förbereda flödeskontroller: Före färgning, separera nödvändiga volymer av celler från varje sample efter blockering i steg 1.5.1 för de nödvändiga flödeskontrollerna.
      OBS: Flödeskontroller krävs för varje experiment för att upprätta grindarna. Flödeskontrollerna kan tas från ytterligare ett djur eller från en bråkdel av var och en av försöksbrunnarna. När du delar celler ska du se till att tilldela tillräckligt många celler per kontroll, eftersom 10 000–30 000 celler per kontroll krävs för att upprätta grindar med hög konfidens.
      1. Det finns tre relevanta flödeskontroller: ingen fläck, levande död och P2RY12 isotypkontroll. För fläckfri kontroll, tillsätt inga antikroppar. I isotypkontrollen P2RY12 behandlas cellerna med viabilitetsfärgämne (1:100) och en isotypkontrollantikropp konjugerad till APC (1:100).
      2. För att förbereda den levande döda kontrollen, alikvotera cellerna i en separat brunn och flytta hälften av cellvolymen till ett 500 μL rör. Placera 500 μL-röret i frysen -80 °C i 5 minuter, följt av placering i 37 °C-inkubatorn i 5 minuter för att döda cellerna. Sätt tillbaka alikvoten av döda celler i den levande döda kontrollbrunnen och färga med ett aminbindande livskraftsfärgämne på violett 525 (utspädningsfaktor 1:100) för att markera döda celler.
        OBS: Protokollet är skrivet för plåtfärgning med en snärtmetod för borttagning av supernatant. Detta kräver dock att supernatanten tas bort omedelbart efter avslutad spinn och snärten måste göras med tillräcklig kraft för att snabbt ta bort supernatanten utan att störa pelleten. Alternativt kan 1,5 ml RNAse/DNas-fria rör användas för färgningen, med följande modifieringar: Överför cellerna till 1,5 ml mikrocentrifugrör och pellets vid 800 x g i 5 minuter vid 4 °C. Aspirera supernatanten med pipetter. Tips: För snabbhet kan en 5 ml överföringspipett med en P200-spets snabbt och exakt aspirera supernatanten. När du suger, kontrollera pelleten. Om pelleten inte är synlig, lämna 50 μL supernatant och justera beräkningarna därefter. När antikropparna tvättas ur, tillsätt ytterligare FACS för att öka utspädningen av antikropparna (1000 μL i stället för 200 μL) för att ta hänsyn till ofullständigt avlägsnande av supernatant. Beroende på cytometern kan du använda 1,5 ml-rören för sortering, vilket minskar mängden förbrukningsmaterial som krävs.
  2. FACS-sortering för mikroglia
    1. Förberedelse: Återsuspendera varje brunn i 200 μL FACS-buffert med en P200-pipett och överför till märkta flödessorteringsrör och tillsätt FACS-buffert till totalt 500 μL för en koncentration av cirka 5 x 105 händelser per ml. Förvara på is i mörker fram till analys. Förbered eftersorteringsrör genom att tillsätta 100 μL FACS-buffert som en kudde för celler i 1,5 ml RNAse-fria rör.
    2. Cytometerinställningar: Sortera celler på en cellsorterare med flödescytometri som är inställd med 100 μm-munstycket. Sortera celler med 18-20 psi.
    3. Grind: På cytometern, grind för cellstorlek med hjälp av sidospridningsarea (SSC) kontra framåtspridningshöjd (FSC) med hjälp av kontrollen utan fläck för att hjälpa till att särskilja skräp, placera SSC-A på en logaritmisk axel för att visualisera en cellpopulation och grinda nära för att välja för celler (grind S1; Figur 3). För att ta bort eventuella dubbletter, plotta FSC-H vs FSC-W och grinda tätt runt cellpopulationen och ta bort eventuellt skräp och dubbletter (grind S2). Använd P2RY12-isotypkontrollen, undersök cellerna i APC-kanalen och ställ in grinden för autofluorescens för att bestämma P2RY12+-celler. Med hjälp av kontrollerna "ingen fläck" och "levande död" används grind för de celler som inte är fluorescerande på violett 525 nm som levande celler.
    4. Sortering: Plotta violett 525 nm vs APC och bestäm populationen som är P2RY12+ och lever av FMOs (MG). Sortera dessa celler i det märkta eftersorteringsröret (bild 3). Den slutliga sorteringsprocenten är cirka 50 % av de totala händelserna, där majoriteten av den totala händelseförlusten är skräp som avlägsnats i grind S1 (~70 % av händelserna är celler; (se tabell 1).
  3. RNA-isolering och analys
    1. Transkriptions- och translationshämmare: Om du planerar RNA-extraktion, för att eliminera risken för isoleringsassocierade transkriptomiska signaturer, inkludera hämmare av translation och transkription i buffertstegen. Bered cocktailen med inhibitorer enligt beskrivningen av Marsh et al., inklusive aktinomycin D, anisomycin och triptolid25.
      1. Beredning av inhibitor: Bered lager av inhibitorer och förvara enligt följande: Bered aktinomycin D i dimetylsulfoxid (DMSO) till 5 mg/ml och förvara vid -20 °C. Bered triptolid i DMSO till 10 mM och förvara vid -20 °C, skyddad från ljus. Bered anisomycin i DMSO till 10 mg/ml och förvaras vid 4 °C, skyddat från ljus. Förvara inte alla lager av inhibitorer i mer än 1 månad efter beredning.
      2. Buffertmodifieringar: Tillsätt inhibitorer i fyra olika buffertar i protokollet enligt följande: När du utför transkardiell perfusion, förbered HBSS med aktinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 från stam) och triptolid (10 μM, 1:1000 från stam). Efter perfusion transporteras hjärnor till laboratoriet i HBSS innehållande aktinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 från stam), triptolid (10 μM, 1:1000 från stam) och anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 från stam). Bered FACS-buffert med aktinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 från stam), triptolid (10 μM, 1:1000 från stam) och anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 från stam). Bered digestionsbuffert med aktinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 från stam), triptolid (10 μM, 1:1000 från stam) och anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 från stam). Bered tvättbuffert efter sortering med HBSS som innehåller aktinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 från lager), triptolid (10 μM, 1:1000 från stam) och anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 från stam).
        OBS: När du lägger till inhibitorerna, se till att lägga till dem omedelbart före användning och skydda alla förberedda buffertar från ljus när de används. Undvik frysning och upptining av stamlösningar.
    2. Tvättar efter sortering: Eftersom cellerna har sorterats i 1,5 ml RNasfria rör i FACS-buffert, vilket kommer att störa RNA-isoleringen, är det nödvändigt att tvätta cellerna. Snurra cellerna vid 1000 x g vid 4 °C i 5 minuter och avlägsna supernatanten så att cirka 50 μl vätska återstår.
    3. Tillsätt 200 μl 1x HBSS innehållande aktinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 från stam), triptolid (10 μM, 1:1000 från stam) och anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 från stam) och blanda väl. Upprepa centrifugeringen och ta bort supernatanten och lämna 50 μL vätska (tvätt 1). Tillsätt 200 μL tvättbuffert, blanda noggrant och upprepa centrifugeringen och ta bort supernatanten och lämna 25 μL vätska (tvätt 2).
    4. RNA-extraktion: För RNA-isolering från mikrogliaceller, använd ett RNA-isoleringskit med låg input för höga och konsekventa RNA-utbyten och RIN-poäng över 9 (se nedan och materialtabell för produktrekommendationer). Tillsätt 350 μL lyseringsbuffert från rekommenderat kit + β-merkaptoetanol (1:100) till cellpelleten och blanda väl.
      OBS: Vid behov kan protokollet avbrytas vid denna tidpunkt. Proverna kan förvaras i lysbufferten vid -80 °C fram till RNA-extraktion. Om du extraherar RNA efter lagring, tina lysatet på is och fortsätt med de kitspecifika instruktionerna för isoleringen.
    5. Överför lysat till kolonnbaserad cellförstörare (se materialtabell för produktrekommendationer) och centrifugera vid max hastighet vid 4 °C i 2 minuter. Eluera i minst 14 μl RNasfritt vatten och bestäm koncentrationen efter behov. RNA kan användas för alla nedströmsapplikationer efter denna punkt.

Figure 3
Bild 3: Grindstrategi för flödessortering. Händelser är gated för cellstorlek på SSC-A jämfört med FSC-H (S1). Sedan är cellerna inhägnade för att vara singlets på FSC-H vs FSC-W (S2). Singlettceller sorteras som levande om de är negativa på Comp-FL8-A::405-526-52 (violett 525 levande döda fläckar) och som P2RY12+ om de är positiva på Comp-FL32-A::640-671_30 (P2RY12-APC) med hjälp av P2RY12-isotypkontrollen. Cellerna märks som MG och sorteras om de är både levande och P2RY12+. Klicka här för att se en större version av denna figur.

INHÄGNAD BEFOLKNING Frekvens för förälder Frekvens för totalt Räkna
S1 68.10% 68.10% 162186
S2>S1 93.59% 63.70% 151707
P2Ry12+ (670+) > S2 > S1 83.05% 52.90% 125986
Live (525-) > S2 > S1 92.78% 59.10% 140752
MG (P2RY12+ Live) >S2>S1 78.96% 50.30% 119794

Tabell 1: Exempel på ursprungstabell med gating-procentsatser och förväntade händelsenummer.

2. Intranukleär flödesfärgning för analys av proteinuttryck

OBS: Andra celltyper kan startas vid denna tidpunkt, detta protokoll testas med odlade celler inklusive HEK293-celler, BV2-mikroglialiknande celler och humana IPSC-härledda mikroglia.

  1. Fixering och färgning av celler
    OBS: För följande protokoll, använd ett intracellulärt färgningskit som är optimerat för nukleär färgning. Se Tabell över material för produktrekommendationer.
    1. Alikvot extracellulärt färgade celler från sektion 1.5.2 till 96 brunnars platta (5 x 104-1 x 106-celler ). Snurra cellerna i 5 minuter vid 500 x g vid 4 °C och snärta för att ta bort FACS-bufferten.
      OBS: För att få data med hög konfidens för mediannivåer bör minst 10 000 celler per brunn användas. Även om det inte finns något rekommenderat maximum, är det bäst att hålla antalet celler konsekvent under hela experimentet för att säkerställa att det inte finns någon signifikant effekt av olika variationskoefficienter (CV).
    2. Fixering och permeabilisering: Tillsätt 200 μL 1x fixkoncentrat och blanda försiktigt med P200-pipett för att återsuspendera cellerna. Inkubera i mörker i 45-60 min. Centrifugera plattan i 5 minuter vid 500 x g vid rumstemperatur (RT) och snärta för att kassera supernatanten.
      OBS: Vid behov kan protokollet avbrytas vid denna tidpunkt. Efter kassering av supernatant, suspendera cellerna på nytt i långtidsförvaringsbuffert för immunceller (se materialtabell för produktrekommendationer). Proverna kan förvaras vid 4 °C i 12-18 timmar, skyddade från ljus och täckta med genomskinlig film för att skydda buffertavdunstning.
    3. Tillsätt 200 μL 1x permeabiliseringsbuffert till varje brunn och pipettera med en P200 för att blanda. Centrifugera plattan i 5 minuter vid 500 x g vid RT och snärta för att kassera supernatanten. Upprepa permeabiliseringsbufferten tvätta totalt 3 gånger.
    4. Förbereda flödeskontroller: Dela upp volymen av celler från varje sample för de nödvändiga flödeskontrollerna (10 000-30 000 celler per kontrollbrunn räcker).
      1. För att förbereda fläckfria kontroller, fixera de fläckfria cellerna från sorten eller alikvoten ofärgade celler i en separat brunn som inte kommer att få några antikroppar.
      2. För att bereda fluorescens-minus en-kontrollen (FMO) alikvoter för var och en av antikropparna på panelen utom den i den kanalen.
      3. För de relevanta kanalerna, inkludera isotypkontrollantikroppen i FMO för gating. Till exempel, i en panel som innehåller P2RY12-APC och H3K27Ac-AlexaFluor568 bör det finnas två FMOS: (1) APC-FMO som endast innehåller H3K27Ac-AlexaFluor568 och P2RY12 isotypkontrollantikropp och (2) 568-FMO som endast innehåller P2RY12-APC och isotypkontrollen primär och 568 sekundär.
        OBS: Detta protokoll presenteras för att testa en enda HPTM, men paneler kan upprättas som innehåller många HPTM konjugerade till olika fluoroforer.
    5. Primär antikroppsfärgning: Tillsätt 50 μl 1x permeabiliseringsbuffert med lämplig koncentration av primär antikropp till varje brunn. Inkubera i 30 min vid RT i mörker. Tvätta 2x med 200 μL 1x permeabiliseringsbuffert.
      OBS: Koncentrationen av antikroppar som används för varje HPTM ingår i materialförteckningen. Koncentrationen bestäms genom att testa olika koncentrationer av antikropparna på odlade celler som behandlats med ett stimulerande medel som skulle orsaka en dramatisk ökning, t.ex. en HDAC-hämmare för acetyleringsmärken och se till att både obehandlade och behandlade celler låg väl inom detektionsområdet (över isotypkontrollen och under cytometerns maximala detektionsområde). Den optimala antikroppskoncentrationen för HPTM bör ha en genomsnittlig fluorescerande medianintensitet i fluoroforkanalen mellan 5 x 104 och 1 x 105.
    6. Sekundär antikroppsfärgning: Blockera med 200 μL 1x permeabiliseringsbuffert med 2% normalt åsneserum (NDS) i 10 min vid RT. Snurra i 5 min vid 500 x g vid RT och snärta för att ta bort supernatant.
    7. Tillsätt 50 μl 1x permeabiliseringsbuffert med 2 % NDS och lämplig koncentration av sekundär antikropp och inkubera i 30 minuter vid RT i mörker. Tillsätt 200 μL 1x permeabiliseringsbuffert till brunnar för att späda ut, centrifugera plattan i 5 minuter vid 500 x g vid RT och snärta för att kassera supernatant. Tvätta cellerna 2x med 200 μL 1x permeabiliseringsbuffert.
      OBS: Om det behövs, avbryt protokollet vid denna tidpunkt. Återsuspendera cellerna i 200 μl långtidsförvaringsbuffert för immunceller med P200-pipett (se materialtabell för rekommendationer) och förvara vid 4 °C i 12-24 timmar skyddade från ljus.
    8. Förberedelse för flödescytometri: Centrifugera plattan i 5 minuter vid 500 x g vid RT och snärta för att kassera supernatanten. Återsuspendera celler i 200 μL FACS-buffert med hjälp av en P200-pipett för flödescytometri. Försegla med genomskinlig film för transport till cytometern.
  2. Flödescytometri
    1. För att analysera den föreslagna antikroppspanelen, se till att cytometern är utrustad med minst fyra lasrar, inklusive violett (405 nm), blått (488 nm), gult (561 nm) och rött (633 nm). Cytometern behöver filter för att detektera FITC (blå-525 nm), KRO (violett-525 nm), PE (gul-585 nm) och APC (röd-660 nm). Tillsätt ytterligare antikroppar beroende på vilken cytometer som valts.
    2. Kalibrering och standardisering: I början av varje experiment, kör regnbågsfluorescerande pärlor och justera fotomultiplikatorrörets (PMT) spänning tills pärltopparna är jämförbara med målvärdena som körts för tidigare experiment. Denna metod för standardisering gör det möjligt att anpassa utrustningens drift över tiden.
    3. Kompensation: Efter att PMT-spänningen och förstärkningen har ställts in för experimentet, använd antikroppsfångade kompensationspärlor för att fastställa kompensationsmatrisen för antikroppspanelen. Denna beräkning kommer att säkerställa att fluoroforerna inte bidrar till signalförändringar i andra kanaler. Detta blir allt mer nödvändigt vid multiplexering av multiplexerande antikroppar.
    4. Size gating: I ett punktdiagram plottar du SSC-A på log jämfört med FSC-H på linjär. Grinda ut skräp och välj cellstorlek med hjälp av S1-grinden. Välj för singlettceller i ett punktdiagram med FSC-W vs FSC-H och grind som S2. (Figur 4).
    5. Upprättande av fluoroforgrindar: Använd relevant FMO för varje fluoroforkanal och upprätta grindarna för att avgöra vad som är en positiv signal i varje kanal med hjälp av histogram med en parameter (figur 4).
    6. Mätning av proverna: Registrera proverna noggrant med hjälp av den etablerade grindstrategin. Identifiera mikroglia med hjälp av P2RY12+-signalen, bestäm uttrycket av proteinet i respektive kanal endast för mikroglia.
  3. Analys av flödescytometridata
    1. Upprätta analysgrindar: Använd stegen ovan för cytometern i analysprogramvarans användargränssnitt och använd samma grindar som används för registrering för analys.
    2. Erhåll MFI-värden med hjälp av programvara för flödescytometrianalys (se materialtabell för rekommendationer): Rekapitulera cytometerregleringsstrategin för flödesanalys. Använd funktionen för att lägga till statistik och välj median för den intressanta populationen (t.ex. 568+) på den kompenserade kanalhöjden. Använd tabellredigeraren för att exportera medianvärdena för fluorescerande intensitet (MFI) för respektive kanal till ett kalkylblad för att fortsätta med statistisk analys (tabell 2).
      OBS: Kompletterande File S1 innehåller exempeldata från lipopolysackarid (LPS) och fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) injicerade möss och ett exempel på analysfil med gatingstrategi och MFI-värden.
    3. Analysera MFI-värden för proteinveckningsförändring: Efter att ha erhållit MFI-värdena, beräkna vikningsförändringen av MFI i förhållande till kontrollpopulationen eller den obehandlade populationen (ekvation 1). MFI-veckförändringen återspeglar veckförändringen i proteinnivåer. Med hjälp av vikningsförändringsvärdena, bedöm förändringen i uttryck och beräkna den statistiska signifikansen med hjälp av ett t-test eller ANOVA.
      Equation 1Ekvation 1

Figure 4
Figur 4: Regleringsstrategi för bedömning av protein-MFI. Händelser är först gated för cellstorlek på SSC-A jämfört med FSC-H (S1). Cellerna är sedan inhägnade för singlets på FSC-H vs FSC-W (S2). Singlettceller identifieras sedan som mikroglia med hjälp av P2RY12-APC-signalen (APC+) med grinden fastställd baserat på fluorescens i en APC-FMO-kontroll som innehåller en isotypkontrollantikropp. Cellerna är sedan låsta för H3K27Ac-AlexaFluor568-signal på Comp-FL5-A::Y610-mCherry. Den fluorescerande intensiteten hos 610+-cellerna bestäms som en proxy för proteinuttryck. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Representative Results

Vuxna möss perfunderades transkardialt och offrades för mikrogliaisolering. Mikroglia isolerades på is och färgades med P2RY12-APC och violetta 525 levande döda antikroppar. Celler som bestämdes vara positiva för P2RY12 och negativa för violett 525 levande döda fläckar sorterades som levande mikroglia. Det genomsnittliga utbytet av mikroglia från en dissekerad mushjärna var 1,28 x 105 ± 0,05 (medelvärde ± medelvärde för medelvärde (SEM), N=100). Det finns ingen skillnad i utbytet av mikroglia mellan honmöss (1,25 x 105 ± 0,09 [medelvärde ± SEM, N=46]) och hanmöss (1,32 x 105 ± 0,07 [medelvärde ± SEM, N=54]) möss (t(98)=0,6365, p=0,526). Vid isolering från specifika hjärnregioner är det genomsnittliga utbytet av mikroglia från musbarken 8,3 x 104 ± 0,08 (medelvärde ± SEM, N = 15) och från mus hippocampus är 4,1 x 104 ± 0,02 (medelvärde ± SEM, N = 16). Som förväntat finns det en signifikant skillnad i utbytet av mikroglia från varje hjärnregion (F(2, 128)=25,25, P<0,0001). Efter mikrogliaisolering extraherades RNA från de isolerade cellerna med hjälp av ett RNA-isoleringskit med låg ingång. Genomgående var RNA-integritetspoängen (RIN) över 9,0 (9,62 ± 0,05) och det genomsnittliga utbytet av RNA per cell var 0,25 ± 0,01 pg (medelvärde ± SEM, N=32; Kompletterande fil S2).

Vuxna möss injicerades intraperitonealt med 1 mg/kg lipopolysackarid (LPS) 24 timmar före avlivning. Mössen genomsyrades transkardialt med HBSS och mikroglia isolerades från hela hjärnan enligt det beskrivna protokollet (Figur 5A). För varje infärgning allokerades 20 000-30 000 celler till varje panel av antikroppar. De globala nivåerna av histon 3 lysin 27-acetylering (H3K27Ac) utvärderades i isolerade mikroglia via flödescytometri. För han- och honmöss inducerade LPS-behandling en ökning av H3K27Ac när MFI normaliseras inom kön (t(6)=9,676, p<0,0001; Figur 5B). Vid undersökning av histogrammen för de färgade cellerna förblir populationerna normalfördelade med liknande variation; Cellerna har dock skiftat till ökad fluorescens, vilket resulterar i en ökning av MFI (Figur 5C). Vid undersökning av H3K9Ac i samma behandling finns en liknande ökning av H3K9Ac (t(6)=7,299, p=0,0003; Figur 5D,E) dock är vikförändringen av LPS i förhållande till PBS för H3K9Ac-signalen mindre än H3K27Ac-signalen.

Figure 5
Figur 5: Globala förändringar i histonacetylering i isolerade mikroglia. A) Möss injiceras intraperitonealt med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) eller 1 mg/kg lipopolysackarid (LPS) 24 timmar före avlivning. Mikroglia samlas in från den immunanrikade fraktionen och fixeras för flödescytometri och global histonbedömning efter translationell modifiering. Medianvärdet för fluorescerande intensitet bedöms som en proxy för proteinuttryck. Skapad med BioRender.com. (B) Globala nivåer av H3K27Ac ökade som svar på LPS-behandling. Vik förändring till PBS normaliserad inom experiment och sex. Oparat tvåsidigt t-test, t(6)=9,676, p<0,0001. Stapeldiagrammet visar medelvärdet ± SEM. N=8 djur; 2 per tillstånd i 2 oberoende experiment. (C) Exempel på histogram som visar skiftning av H3K27Ac fluorescerande intensitet. Modal visar histogram från PBS-injicerade kontra LPS-injicerade möss. (D) Exempel på histogram som visar skiftning av H3K9Ac-fluorescerande intensitet. Modal visar histogram från PBS-injicerade kontra LPS-injicerade möss. (E) Globala nivåer av H3K9Ac ökade som svar på LPS-behandling. Vik förändring till PBS normaliserad inom experiment och sex. Oparat tvåsidigt t-test, t(6)=7,299, p=0,0003. Stapeldiagrammet visar medelvärdet ± SEM. N=8 djur; 2 per tillstånd i 2 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna figur.

För att bekräfta att den beskrivna metoden var jämförbar med andra tidigare använda metoder för global histonmodifieringskvantifiering strävade vi efter att använda immunoblot som ett jämförande verktyg. Utbytet från de isolerade mikroglia är dock helt enkelt för lågt för att möjliggöra en rimlig bedömning. Därför använde vi odlade BV2-celler för att jämföra den intracellulära flödescytometrimetoden med en Western blot (WB). BV2-celler odlades i komplett media (DMEMF12, 10 % FBS, 1 x penicillin/streptamycin och 1 x L-glutamin) vid 37 °C, 5 % CO2 . Cellerna passerades med 0,25 % trypsin-EDTA och pläterades med en densitet av 250 000 celler/brunn och behandlades i reducerade serummedier (DMEM F12, 2 % FBS, 1x penicillin/streptamycin och 1x L-glutamin) och fick återhämta sig i 12 timmar vid 37 °C, 5 % CO2 . Cellerna behandlades med 25 ng/ml LPS i 24 timmar före fixering enligt beskrivningen ovan eller lys med en WB-lysbuffert. Signal av H3K27Ac utfördes med båda metoderna med GAPDH som används som belastningskontroll för WB. Analys av den normaliserade fluorescerande intensiteten jämfört med PBS-kontrollen bestämdes för varje grupp (Figur 6A). Vid undersökning av förändringen i normaliserad H3K27Ac-signal med WB sågs en 1,527-faldig ökning av det LPS-behandlade tillståndet i förhållande till H2O-kontrollen, vilket bestämdes vara signifikant genom oparat t-test (t = 3,024, df = 5; p = 0,0293). När man undersökte förändringen med hjälp av flödescytometri sågs en 1,482-faldig ökning av det LPS-behandlade tillståndet, vilket bestämdes vara signifikant (t=7,843, df=10; p<0,0001). Med hjälp av en 2-vägs ANOVA för att jämföra metoderna bestämdes det att det fanns en signifikant effekt av behandlingen (F(1,15)=45,21,p<0,0001), men inte metoden (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) eller interaktionen (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Dessutom verifierar vi här att det inte finns någon förändring i histon H3-nivåer av både Western blot och flödescytometri eftersom 2-vägs ANOVA inte visade någon signifikant effekt av LPS-behandlingen (F(1,7)=0,02170,p=0,8870), metoden (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) eller interaktionen (F(1,7=0,01191, p=0,9162; Figur 6B). Exempel på fläckar och histogramförskjutningar för dessa data visas också (figur 6C,D).

Figure 6
Figur 6: Metodjämförelse för kvantifiering av global histonmodifieringsförändring mellan flödescytometri och western blot. (A) BV2-celler behandlas med 25 ng/ml lipopolysackarid (LPS) eller H2O i 24 timmar före analys. Den fluorescerande intensiteten av H3K27Ac avbildas som veckförändring av vehikelkontrollen, fosfatbuffrad saltlösning (PBS), för både flödescytometri och western blot. 2-vägs ANOVA visade signifikant effekt av LPS-behandlingen (F(1,15)=45,21, p<0,0001), men inte av metoden (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) eller interaktionen (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Tukeys korrigering för multipel hypotesprövning tillämpades för residualerna. * presenterar 0,0332, ** presenterar 0,0021. (B) Den fluorescerande intensiteten för histon H3 avbildas som veckförändring till PBS för både flödescytometri och western blot. 2-vägs ANOVA visade ingen signifikant effekt av LPS-behandlingen (F(1,7)=0,02170, p=0,8870) eller metoden (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) eller interaktionen (F(1,7=0,01191, p=0,9162). (C) Exempel på blottor och (D) flödescytometriförskjutningar skildras. Histogramstorleken normaliseras till procent baserat på antalet celler som finns vid den fluorescerande intensiteten. Stapeldiagrammet visar medelvärdet för SEM. n=2 oberoende experiment, 2 per tillstånd per experiment. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Sammantaget visar dessa resultat att denna teknik kan användas för att kvantitativt bedöma de globala HPTM-nivåerna i isolerade mikroglia. Dessutom visade sig metoden vara jämförbar med tidigare tekniker men krävde mycket lägre cellinsatser. Dessutom, även om den inte visas, kan den nuvarande tekniken, med korrekt kompensation, användas med flera antikroppar på samma panel som bedömer olika HPTM.

Tilläggsfil S1: Exempel på analysfiler. Den här filen innehåller en wsp-analysfil och 7 fcs-filer inklusive no stain, P2RY12FMO, 568FMO, två PBS-behandlade djur och två LPS-behandlade djur färgade med H3K27Ac. Syftet med den här filen är att demonstrera analysen och grinden på ett experiment som kan visa hur ett lyckat experiment såg ut. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil S2: Isoleringsdata. Filen som ingår innehåller relevanta data efter mikrogliasortering som innehåller mikroglia- och RNA-utbytet från det beskrivna protokollet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

INHÄGNAD BEFOLKNING Frekvens för förälder Frekvens för totalt Räkna
S1 89.00% 89.00% 25672
S2>S1 88.73% 78.97% 22779
APC+ > S2 > S1 76.61% 60.50% 17452
610+ > APC+ > S2 > S1 99.56% 60.24% 17376

Tabell 2: Exempeldiagram över ursprung visar procentuella och händelsenummer som krävs för korrekt proteinidentifiering.

Discussion

Protokollet som presenteras möjliggör kvantitativ bedömning av globala HPTM-nivåer genom flödescytometri. Även om detta protokoll presenterar en ny metod, har tidigare studier gjort kvantitativ bedömning av proteiner med hjälp av ett liknande tillvägagångssätt26. Tidigare metoder som använts för att bedöma globala nivåer av HPTM inkluderar immunhistokemi och western blot 16,17,19,20. Den flödescytometribaserade metoden som presenteras är en lätt kvantifierbar metod, medan western blot och immunohistokemi är semikvantitativa och har lägre genomströmning. Western blot förlitar sig på celllys och kräver därför både proteinnormalisering och ett laddningskontrollprotein som antas vara oförändrat av det experimentella betingelsen27. Immunohistokemi är semikvantitativ och mycket låg genomströmning då det är svårt att kvantitativt bedöma mängden protein utan att undersöka på enskild cellnivå16. På samma sätt finns det för de isolerade mikroglia en fördel med att använda flödescytometrimetoden på grund av det begränsade utbytet eftersom western blot kräver mycket större proteintillförsel19. Kraven på lågt cellantal gör det möjligt att köra flera färgningspaneler från samma djur.

Men som med alla andra metoder finns det begränsningar för denna teknik, inklusive antikroppskostnad och tillgänglighet, eftersom inte alla antikroppar fungerar bra i en flödescytometri. Dessutom, jämfört med immunoblot, är koncentrationen av antikroppar som krävs mycket högre. Multiplexering gör det möjligt att använda flera antikroppar på samma cellpanel, men cellerna kan inte tas bort från antikroppen efter analys, vilket begränsar cellanvändningen till en per antikroppsart. Detta skiljer sig från immunoblot där samma blot kan användas upprepade gånger. Beroende på tillgången på antikroppar och antalet detektionskanaler på en cytometer skulle det dock vara möjligt att undersöka upp till ett dussin markeringar samtidigt.

Den nuvarande metoden fångar endast globala nivåer av proteinuttryck och inte den specifika genomiska platsen, och förändringar i globala nivåer kanske inte återspeglar förändringar på enskilda genomiska loci. På samma sätt behöver en brist på förändring i globala nivåer inte betyda att inga genomiska loci genomgår förändringar, bara att de globala förändringarna inte summerar till några skillnader mellan behandlingarna. Som sådan är denna teknik tänkt att användas som en skärm för att identifiera HPTM:er av intresse för genomisk analys. Dessutom tillåter denna metod inte jämförelse mellan olika proteinmarkörer förutom när den bedöms som en veckförändring till kontroll. Därför är detta begränsat jämfört med en standardkurvbaserad metod som ELISA för proteinbestämning.

Protokollet som presenteras erbjuder en strategi för att isolera levande hjärnmikroglia. Detta protokoll förlitar sig på P2RY12-proteinuttryck för mikrogliaisolering. P2RY12 är dock en homeostatisk markör i mikroglia och kan nedregleras i sjukdomsmodeller, såsom 5XFAD22. Därför, när du använder ett sjukdomsmodelldjur, se till att välja andra markörproteiner som TMEM119, CD11b eller CD45 för att hjälpa till att isolera mikroglia23. På samma sätt presenterar vi detta protokoll som isolering från hippocampus och/eller cortex. Detta protokoll skulle fungera för att isolera mikroglia från andra hjärnregioner inklusive regioner med vit substans, men flera djur kan krävas för att få tillräckligt med mikroglia beroende på storleken på de regioner som är av intresse.

Protokollet som presenteras kan på ett robust sätt isolera levande mikroglia i hjärnan, men det finns flera steg, som beskrivs nedan, i isoleringsstadiet som kan minska cellutbytet om de utförs felaktigt.

Perfusioner för detta protokoll resulterar i en högre andel mikroglia i det immunberikade fragmentet, vilket kommer att minska tiden vid sorteringen. Perfusion krävs dock inte, och andra metoder för eutanasi kan användas vid behov.

Under mikrogliaisolering ska myelinet avlägsnas helt. Flödescytometrar är beroende av att cellerna kan färdas genom smala slangar i snabb takt. På grund av sin viskositet och tendens att klumpa ihop sig orsakar myelin problem med cytometrar, vilket ofta orsakar tilltäppningar som både kan skada utrustningen och förstöra provet, vilket minskar utbytet drastiskt. Var försiktig med att ta bort allt myelin under insamling av immunberikade fragment för att undvika problem nedströms.

Plattfärgning kontra rörfärgning: I detta protokoll beskrev vi två alternativ för färgning av celler i antingen 1,5 ml rör eller en 96-hålsplatta. Användningsfallet för var och en beror på experimentet. Generellt sett är dock rörfärgning lägre risk för att påverka avkastningen än plåtfärgning eftersom snärten riskerar att förlora celler om den görs felaktigt. Plattfärgning går mycket snabbare eftersom det är tidskrävande att aspirera supernatanten för varje rör. Före fixering (för sortering etc.), använd rörfärgning för att maximera utbytet och minska risken för förlust. Men för HPTM-analys, när cellerna väl är fixerade för intranukleär färgning, är pelleten mer stabil, och det finns minskad risk för förlust vid snärtning.

Fastställande av den diskontinuerliga densitetsgradienten: När skiktningen etableras är det viktigt att sätta upp skikten på rätt sätt för att erhålla den immunberikade fraktionen. Om skikten störs eller blandas och verkar grumliga, kommer cellerna inte att sortera till önskad plats, och det kommer att vara svårt att erhålla den immunberikade cellfraktionen. Om detta inträffar, snurra med densitetsmediet för att avlägsna myelin och samla sedan upp hela de återstående fraktionerna, späd med 3 ml FACS-buffert till 1 ml densitetsmedium och blanda väl (detta kräver flera rör). Centrifugera 500 x g i 10 min med bromsen på 0. Kassera supernatanten och lämna endast ~300 μL lösning. Samla upp hela provet och färga. Detta kommer att ge i minskade sorteringsprocentsatser och en högre tid som spenderas vid cytometern, men utbytet kan fortfarande vara jämförbart.

Vid användning av isoleringsmetoden är det fördelaktigt att kunna samla in celler för RNA och för HPTM-utvärdering från samma mushjärna. I denna situation, efter sortering av de levande mikroglia, kan celler delas för att allokera en del till RNA-utvärdering (minsta ingångsantal celler för att erhålla ett anständigt RNA-utbyte är 75 000 celler) och en del för ytterligare flödescytometrianalys (minst 10 000 celler per brunn för god bestämning av MFI). I detta fall krävs flödescytometersortering. När man bara planerar att använda cellerna för HPTM-analys krävs dock ingen sortering, och immunfraktionen kan färgas med P2RY12-antikroppen och HPTM-antikroppen. Gating på cytometern kan sedan ställas in för P2RY12+ mikroglia, som skulle göras för flödessortering, för att endast analysera HPTM-signalen inom mikroglia. Genom att eliminera sorteringen kan protokollet bli snabbare och mer kostnadseffektivt. Om HPTM utvärderas från odlade celler räcker det dessutom med att börja med färgningsprotokollet och inga cellmarkörantikroppar krävs, vilket visas i figur 6. HPTM-utvärderingsprotokollet kan användas för många celltyper, inklusive odlade, primära och IPSC-härledda celler.

Slutligen, även om vi bara har presenterat två potentiella användningsområden för mikroglia nedströms isolering, finns det många andra, inklusive epigenetiska tekniker som ChIP, CUT&Tag och CUT&RUN. När det gäller genomiska epigenetiska tekniker, där karakterisering av förändringar på specifika loci är av intresse, välj specifika inhibitorer för författare och raderare av kromatinmärken11 som är skräddarsydda för experimenten för att säkerställa att eventuella mikrogliala epigenetiska modifieringar som profileras inte är tekniska artefakter från några steg i isoleringsproceduren, såsom enzymatisk nedbrytning. Vid bedömning av förändringar i globala nivåer av epigenetiska markörer, till exempel genom att använda kvantitativ flödescytometri, förväntas eventuella procedurinducerade förändringar inte vara så stora att de detekteras på global nivå.

Sammantaget ger de diskuterade metoderna en ny, encellsmetod för att kvantifiera globala nivåer av histonmodifieringar och andra epigenetiska förändringar genom flödescytometri. Vi visade att denna metod är tillräckligt känslig för att detektera globala förändringar i förstärkarmarkören H3K27ac i mikroglia som svar på LPS in vivo. Detta överensstämmer med tidigare ChIP-sekvensering av H3K27ac efter LPS-stimulering som visar dramatisk ombyggnad av förstärkare som svarar på LPS28. Tillämpningar av denna metod kommer att göra det möjligt att undersöka globala epigenetiska förändringar i olika typer av hjärnceller under utveckling och sjukdom.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Tack till Yanyang Bai för hjälpen med immunobloten i figur 5. Detta arbete stöddes av Canadian Institutes for Health Research [CRC-RS 950-232402 till AC]; Kanadas forskningsråd för naturvetenskap och teknik [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 till AC]. Scottish Rite Charitable Foundation [21103 till AC] och Brain Canada Foundation [AWD-023132 till AC]; University of British Columbia Aboriginal Graduate Fellowship (6481 till MT); British Columbia Graduate Scholarship (6768 till MT); Canadian Open Neuroscience Platform Student Scholar Award (10901 till JK); University of British Columbia fyraårigt doktorandstipendium (6569 till JK). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om publicering eller förberedelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5M EDTA Invitrogen AM9260G
15 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile  Falcon 352196
24-well Clear Not Treated Plates Costar 3738
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
96 Well Clear Polystyrene Microplate, clear round bottom, non treated surface Corning 3788
Acetyl Histone 3 K9 (C5B11) Cell Signalling Technology 9649S Dilution: 1:100
Acetyl Histone H4 K8 (2594) Cell Signalling Technology 2594S Dilution: 1:100
Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4) Cell Signalling Technology 8173S Dilution: 1:100
Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516) Invitrogen MA523516 Dilution: 1:100
Actinomycin D New England Biolabs 15021S
Anisomycin New England Biolabs 2222S
Anti-Histone H3 (tri methyl K4)  Abcam ab213224 Dilution: 1:100
Anti-Lactyl-Histone H4 (Lys 12) Rabbit mAb PTM Biolabs PTM-1411RM Dilution: 1:250
Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb PRM Biolabs PTM-1401RM Dilution: 1:250
Apc anti-P2RY12 Antibody, Clone: S16007D BioLegend 848006
BSA Tocris 5217
Cyto-Last Buffer BioLegend 422501
dimethylsulfoxide, sterile Cell Signalling Technology 12611S
DNAse I STEMCELL Technologies 07900
Donkey Anti Mouse AlexaFluor488 Jackson ImmunoResearch 715-546-150 Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488 ABclonal AS035 Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568 Invitrogen A10042 Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421 BioLegend 406410 Dilution: 1:500
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisherbrand 13-711-9AM
Fisherbrand Disposable PES Filter Unit, 250mL  Fisherbrand FB12566502
H3K18ac Polyclonal Antibody Invitrogen 720095 Dilution: 1:100
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14185052
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175103
Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002) Abcam ab6002 Dilution: 1:100
KONTES Dounce Tissue Grinders 125mm 7mL  VWR 885300-0007
Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb PTM BIolabs PTM-1406RM Dilution: 1:250
Lipopolysacharide  Sigma-Aldrich L5418
Normal Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
OneComp eBeads Compensation Beads Invitrogen 01-1111-41
PDS Kit, Papain Vial - Worthington Biochemical Cedarlane LK003178
Percoll Sigma-Aldrich GE17-0891-02
Phenol Red VWR RC57004
QIAshredder Qiagen  79656
Rainbow Fluorescent Particles, 1 peak (3.0-3.4 uM - Mid Range Intensity BioLegend 422905
RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Invitrogen AM12400
Rneasy Plus Micro Kit Qiagen  74034
Round Bottom Polypropylene Tubes with Caps, 5 mL Corning 352063
Triptolide New England Biolabs 97539
True Nuclear Transcription Factor Buffer Set BioLegend 424401
TruStain FcX PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody BioLegend 156604
Trypan Blue VWR 97063-702
Zombie Aqua Fixable Viability Kit BioLegend 423102

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, J. L., Grant, P. A. The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans. Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).
  2. Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  5. Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies. Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).
  6. Keiser, A. A., et al. Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice. Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367 (2021).
  7. McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).
  8. Barrett, R. M., et al. Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory. Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).
  9. Datta, M., et al. Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner. Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).
  10. Belhocine, S., et al. Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation. Glia. 70 (3), 572-589 (2022).
  11. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science (New York, N.Y.). 356 (6344), eaal3222 (2017).
  12. Kettenmann, H., Hanisch, U. -K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of Microglia. Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).
  13. Sullivan, O., Ciernia, A. V. Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011 (2022).
  14. Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Crowe, A., Yue, W. Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol. BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).
  17. Seligson, D. B., et al. Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence. Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).
  18. Liu, B., et al. Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).
  19. Pan, R. Y., et al. Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease. Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).
  20. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  21. Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. Journal of Visualized Experiments. (108), 53658 (2016).
  22. Oblak, A. L., et al. Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726 (2021).
  23. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), e70 (2019).
  24. McKinnon, K. M. Multiparameter Conventional Flow Cytometry. Flow Cytometry Protocols. 1678, 139-150 (2018).
  25. Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nature Neuroscience. 25 (3), 306-316 (2022).
  26. Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry. Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).
  27. Rumbaugh, G., Miller, C. A. Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 670, 263-274 (2011).
  28. Xavier, A. M., et al. Systematic delineation of signaling and epigenomic mechanisms underlying microglia inflammatory activity in acute and chronic brain pathologies. BioRvix. , (2022).

Tags

Kvantifiering globala histonposttranslationella modifieringar intranukleär flödescytometri isolerade mushjärnmikroglia genuttryckskontroll kromatinstruktur posttranslationella modifieringar histonsvansar acetylering lysinrester DNA-interaktioner tillgång till transkriptionsfaktor bromodomäninnehållande transkriptionsaktivatorer förbättrat genuttryck dynamisk reglering celldifferentiering cellulära miljöer stimuli nästa generations sekvenseringsmetoder hög Genomströmning kvantitativt mått
Kvantifiering av globala histonförändringar efter translationella modifieringar med hjälp av intranukleär flödescytometri i isolerade mikroglia i mushjärna
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Towriss, M., Kim, J., Vogel Ciernia, … More

Towriss, M., Kim, J., Vogel Ciernia, A. Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia. J. Vis. Exp. (199), e65080, doi:10.3791/65080 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter