Apresentamos aqui um protocolo detalhado para o transplante de organoides renais na cavidade celômica de embriões de galinha. Este método induz a vascularização e maior maturação dos organoides em 8 dias e pode ser usado para estudar esses processos de maneira eficiente.
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Artigo de método
Vascularização Eficiente de Organoides Renais através do Transplante Intracelomico em Embriões de Galinha
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os organoides renais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos contêm estruturas semelhantes a néfrons que se assemelham às do rim adulto até certo ponto. Infelizmente, sua aplicabilidade clínica é dificultada pela falta de uma vasculatura funcional e, consequentemente, maturação limitada in vitro. O transplante de organoides renais na cavidade celômica de embriões de galinha induz a vascularização por vasos sanguíneos perfundidos, incluindo a formação de capilares glomerulares, e aumenta sua maturação. Esta técnica é muito eficiente, permitindo o transplante e análise de um grande número de organoides. Este trabalho descreve um protocolo detalhado para o transplante intracelomico de organoides renais em embriões de galinha, seguido da injeção de lectina fluorescentemente marcada para coloração da vasculatura perfundida e da coleta de organoides transplantados para análise de imagem. Este método pode ser usado para induzir e estudar a vascularização e maturação de organoides para encontrar pistas para melhorar esses processos in vitro e melhorar a modelagem de doenças.
Introdução
Organoides renais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) têm demonstrado potencial para estudos de desenvolvimento 1,2,3,4, triagem de toxicidade 5,6 e modelagem de doenças5,7,8,9,10,11,12,13
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Protocolo
De acordo com a legislação holandesa, a aprovação do comitê de bem-estar animal não era necessária para esta pesquisa.
1. Preparação de organoides renais derivados da hiPSC para transplante
- Diferenciar hiPSCs de organoides renais utilizando o protocolo desenvolvido por Takasato et al.4,18,31. Cultura dos organoides seguindo este protocolo em pastilhas de cultura celular de poliéster com poros de 0,4 μm (insertos de cultura celular) até o 7º + 12º dia de diferenciação. Cada inserção de cultura celular conterá três organoid....
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Resultados
O método e o cronograma para diferenciação de hiPSCs em organoides renais, incubação de ovos de galinha fertilizados, transplante de organoides renais, injeção de ACV e coleta dos organoides estão resumidos na Figura 1A. É importante coordenar o momento da diferenciação organoide e incubação dos ovos de galinha, iniciando a diferenciação 15 dias antes da incubação. As ações nos dias 0, 3, 4 e 12 de incubação são ilustradas por fotografias abaixo da linha do tempo. Os organoides são transplan.......
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Discussão
Neste manuscrito, um protocolo para transplante intracelomico de organoides renais derivados de hiPSC em embriões de galinha é demonstrado. Após o transplante, os organoides são vascularizados por vasos sanguíneos perfundidos que consistem em uma combinação de CE derivada de organoides humanos e de frango. Estes se espalham por todo o organoide e invadem as estruturas glomerulares, possibilitando a interação entre as CE e os podócitos. Foi demonstrado anteriormente que isso leva a uma maior maturação das estruturas organ.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos a George Galaris (LUMC, Leiden, Holanda) por sua ajuda com a injeção de embrião de galinha. Agradecemos o apoio de Saskia van der Wal-Maas (Department of Anatomy &Embryology, LUMC, Leiden, Holanda), Conny van Munsteren (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, Holanda), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Holanda) e Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Holanda). M. Koning é apoiado por «Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC». Este trabalho foi em parte apoiado pelo Leiden University Fund "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. Este trabalho é apoiado pelos parceiros....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,2 µ filtro m: Filtro de seringa Whatman Puradisc 30 0.2 µ m | Whatman | 10462200 | |
| pratos com fundo de vidro de 35 mm | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradas | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contém tubos de silicone, bocal e conector |
| Microscópio confocal: Microscópio Confocal a Laser de Luz Branca Leica | Leica | TCS SP8 | |
| Pinça de dissecação, tipo simples. Titânio, curvo, com pontas finas e afiadas | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Pinça de dissecação, tipo simples. Titânio, reto, com pontas finas e afiadas | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Wild Heerbrugg | 355110 | ||
| Tesoura de dissecação, curva, OP-especial, extra afiada/afiada | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Soro de burro | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | diluição 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | diluição 1:500 |
| Lâminas de barbear de aço inoxidável de dupla aba | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, cálcio, magnésio (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, sem cálcio, sem magnésio (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Caixas de ovos ou porta-ovos personalizados | NA | NA | |
| Ovos de leghorn branco fertilizados (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | Incubadora NA | |
| Elbanton BV | ET-3 combi | ||
| Lotus Tetragonolobus lectina (LTL) Biotinilated | Vector Laboratories | B-1325 | diluição 1:300 |
| Microtesouras, retas, afiadas/afiadas, comprimento de corte 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapilares: Capilares de vidro de parede fina 1,5 mm, filamento | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Extrator de micropipetas | Sutter Instrument Company | Modelo P-97 | Usamos as seguintes configurações: Calor 533, Tração 60, Velocidade 150, Tempo 200 |
| Suporte de microbisturi: Lâmina Castroviejo e suporte de pinos, 12 cm, cabo redondo, garras cônicas de 10 mm. | Euronexia | L-120 | |
| Meio de montagem: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Parafilme Reda | 41146-18 | |
| Heathrow Scientific | HS234526B | ||
| Penicilina-estreptomicina 5.000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Colher perfurada | Euronexia | S-20-P | |
| 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Pipetas de transferência de plástico | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Anticorpo anti-CD31 humano purificado | de camundongo BD Biosciences | 555444 | diluição 1:100 |
| Lente marcada com rodamina Aglutinina Culinaris (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | Este produto foi recentemente descontinuado. A Vectorlabs ainda produz LCA marcado com Dylight 649 (DL-1048-1) e LCA marcado com fluoresceína (FL-1041-5) |
| Anticorpo anti-NPHS1 de ovelha | R & D systems | AF4269 | diluição 1:100 |
| Agulhas hipodérmicas estéreis, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Estreptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | diluição 1:200 |
| Seringa 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Fita transparente | Tesa | 4124 | Disponível na maioria das lojas de ferragens |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fio de tungstênio, 0,25 mm de diâmetro; | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
Referências
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al.
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Reimpressões e permissões
