Artigo de método

Vascularização Eficiente de Organoides Renais através do Transplante Intracelomico em Embriões de Galinha

DOI:

10.3791/65090

⸱

17 de fevereiro de 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine - Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory of Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 3IBPS, CNRS UMR7622, Developmental Biology Laboratory, Sorbonne Université, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Apresentamos aqui um protocolo detalhado para o transplante de organoides renais na cavidade celômica de embriões de galinha. Este método induz a vascularização e maior maturação dos organoides em 8 dias e pode ser usado para estudar esses processos de maneira eficiente.

Resumo

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Os organoides renais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos contêm estruturas semelhantes a néfrons que se assemelham às do rim adulto até certo ponto. Infelizmente, sua aplicabilidade clínica é dificultada pela falta de uma vasculatura funcional e, consequentemente, maturação limitada in vitro. O transplante de organoides renais na cavidade celômica de embriões de galinha induz a vascularização por vasos sanguíneos perfundidos, incluindo a formação de capilares glomerulares, e aumenta sua maturação. Esta técnica é muito eficiente, permitindo o transplante e análise de um grande número de organoides. Este trabalho descreve um protocolo detalhado para o transplante intracelomico de organoides renais em embriões de galinha, seguido da injeção de lectina fluorescentemente marcada para coloração da vasculatura perfundida e da coleta de organoides transplantados para análise de imagem. Este método pode ser usado para induzir e estudar a vascularização e maturação de organoides para encontrar pistas para melhorar esses processos in vitro e melhorar a modelagem de doenças.

Introdução

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Organoides renais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) têm demonstrado potencial para estudos de desenvolvimento 1,2,3,4, triagem de toxicidade 5,6 e modelagem de doenças5,7,8,9,10,11,12,13. Entretanto, sua aplicabilidade para esses e eventuais transplantes clínicos é limitada pela falta de uma rede vascular. Durante o desenvolvimento renal embrionário, podócitos, células mesangiais e células endoteliais vasculares (CEs) interagem para formar a intrincada estrutura do glomérulo. Sem essa interação, a barreira de filtração glomerular, composta por podócitos, membrana basal glomerular (MBG) e CE, não pode se desenvolver adequadamente14,15,16. Embora os organoides renais in vitro contenham algumas CE, estas não formam uma rede vascular adequada e diminuem com o passar do tempo17. Portanto, não é surpreendente que os organoides permaneçam imaturos. O transplante em camundongos induz vascularização e maturação dos organoides renais 18,19,20,21. Infelizmente, este é um processo trabalhoso que é inadequado para a análise de um grande número de organoides.

Embriões de galinha têm sido utilizados para estudar vascularização e desenvolvimento há mais de um século22. São de fácil acesso, requerem baixa manutenção, não possuem sistema imunológico totalmente funcional e podem desenvolver-se normalmente após a abertura da casca do ovo23,24,25,26. Demonstrou-se que o transplante de organoides em sua membrana corioalantóide (CAM) leva à vascularização27. No entanto, a duração do transplante na MAC, bem como o nível de maturação do enxerto, são limitados pela formação de CAM, que leva até o 7º dia embrionário para ser concluída. Portanto, recentemente foi desenvolvido um método para vascularizar eficientemente e amadurecer organoides renais através do transplante intracelomico em embriões degalinha28. A cavidade celômica de embriões de galinha é conhecida desde a década de 1930 como um ambiente favorável para a diferenciação de tecidos embrionários29,30. Pode ser acessado no início do desenvolvimento embrionário e permite a expansão relativamente ilimitada do enxerto em todas as direções.

Este trabalho descreve um protocolo para o transplante de organoides renais derivados de hiPSC na cavidade celômica de embriões de galinha do dia 4. Este método induz vascularização e maior maturação dos organoides em 8 dias. A injeção de aglutinina culinaris fluorescentemente marcada (LCA) antes do sacrifício dos embriões permite a visualização dos vasos sanguíneos perfundidos dentro dos organoides através da microscopia confocal.

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Protocolo

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De acordo com a legislação holandesa, a aprovação do comitê de bem-estar animal não era necessária para esta pesquisa.

1. Preparação de organoides renais derivados da hiPSC para transplante

  1. Diferenciar hiPSCs de organoides renais utilizando o protocolo desenvolvido por Takasato et al.4,18,31. Cultura dos organoides seguindo este protocolo em pastilhas de cultura celular de poliéster com poros de 0,4 μm (insertos de cultura celular) até o 7º + 12º dia de diferenciação. Cada inserção de cultura celular conterá três organoides.
  2. Remova os organoides da inserção da cultura celular.
    1. Faça um orifício no meio da membrana da cultura celular com um par de pinças dissecantes. Usando tesoura dissecante, faça três cortes na membrana do orifício no meio até a borda da inserção da cultura celular, cortando entre os organoides. Isso resultará em três pedaços de membrana, cada um com um organoide ligado, que ainda estão conectados à inserção da cultura celular em sua borda externa.
    2. Segure um dos pedaços de membrana perto de sua borda externa com um par de pinças e solte-o da inserção de cultura celular. Coloque o pedaço de membrana com o organoide anexado em uma placa de Petri. Adicione algumas gotas de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco sem cálcio e magnésio (DPBS-/-) ao organoide para evitar a desidratação. Repita para os outros dois organoides.
  3. Bissetriz os organoides mantendo sua membrana no lugar com pinças e cortando-os ao meio com uma lâmina de barbear de aço inoxidável de borda dupla (um organoide inteiro é muito grande para o celom acomodar nesta fase de desenvolvimento). Empurre suavemente as duas metades organoides para fora da membrana com uma dissecção da dura-máter. Descarte a membrana e deixe os organoides em DPBS-/- até o transplante.
    NOTA: Prepare um máximo de três organoides de cada vez para o transplante para evitar estresse para os organoides antes do transplante. O ideal é que uma pessoa prepare os organoides enquanto outra realiza o transplante.

2. Preparação de embriões de galinha para transplante

  1. Incubar ovos fertilizados de leghorn branco. Iniciar a incubação dos ovos no dia 7 + 8 de diferenciação organoide renal para garantir o momento correto do transplante.
    1. Coloque os ovos fertilizados de chifre branco (Gallus domesticus) horizontalmente sobre um suporte (Figura 1A; Dia 0), marcando o meio do lado voltado para cima com um lápis.
      NOTA: Suportes de plástico feitos sob medida ou caixas de ovos podem ser usados como suportes para incubar os ovos.
    2. Colocar o suporte com os ovos em estufa umidificada a 38 ± 1 ºC (Figura 1A; Dia 0).
    3. Incubar os ovos por 3 dias, mantendo a bacia de água na incubadora cheia.
  2. Crie uma janela na casca do ovo no dia 3 de incubação.
    1. No dia 3 de incubação, coloque um pequeno pedaço (~1 cm x 0,5 cm) de fita transparente na ponta pontiaguda do ovo (extremidade pequena). Faça um pequeno orifício na casca do ovo no meio da fita transparente batendo com a ponta afiada de uma tesoura dissecante.
    2. Insira uma agulha de 19 G em uma seringa de 5 mL no orifício em um ângulo de 45°, evitando danos ao saco vitelino, e aspirar 2-3 mL de albumina do ovo para abaixar o embrião dentro do ovo. Sele o orifício com uma segunda peça (~1 cm x 0,5 cm) de fita transparente.
    3. Coloque um pedaço grande (~5 cm x 5 cm) de fita transparente no lado do ovo marcado a lápis, virado para cima. Faça um furo na casca do ovo no meio da fita transparente batendo com a extremidade afiada de uma tesoura dissecante (Figura 1A; Dia 3).
    4. A partir deste orifício, corte uma pequena janela circular na casca do ovo usando uma tesoura de dissecação curva. Olhe através dessa janela para localizar o embrião e, em seguida, amplie a janela para otimizar o acesso ao embrião (Figura 1A; Dia 3).
    5. Remova todos os pedaços grandes de casca de ovo que possam ter caído em cima do embrião usando fórceps. Remova pedaços menores colocando algumas gotas de DPBS com cálcio e magnésio (DPBS+/+) no embrião com uma pipeta de transferência plástica e, em seguida, aspirando o DPBS+/+ com a casca do ovo na pipeta.
    6. Adicione três gotas de DPBS+/+ suplementado com penicilina/estreptomicina a 0,5% ao ovo usando uma pipeta plástica de transferência.
    7. Selar cuidadosamente a janela com um pedaço grande (~5 cm x 5 cm) de fita transparente antes de colocar o ovo de volta na incubadora até o 4º dia de incubação, quando o embrião estiver no estágio Hamburger-Hamilton 23-24 (HH 23-24)32.
      OBS: Selar a janela é muito importante para evitar a desidratação e morte do embrião.
    8. Verifique a viabilidade dos embriões diariamente olhando-os através da fita (não remova a fita para evitar a desidratação). Durante esses primeiros dias de incubação, a cor da gema do ovo muda de amarelo brilhante para amarelo fosco após a morte do embrião. Descarte embriões falecidos.
    9. Mantenha a bacia de água na incubadora cheia.

3. Transplante intracelomico no 4º dia de incubação

  1. Obtendo acesso à cavidade celômica
    1. Corte a fita da janela com uma tesoura de dissecação curva.
    2. Coloque o ovo sob um microscópio dissecante em um suporte de borracha ou caixa de ovo.
    3. O embrião de galinha encontra-se agora em HH 23-24 e deitado do lado esquerdo, com o lado direito voltado para o observador (Figura 1A; Dia 4). Localize a asa direita e o broto da perna do embrião, pois o celom será acessado entre esses dois brotos de membros. Na área entre a asa direita e o broto da perna, crie uma abertura consecutivamente na membrana vitelina, no córion e no âmnio, segurando-os com dois pares de pinças dissecantes e puxando-os suavemente em direções opostas.
      NOTA: A membrana vitelina é a primeira membrana que é encontrada após a abertura do ovo, e em alguns casos, já está danificada após fazer a janela no dia 3. Se o embrião for rotacionado, deitado do lado direito com o lado esquerdo voltado para o observador (Figura 1A; dia 4), é necessário dar a volta por cima para possibilitar o transplante. Para fazer isso, faça uma grande abertura na membrana vitelínica e coriônica e, em seguida, gire cuidadosamente o embrião usando pinças.
    4. Verifique se há acesso desobstruído à cavidade celômica: segure suavemente a borda da parede do corpo entre a asa e o broto do membro com um par de pinças dissecantes e puxe-o levemente em direção ao espectador. A cavidade celômica deve ser claramente visível. Insira cuidadosamente um instrumento rombo, mas fino (por exemplo, um fio de tungstênio rombo em um suporte de microbisturi) na cavidade celômica.
      NOTA: Se a inserção do instrumento rombo na cavidade celômica não for possível, significa que uma ou mais das membranas não foram abertas corretamente.
  2. Transplante
    1. Coloque metade de um organoide dentro do ovo em cima do alantois usando uma dura-máter.
    2. Usando pinças dissecadoras, segure cuidadosamente a borda da parede do corpo e puxe-a levemente em direção ao espectador para tornar visível a abertura para o celom.
      NOTA: Evite danificar os vasos sanguíneos na parede do corpo.
    3. Mova suavemente o organoide em direção e através da abertura na parede do corpo para o celom com um fio de tungstênio rombo em um suporte de microbisturi. Empurre o organoide ligeiramente cranialmente para aloja-lo dentro do celom. Agora é visível logo atrás do broto da asa (Figura 1A; Dia 4).
    4. Adicione três gotas de DPBS+/+ ao ovo usando uma pipeta de transferência de plástico.
    5. Sele cuidadosamente a janela com um pedaço grande (~5 cm x 5 cm) de fita transparente antes de colocar o ovo de volta na incubadora até o 12º dia de incubação (8 dias após o transplante).
    6. Continue verificando a viabilidade dos embriões diariamente olhando para eles através da fita (não remova a fita para evitar a desidratação). Descarte embriões falecidos.
      NOTA: À medida que os embriões e suas membranas corioalantóicas crescem, eles se tornam mais claramente visíveis através da fita. A falta de movimento do embrião e vasos sanguíneos colapsados ou esparsos são um sinal de morte embrionária.
    7. Verifique a bacia de água na incubadora diariamente e mantenha-a cheia.

4. Injeção de lectina fluorescentemente marcada

  1. Preparação para injeção
    1. Faça agulhas de microinjeção de vidro puxando microcapilares de vidro em um extrator de micropipeta com as seguintes configurações: Calor 533, Tração 60, Velocidade 150, Tempo 200. Ao olhar através do microscópio de dissecação, quebre cuidadosamente as pontas das agulhas de microinjeção usando pinças dissecadoras para criar uma abertura.
      NOTA: As configurações necessárias para o extrator de micropipeta podem diferir dependendo da máquina.
    2. Monte o sistema de injeção. Pegue dois pedaços de tubos de silicone de 38 cm e conecte-os um ao outro colocando um filtro de 0,2 μm entre eles. Insira um bocal na extremidade do tubo que está conectado com a saída do filtro (tubo de silicone 1) e um conector na extremidade do tubo que está conectado com a entrada do filtro (tubo de silicone 2). Finalmente, insira a agulha de microinjeção no conector (Figura 1B).
    3. Diluir a aglutinina culinaris (LCA) fluorescentemente marcada com DPBS-/ - até uma concentração de 2,5 mg mL-1 em um tubo de 0,5 mL e girar para baixo por ~30 s em uma microcentrífuga para mover os agregados para o fundo do tubo.
    4. Pipetar 20 μL de ACV sobre um pedaço de parafilme.
    5. Aspirar os 20 μL de ACV do parafilme para a agulha microcapilar do sistema de injeção montado.
  2. Injecção
    1. Corte a fita da janela com uma tesoura de dissecação curva. Coloque o ovo sob um microscópio dissecante em um suporte de borracha.
    2. Avaliar a vasculatura e localizar as veias, que podem ser distinguidas das artérias por sua coloração vermelha levemente mais brilhante (Figura 1A; dia 12). Para melhorar o acesso à vasculatura, amplie cuidadosamente a janela cortando com tesoura dissecante curva. Selecione uma veia injetável com base na acessibilidade e tamanho.
    3. Insira a ponta da agulha microcapilar na veia selecionada em um ângulo de 0°-20º. Certifique-se de que a agulha está na veia, movendo suavemente a ponta de um lado para o outro. Soprar suave e firmemente no sistema de injeção para injetar a ACV (Figura 1A; dia 12).
      NOTA: Se a agulha na veia estiver na posição correta, ela deve ficar dentro dos limites da veia.
    4. Coloque o ovo de volta na incubadora por 10 min para deixar a ACV circular.
      OBS: Não é necessário selar o ovo com fita adesiva durante esse período.

5. Coleta de organoides transplantados no 12º dia de incubação

  1. Sacrificando o embrião de galinha
    1. Coloque o ovo em um suporte de borracha no banco. Corte a fita da janela com uma tesoura de dissecação curva. Em seguida, corte as membranas que envolvem o embrião com uma tesoura dissecante curva.
      NOTA: Um microscópio dissecante não é necessário para esta etapa.
    2. Retire o embrião do ovo com uma colher perfurada e decapite imediatamente o embrião usando uma tesoura. Coloque o corpo do embrião em uma placa de Petri sob o microscópio de dissecção.
  2. Localização e coleta de organoides
    1. Coloque o embrião de costas na placa de Petri e espalhe os membros.
    2. Abra cuidadosamente a parede abdominal do embrião ao longo do eixo longitudinal usando pinças.
    3. Localize o organoide dentro do embrião. O organoide mais frequentemente se fixa ao lobo hepático direito, seja na ponta caudal ou cranialmente logo abaixo da caixa torácica (Figura 1A; dia 12). Portanto, recomenda-se começar procurando nesses locais.
    4. Uma vez localizado o organoide, retire-o do embrião cortando-o com micro tesoura. Coloque o organoide e o tecido de frango que está inevitavelmente ligado a ele em uma placa de Petri sob o microscópio dissecante. Remova o máximo possível de tecido de frango com uma lâmina de barbear de aço inoxidável de borda dupla.
    5. Processar o organoide dependendo da análise desejada.

6. Coloração de imunofluorescência de montagem total

  1. Colocar um organoide transplantado em uma placa de 24 poços e fixar em 500 μL de paraformaldeído (PFA) a 4 °C por 24 h. Lave 3x com DPBS-/-.
  2. Permeabilizar e bloquear o organoide em 300 μL de solução de bloqueio (Triton-X a 0,3% em DPBS-/- contendo 10% de soro de burro) por 2 h à temperatura ambiente.
  3. Preparar a mistura primária de anticorpos: para um organoide, diluir os anticorpos primários NPHS1 (ovelha-α-humana, diluição de 1:100), CD31 (rato-α-humano, diluição de 1:100) e LTL (conjugada com biotina, diluição de 1:300) em 300 μL de solução de bloqueio. Adicionar a mistura de anticorpos ao organoide e incubar durante 72 h a 4 °C.
  4. Lave 3x com 0,3% TritonX em DPBS-/-.
  5. Preparar a mistura de anticorpos secundários: para um organoide, diluir anticorpos secundários burro-α-ovelha Alexa Fluor 647 (diluição de 1:500), burro-α-rato Alexa Fluor 488 (diluição de 1:500) e estreptavidina Alexa Fluor 405 (diluição de 1:200) em 300 μL de solução de bloqueio. Adicione a mistura de anticorpos secundários ao organoide e incube por 2-4 h à temperatura ambiente. Cubra com papel alumínio para evitar a exposição dos anticorpos secundários à luz.
  6. Lave 3x com DPBS-/-.
  7. Incorpore o organoide em ~30 μL de meio de montagem em uma placa de fundo de vidro de 35 mm e deixe secar durante a noite à temperatura ambiente, coberto com papel alumínio. Conservar a 4 °C.
  8. Imagem utilizando microscópio confocal.

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Resultados

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O método e o cronograma para diferenciação de hiPSCs em organoides renais, incubação de ovos de galinha fertilizados, transplante de organoides renais, injeção de ACV e coleta dos organoides estão resumidos na Figura 1A. É importante coordenar o momento da diferenciação organoide e incubação dos ovos de galinha, iniciando a diferenciação 15 dias antes da incubação. As ações nos dias 0, 3, 4 e 12 de incubação são ilustradas por fotografias abaixo da linha do tempo. Os organoides são transplan...

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Discussão

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Neste manuscrito, um protocolo para transplante intracelomico de organoides renais derivados de hiPSC em embriões de galinha é demonstrado. Após o transplante, os organoides são vascularizados por vasos sanguíneos perfundidos que consistem em uma combinação de CE derivada de organoides humanos e de frango. Estes se espalham por todo o organoide e invadem as estruturas glomerulares, possibilitando a interação entre as CE e os podócitos. Foi demonstrado anteriormente que isso leva a uma maior maturação das estruturas organ...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a George Galaris (LUMC, Leiden, Holanda) por sua ajuda com a injeção de embrião de galinha. Agradecemos o apoio de Saskia van der Wal-Maas (Department of Anatomy &Embryology, LUMC, Leiden, Holanda), Conny van Munsteren (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, Holanda), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Holanda) e Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Holanda). M. Koning é apoiado por «Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC». Este trabalho foi em parte apoiado pelo Leiden University Fund "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. Este trabalho é apoiado pelos parceiros da Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) e Health Holland, Top Sector Life Sciences and Health. C.W. van den Berg e T.J. Rabelink são apoiados pelo Centro da Fundação Novo Nordisk para Medicina de Células-Tronco (reNEW), O Centro da Fundação Novo Nordisk para Medicina de Células-Tronco é apoiado por subsídios da Fundação Novo Nordisk (NNF21CC0073729).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,2 µ filtro m: Filtro de seringa Whatman Puradisc 30 0.2 µ mWhatman10462200
pratos com fundo de vidro de 35 mm MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradasSigma-AldrichA5177-5EAContém tubos de silicone, bocal e conector
Microscópio confocal: Microscópio Confocal a Laser de Luz Branca Leica LeicaTCS SP8
Pinça de dissecação, tipo simples. Titânio, curvo, com pontas finas e afiadasHammacher KarlHAMMHTC091-10
Pinça de dissecação, tipo simples. Titânio, reto, com pontas finas e afiadasHammacher KarlHAMMHTC090-11
 Wild Heerbrugg355110
Tesoura de dissecação, curva, OP-especial, extra afiada/afiadaHammacher KarlHAMMHSB391-10
Soro de burroSigma-AldrichD9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-212-02diluição 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA-21448diluição 1:500
Lâminas de barbear de aço inoxidável de dupla abaElectron Microsopy Sciences72000
DPBS, cálcio, magnésio (DPBS-/-)ThermoFisher Scientific14040133
DPBS, sem cálcio, sem magnésio (DPBS+/+)ThermoFisher Scientific14190094
Caixas de ovos ou porta-ovos personalizados NANA
Ovos de leghorn branco fertilizados (Gallus Gallus Domesticus) Drost Loosdrecht B.V.Incubadora NA
Elbanton BVET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectina (LTL) BiotinilatedVector LaboratoriesB-1325diluição 1:300
Microtesouras, retas, afiadas/afiadas, comprimento de corte 10 mmHammacher KarlHAMMHSB500-09
Microcapilares: Capilares de vidro de parede fina 1,5 mm, filamentoWorld Precision InstrumentsTW150F-3
Extrator de micropipetasSutter Instrument CompanyModelo P-97Usamos as seguintes configurações: Calor 533, Tração 60, Velocidade 150, Tempo 200
Suporte de microbisturi: Lâmina Castroviejo e suporte de pinos, 12 cm, cabo redondo, garras cônicas de 10 mm.EuronexiaL-120
Meio de montagem: Prolong Gold Antifade Mountant ThermoFisher ScientificP36930
Olivecrona dura dissector 18 cm Parafilme Reda41146-18
Heathrow ScientificHS234526B
Penicilina-estreptomicina 5.000 U/mLThermoFisher Scientific15070063
Colher perfurada EuronexiaS-20-P
60 x 15 mm CELLSTAR628160
Pipetas de transferência de plástico ThermoFisher ScientificPP89SB
Anticorpo anti-CD31 humano purificadode camundongo BD Biosciences555444diluição 1:100
Lente marcada com rodamina Aglutinina Culinaris (LCA)Vector LaboratoriesRL-1042Este produto foi recentemente descontinuado. A Vectorlabs ainda produz LCA marcado com Dylight 649 (DL-1048-1) e LCA marcado com fluoresceína (FL-1041-5)
Anticorpo anti-NPHS1 de ovelhaR & D systemsAF4269diluição 1:100
Agulhas hipodérmicas estéreis, 19 GBD microlance301500
Estreptavidin Alexa Fluor 405ThermoFisher ScientificS32351diluição 1:200
Seringa 5 mLBD Emerald307731
Fita transparente Tesa4124Disponível na maioria das lojas de ferragens
Triton XSigma-AldrichT9284
Fio de tungstênio, 0,25 mm de diâmetro;ThermoFisher Scientific010404.H2
Microscópio de dissecação Placa de Petri

Referências

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