Os produtos xenogênicos (químicos ou derivados de animais) introduzidos nas etapas de preparação/manipulação da terapia celular estão associados a um risco aumentado de reatividade imunológica e transmissão patogênica em pacientes hospedeiros. Aqui, um método completo livre de xenogênicos para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano é descrito.
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Artigo de método
Isolamento e cultura de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano com um método inovador livre de xenogênicos para terapia humana
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Considerando o crescente impacto da terapia com células-tronco, preocupações de biossegurança têm sido levantadas em relação à potencial contaminação ou transmissão de infecção devido à introdução de produtos derivados de animais durante a manipulação in vitro . Os componentes xenogênicos, como colagenase ou soro fetal bovino, comumente usados durante as etapas de isolamento e expansão celular podem estar associados aos riscos potenciais de reatividade imunológica ou infecção viral, bacteriana e príon nos pacientes receptores. Seguindo as diretrizes de boas práticas de fabricação, a dissociação química do tecido deve ser evitada, enquanto o soro fetal bovino (FBS) pode ser substituído por suplementos livres de xenogenes. Além disso, para garantir a segurança dos produtos celulares, é importante a definição de métodos mais fiáveis e reprodutíveis. Desenvolvemos um método inovador, completamente livre de xenogenes, para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano sem alterar suas propriedades em comparação com os protocolos padrão cultivados com colagenase FBS. Aqui, células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hASCs) foram isoladas do tecido adiposo abdominal. A amostra foi picada mecanicamente com tesoura/bisturi, microdissecada e dispersa mecanicamente em placa de Petri de 10 cm e preparada com incisões de bisturi para facilitar a fixação dos fragmentos de tecido e a migração de hASCs. Seguindo as etapas de lavagem, os hASCs foram selecionados devido à sua aderência plástica sem digestão enzimática. Os hASCs isolados foram cultivados com meio suplementado com lisado plaquetário humano livre de heparina a 5% e destacados com um substituto de tripsina livre de animais. Seguindo as instruções das boas práticas de fabrico (BPF) sobre a produção de produtos celulares destinados à terapia humana, não foram utilizados antibióticos em nenhum meio de cultura.
Introdução
Nas últimas décadas, a crescente demanda por tratamentos terapêuticos inovadores deu origem a esforços significativos e investimentos em recursos no campo da medicina translacional1. Os produtos à base de células estão associados a riscos determinados pela fonte celular, pelo processo de fabricação (isolamento, expansão ou modificação genética) e pelos suplementos não celulares (enzimas, fatores de crescimento, suplementos de cultura e antibióticos), e esses fatores de risco dependem da indicação terapêutica específica. A qualidade, a segurança e a eficácia do produto final podem ser profundamente influenciadas pelos elementos acima indicados
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Protocolo
Os hASCs foram isolados do tecido adiposo abdominal de uma mulher saudável que foi submetida à reconstrução mamária usando retalhos autólogos abdominais (retalhos perfuradores epigástricos inferiores profundos, [DIEP]) no Hospital Universitário de Lausanne, CHUV, Lausanne, Suíça. A parte descartada do retalho e do tecido adiposo foi obtida após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. Todos os protocolos foram revisados e aprovados pelo Departamento de Biobanco DAL do hospital (número 314 GGC) e comitês de ética de acordo com a Declaração de Helsinque.
NOTA: Todas as etapas devem ser executadas sob um exaustor de fluxo la....
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Resultados
Aplicando o método de isolamento detalhado acima, os hASCs foram obtidos com sucesso a partir de amostras de tecido adiposo abdominal sem o uso de colagenase. Além disso, os hASCs foram expandidos em condições livres de xenogenea, na presença de hPL e sem quaisquer outros componentes de origem animal. Os resultados a seguir corroboram o protocolo e são obtidos a partir de hASCs cultivadas em paralelo com hPL e com FBS como condição controle.
Após o aparecimento inicial do cluster, os hASCs apr.......
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Discussão
As células-tronco derivadas de tecido adiposo têm atraído o interesse da pesquisa translacional na última década devido à sua abundância, métodos de isolamento rápidos e acessíveis, alta taxa de proliferação in vitro/in vivo e propriedades de caule/diferenciação18,19,20. Como resultado, as hASCs são consideradas um excelente candidato para estratégias baseadas em células em medicina regenerativa
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores não têm reconhecimentos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de 15 mL | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Solução de enxágue (tampão FACS) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| Aparelho BD Accuri C6 (instrumento de citometria de fluxo) | Câmara BD accuri-Burker | ||
| Blaubrand | 717810 | ||
| Recipiente de congelamento | de células corning | ||
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Ensaio de proliferação celular | Promega | G3582 | |
| CoolCell Recipiente de congelamento | Corning | ||
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| bisturi de lâmina descartável | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (grau GMP) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Espectrofotômetro Infinite F50 | Microscópio | Tecan-Óptico | |
| ampliação de 4x e 10x | Olympus | CKX41 | |
| Placa de Petri 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Bisturis estéreis | Reda | 07104-00 | |
| Tesoura estéril | Bochem | 4071 | |
| Pinças estéreis | Bochem | 1152 | |
| Centrífuga de balde oscilante | Sigma | 3-16K | |
| Frascos T25 | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (substituto de tripsina livre de animais) | GIBCO | 12604-013 |
Referências
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G.
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Reimpressões e permissões
