Summary
세포 치료제 준비/조작 단계에 도입된 이종(화학적 또는 동물 유래) 제품은 숙주 환자에서 면역 반응성 및 병원성 전파의 위험 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 인간 지방유래 줄기세포의 분리 및 시험관내 확장을 위한 완전한 이종발생학적 무함유 방법이 기재되어 있다.
Abstract
줄기 세포 치료의 증가하는 영향을 고려할 때, 체외 조작 중 동물 유래 제품의 도입으로 인한 잠재적 오염 또는 감염 전파에 대한 생물학적 안전성 문제가 제기되었습니다. 세포 분리 및 확장 단계에서 일반적으로 사용되는 콜라게나제 또는 소 태아 혈청과 같은 이종 성분은 수용 환자의 면역 반응성 또는 바이러스, 박테리아 및 프리온 감염의 잠재적 위험과 관련될 수 있습니다. Good Manufacturing Practice 지침에 따라 화학적 조직 해리를 피해야 하며 소 태아 혈청(FBS)은 이종성이 없는 보충제로 대체할 수 있습니다. 또한, 셀 제품의 안전성을 보장하기 위해서는 보다 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법의 정의가 중요합니다. 우리는 콜라겐 분해 효소 FBS 배양 표준 프로토콜과 비교하여 특성을 변경하지 않고 인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 시험관 내 확장을 위한 혁신적이고 완전히 이종 발생이 없는 방법을 개발했습니다. 여기서, 복부 지방 조직으로부터 인간 지방유래 줄기세포(hASCs)를 분리하였다. 샘플을 가위/메스로 기계적으로 다진 후 미세 해부하고 10cm 페트리 접시에 기계적으로 분산시킨 다음 메스 절개로 준비하여 조직 조각의 부착과 hASC의 이동을 용이하게 했습니다. 세척 단계에 따라, hASC는 효소 소화 없이 소성 부착으로 인해 선택되었습니다. 분리된 hASC를 5% 헤파린이 없는 인간 혈소판 용해물이 보충된 배지로 배양하고 동물이 없는 트립신 대체물로 분리했습니다. 인간 치료용 세포 제품 생산에 대한 GMP(Good Manufacturing Practice) 지침에 따라 모든 배양 배지에 항생제를 사용하지 않았습니다.
Introduction
지난 수십 년 동안 혁신적인 치료법에 대한 수요가 증가함에 따라 중개 의학 분야에 상당한 노력과 자원 투자가 이루어졌습니다1. 세포 기반 제품은 세포 공급원, 제조 공정(분리, 확장 또는 유전자 변형) 및 비세포 보충제(효소, 성장 인자, 배양 보충제 및 항생제)에 의해 결정되는 위험과 관련이 있으며 이러한 위험 요소는 특정 치료 적응증에 따라 다릅니다. 최종 제품의 품질, 안전성 및 효능은 위에 명시된 요소2에 의해 크게 영향을 받을 수 있습니다. 줄기 세포 치료는 생물 안전 원칙을 준수해야합니다. 세포 배양에서 동물 유래 제품으로 인한 병원성 전파의 잠재적 위험은 문제가 될 수 있으며 제조에 도입된 모든 제품에 대한 철저한 테스트가 필수적입니다3.
인간 지방유래 줄기세포(hASC)를 분리하는 전통적인 방법은 콜라게나제(collagenase)를 이용한 효소 분해 후 원심분리를 통한 세척 단계를 거친다4. 효소 분리는 일반적으로 세포 수율 및 생존력 측면에서 다른 기계적 기술보다 더 효율적인 것으로 간주되지만, 콜라게나제와 같은 동물 유래 성분은 미국 식품의약국(FDA)에서 최소한으로 조작하는 것 이상으로 간주됩니다. 이는 면역 반응이나 질병 전파의 위험이 현저히 증가하여 hASC 요법의 임상 환경으로의 번역을 제한한다는것을 의미합니다 5,6.
트립신 기반 소화는 ASC를 분리하는 또 다른 효소 프로토콜입니다. 트립신 농도, 원심분리 속도 및 배양 시간 측면에서 약간의 수정을 가하여 다양한 기술이 설명되었습니다. 안타깝게도 이 방법은 잘 설명되어 있지 않으며, 문헌, 특히 기계적 격리 프로토콜7에 대한 비교가 부족하다. 그러나, 접근법의 번역 가능성의 관점에서, 트립신은 콜라게나제와 동일한 단점을 가지고 있습니다.
기계적 힘에 기초하고 효소를 첨가하지 않고 ASC를 얻기 위한 대체 분리 방법에는 지방 조직 조각의 고속 원심분리(800 x g 또는 1,280 x g, 15분)가 포함됩니다. 이어서, 펠렛을 적혈구 용해 완충액(5분)과 함께 인큐베이션한 후, 배양 배지에서 재현탁하기 전에 600 x g에서 또 다른 원심분리 단계를 거친다. 체외이식편 방법에 비해 첫 번째 날에 더 많은 수의 세포가 분리되었음에도 불구하고, 이전 연구에서는 배양 2주 이후에 증식이 더 낮거나 없는 것으로 나타났다8.
그 외에도, 세포 배양을 위한 성장 인자 보충제로 사용되는 소 태아 혈청(FBS)과 같은 이종 첨가 배지를 사용한 추가 조작은 숙주 환자의 면역 반응성 위험 증가 및 바이러스, 박테리아 또는 프리온 감염에 대한 노출과 관련이 있다 9,10. 면역 반응과 두드러기형 발진 발달은 FBS11로 생산된 중간엽 줄기 세포를 여러 번 투여받은 개인에서 이미 설명되었습니다. 또한, FBS는 배치-배치(batch-to-batch) 변동성을 가지며, 이는 최종 제품 품질에 영향을 미칠 수 있다12.
GMP(Good Manufacturing Practice) 지침에 따라 효소 조직 해리를 피해야 하며 FBS는 이종유전자가 없는 보충제로 대체해야 합니다. 이러한 단계들은 보다 신뢰할 수 있고 재현 가능한 프로토콜과 함께, 세포 치료제의 적용을 지원하는 데 필수적이다 3,13.
이러한 맥락에서, 인간 혈소판 용해물(hPL)은 무세포, 단백질 함유, 성장 인자 강화 보충제이기 때문에 FBS의 대체품으로 제안되어 왔으며, 시험관 내 세포 배양 및 확장을 위한 성장 배지의 첨가제로서 임상 등급 세포 기반 제품들 사이에 일찍이 도입되었다14,15. hPL은 인간 유래 제품이기 때문에 임상 적용을 위한 hASC의 체외 배양 중에 FBS의 대체물로 자주 사용되어 FBS 번역성과 관련된 면역학적 반응 및 감염과 관련된 문제를 줄입니다15,16.
더 높은 생산 비용에도 불구하고 FBS에 비해 hPL은 많은 세포 유형에 대한 세포 생존력을 지원하고, 증식을 증가시키고, 노화를 지연시키고, 게놈 안정성을 보장하고, 후기 세포 계대에서도 세포 면역 표현형을 보존한다는 것이 이미 입증되었습니다. 이러한 모든 요소는 이 문화 보충11로의 전환을 지원합니다.
이 연구의 목적은 기존의 FBS 배양 hASC와 비교하여 세포 생리학 및 줄기 특성을 수정하지 않고 완전한 동물 없는 방법으로 hASC를 분리 및 배양하는 표준화된 프로토콜을 개발하는 것이었습니다(그림 1).
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Protocol
hASC는 스위스 로잔 CHUV에 있는 로잔 대학 병원에서 복부 자가 피판(심부 하복부 천공 피판, [DIEP])을 사용하여 유방 재건술을 받은 건강한 여성의 복부 지방 조직에서 분리되었습니다. 플랩의 폐기된 부분과 지방 조직은 환자가 정보에 입각한 동의서에 서명한 후 얻었습니다. 모든 프로토콜은 헬싱키 선언에 따라 병원의 바이오뱅크 부서 DAL(번호 314 GGC) 및 윤리 위원회에서 검토하고 승인했습니다.
알림: 모든 단계는 층류 후드와 무균 조건에서 수행해야 합니다. 개인 보호를 위한 장갑과 실험복은 항상 착용해야 하며 모든 표면은 적절한 살생물제로 세척해야 합니다. 과도한 조직은 생물 의학 폐기물로 적절하게 처리해야 합니다.
1. 필요한 재료 및 배양 용액 준비
- 세포 분리, 확장 및 냉동 보존을 위해 다음 기기를 구하십시오: 멸균 가위; 멸균 메스; 멸균 핀셋; 10cm 페트리 접시; 15mL 튜브; T25 플라스크; 버커 챔버; 극저온; 세포 동결 용기; 4x 및 10x 배율 대물렌즈를 가진 광학 현미경; 그리고 스윙 버킷 원심 분리기.
- 면역 표현형을 위해, 다음의 기구 및 시약을 얻는다: FACS 튜브, 멸균 인산염 완충 식염수 (PBS); 둘베코의 최소 필수 배지 (DMEM); hPL입니다. 디메틸 설파이드; 그리고 동물성 없는 트립신.
- DMEM에 5% 헤파린이 없는 hPL을 보충하여 완전한 배양액을 준비합니다. 배지를 4°C에서 최대 3주 동안 보관하고 항상 따뜻하게 사용하십시오(실온에서 37°C 사이). 인간 치료를위한 세포 의약품 생산에 대한 GMP 지침에 따라 배양 배지에 항생제를 첨가하지 마십시오.
- DMEM에서 20% hPL과 10% 디메틸설파이드를 포함하는 동결배지를 준비한다.
2. 지방 조직 샘플에서 hASC의 분리
- 지방 조직 샘플을 얻은 후 6시간 이내에 처리합니다. 확립된 기계적 이종발생이 없는 분리 방법을 진행하기 전에 결합 조직과 혈액이 방출될 때까지 10분 동안 PBS로 조직을 2배 세척합니다.
- hASC 생존력을 손상시키지 않기 위해, 복부성형수술로부터 얻어진 지방 조직 샘플을 처리될 때까지 4°C에서 PBS에 보관하고, 어떤 경우에도 24시간 이하로 보관한다.
- 멸균 가위로 지방 조직을 약 1cm2 의 작은 조각으로 자릅니다.
- 메스를 사용하여 각 조각을 직경 <5mm의 작은 조각으로 미세 해부하고 그 중 5개를 10cm 페트리 접시에 분산시킵니다(그림 2A).
- 각 조각을 부착하려면 메스를 사용하여 플라스틱 표면에 절개를 만들고 페트리 접시에 단단히 붙을 때까지 각 조각을 끕니다. 핀셋을 사용하여 조각을 처리할 수 있습니다(그림 2B).
- 모든 단편을 분리하지 않고 덮을 수 있도록 완전한 배양 배지 10mL를 부드럽게 추가합니다.
- 페트리 접시를 37°C 및 5%CO2에서 배양한다. hASC는 조직 밖으로 이동하여 효소 소화 없이 소성 부착으로 인해 선택됩니다.
- 세포가 합류할 때까지 하루에 한 번 4배 배율로 광학 현미경으로 hASC 확장을 모니터링합니다. hASC가 조직에서 빠져 나오기 시작하면 전형적인 섬유 아세포와 같은 형태를 가진 조직 조각 주위에 작은 클러스터로 나타납니다. hASC는 플라스틱 표면에 부착할 수 있는 능력 때문에 선택됩니다. 72시간마다 가능한 한 많은 배지를 제거하고 세포 파편을 제거하기 위해 새로운 완전 배지로 교체합니다.
- 일반적으로 7 일 후에 세포의 첫 번째 통과가 이루어질 때까지 조직 조각을 그대로 두십시오.
3. 분리 단계 후의 hASC 배양
- hASC 배양이 70%-80% 밀도에 도달하면 hASC를 분리하고 추가로 확장하여 다른 실험이나 장기 보관에 사용할 수 있습니다.
- 멸균 핀셋을 사용하여 페트리 접시에서 모든 티슈 조각을 제거하고 버립니다. hASC를 분리하지 않도록 만지지 않도록 주의하면서 소진된 매체를 제거하고 폐기하십시오.
- PBS 10mL로 세포를 조심스럽게 한 번 세척합니다. 1x 동물성 없는 트립신 1mL를 넣고 페트리 접시를 37°C의 인큐베이터에 5분 동안 둡니다.
- 모든 세포가 분리되었는지 4배 배율로 광학 현미경으로 확인합니다. 그렇지 않으면 페트리 접시를 인큐베이터에 추가로 2분 동안 그대로 두고 플라스틱 표면을 부드럽게 두드려 세포 분리를 지원합니다.
- 2mL의 완전 배지를 추가하여 트립신 작용을 중지하고 15mL 튜브에 모든 세포를 수집합니다.
- 남아 있는 트립신을 제거하기 위해 튜브를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 5mL의 완전 배지로 세포를 현탁한 다음 세포 현탁액을 새로운 T25 플라스크에 옮깁니다. hASC를 배양 물에 보관하고 필요할 때까지 확장하십시오.
4. 유세포 분석에 의한 면역표현형 조사
- hASC 배양이 70%-80% 밀도에 도달하면 섹션 3에서 설명한 대로 hASC를 분리합니다.
- 세포를 수집한 후 1mL의 완전 배지에 현탁하고 광학 현미경으로 10x 배율로 세포 계수기로 분취량을 계산합니다.
- hASC를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 1 x 106 cells/mL의 FACS 완충액에서 현탁합니다. 1 x 105 세포를 함유하는 현탁액 100 μL을 하나의 FACS 튜브에 옮깁니다. 조사된 각 항원에 대해 하나의 FACS 튜브를 사용하고 각 동형 대조군에 대해 하나의 FACS 튜브를 더 사용합니다.
- FACS 완충액에 희석된 다음 항체 100μL로 세포를 염색합니다: 항-CD73(1:1,000, IgG1, FITC 표지), 항-CD105(1:200, IgG1, PE 표지); 항-CD34 (1:66, IgG1, FITC-표지됨); 항-CD45 (1:66, IgG1, FITC-표지됨); 및 각 형광단, IgG1 FITC 표지(1:1,000) 및 IgG1 PE 표지(1:50)에 대한 동형 대조군.
- 샘플을 4°C에서 교반하면서 암실에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 튜브를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버리고, 500 μL의 FACS 완충액에 세포를 현탁시킵니다.
- 유세포 분석 기기로 세포 면역표현형을 평가하고, 세포 파편을 배제하기 위해 선택된 게이트 내부의 각 튜브에 대해 50,000개의 이벤트를 기록합니다. 발현 세포의 백분율을 특정 동형 대조군과의 차이로 계산합니다.
5. hASC의 증식 분석
- hASC 배양이 70%-80% 밀도에 도달하면 섹션 3에 설명된 대로 hASC를 분리합니다.
- 세포를 수집한 후 1mL의 완전 배지에 현탁하고 광학 현미경으로 10x 배율로 세포 계수기로 분취량을 계산합니다.
- 96웰 투명 플레이트에서 200μL의 완전 배지에 5 x 102hASC 를 시드합니다. 각 시점에 대해 하나의 웰을 사용하여 기술 반복실험에서 셀을 시드합니다.
- 파종 후 3일째에 제조업체의 지침에 따라 증식 분석 키트를 사용하여 세포 증식을 검출하기 시작합니다. 간단히 말해서, 배양 배지를 웰당 20 μL의 분석 시약에 첨가된 100 μL의 새로운 배지로 교체합니다. 시약 개발을 위해 hASC를 37°C, 5%CO2 에서 2.5시간 동안 배양한 다음 분광광도계로 490nm에서 흡광도를 검출합니다.
- hASC 증식을 블랭크 흡광도를 제거한 후의 흡광도 백분율로 표현한다.
6. hASC의 냉동 보존 및 보관
- 섹션 3에 설명된 대로 세포를 분리하고 10x 배율의 광학 현미경 하에서 세포 계수기로 분취량을 계수합니다.
- 세포를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 1 x 106 hASCs/mL의 밀도로 동결 혼합물로 세포를 현탁하고 1mL의 세포 용액을 하나의 극저온 난에 옮깁니다.
- 온도를 1°C/min으로 낮추는 냉동 용기에 -80°C의 극저온 액체를 넣은 다음 장기 보관을 위해 극저온 액체를 액체 질소로 옮깁니다.
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Representative Results
위에서 설명한 분리 방법을 적용하면 콜라게나제를 사용하지 않고 복부 지방 조직 샘플에서 hASC를 성공적으로 얻을 수 있습니다. 더욱이, hASC는 hPL의 존재 하에 그리고 동물 기원의 다른 성분 없이 완전한 이종유전자가 없는 조건에서 확장되었다. 다음 결과는 프로토콜을 지원하며 hPL 및 FBS를 대조 조건으로 병행하여 배양된 hASC에서 얻습니다.
초기 클러스터 출현 후, hASC는 고전적인 방추형을 보였으며 FBS가 있는 대조군 세포에 비해 더 작고 길었습니다(그림 3). 유세포 분석에 의해 평가된 세포 면역표현형은 두 보충제와 함께 배양된 hASC 간에 유사한 것으로 나타났다. 특히, hASCs의 80%-90% 이상이 CD73 17 및 CD105 17에 대해 양성이었고, 5% 미만이 CD34 17 및 CD45 17을 발현하였다(도 4). 마지막으로, 증식 분석은 FBS 대조군에 비해 hPL을 배지에 첨가했을 때 세포 성장이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 5).
그림 1: 프로토콜의 그래픽 요약. 인간 지방유래 줄기세포의 분리 및 시험관 내 확장을 위한 이종이네틱 프리 방법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 시험관 내 배양에서 hASC를 얻기 위한 지방 조직 절단 및 파종 공정. (A) 지방 조직을 직경 <5mm의 조각으로 미세 해부하고 10cm 페트리 접시에 조각을 분산시킵니다. (B) 메스로 플라스틱 표면을 절개한 후 페트리 접시에 부착. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: hASC의 형태. 이종발생이 없는 조건에서 배양된 hASC는 방추형과 같은 모양과 길쭉한 형태를 보였다. 대조군으로 FBS의 존재 하에서 배양된 hASC는 더 컸고 과녁 모양을 가졌습니다. 스케일 바는 100μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: hASC의 면역 표현형. hASCs의 면역표현형은 hPL 및 FBS의 존재 하에서 유사하였다. 특히, 두 조건 모두에서 hASC는 CD73 및 CD105에 대해 양성이고 CD34 및 CD45에 대해 음성으로 간주될 수 있습니다. 오차 막대는 표준 오차(n = 3)를 나타냅니다. 약어: hPL = 인간 혈소판 용해물; FBS = 소 태아 혈청. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: hASC 증식. 이종유전자가 없는 조건에서 확장된 hASC는 FBS가 있는 경우보다 훨씬 더 많이 증식했습니다. ** p < 0.01(스튜던트 t-검정으로 평가된 유의성, n = 3). x축은 시드 후 일 수로 시간을 나타냅니다. 약어: hPL = 인간 혈소판 용해물; FBS = 소 태아 혈청; hASCs = 인간 지방 유래 줄기 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
지방유래 줄기세포는 풍부함, 빠르고 저렴한 분리 방법, 높은 in vitro/in vivo 증식률 및 줄기/분화 특성으로 인해 지난 10년 동안 중개 연구의 관심을 끌었습니다18,19,20. 그 결과, hASC는 재생 의학에서 세포 기반 전략의 우수한 후보로 간주된다21. 지방 조직으로부터 분리된 후, hASC는 시험관 내에서 확장이 필요하며, 경우에 따라 특정 치료 적용에 사용되기 전에 분화 단계를 거쳐야 합니다. 분리, 시험관 내 확장 및 최종 차별화를 포함한 전체 프로세스는 번역 관점에서 위험을 줄이기 위해 GMP 지침에 따라 수행되어야 합니다22,23.
분리 과정과 관련하여, 효소 분해 및 원심분리 단계는 비교적 짧은 시간에 많은 수의 hASC를 빠르게 산출하는 반면, 이전 보고서에서는 이러한 방법이 다른 기계적 분리 방법에 비해 클러스터 분화 마커 측면에서 세포 표현형 변화를 일으킬 수 있음을 보여주었고, 따라서 이러한 hASC를 인간 환자에게 적용할 때 생물학적 안전성, 세포 특성 및 행동 문제에 대한 의문을 제기했습니다3 . 또한, 이종 성분과 관련된 위험을 최소화하기 위해 최근 연구에서는 합성 효소 또는 기계적 방법을 사용하여 hASC를 분리할 것을 제안했습니다. 그러나 합성 효소조차도 세포 프로파일을 변형시켜 제품 품질에 영향을 미칠 수 있다24. 반대로, 여기에서 조사된 체외이식편 기반 방법은 hASC가 이종 시약을 사용하지 않고 조직 밖으로 이동하여 플라스틱 표면에 자연적으로 부착되기 때문에 번역 목적을 위한 유효한 대안이 될 수 있다9. 동시에, 이 방법은 고전적인 콜라게나제 분리에 비해 낮은 세포 수율을 입증했다는 점을 고려해야 한다25.
보충 배지와 관련하여 hPL이 hASC 생리학적 특성 26,27,28,29를 변경하지 않고 FBS보다 더 높은 정도로 hASC 확장을 지원한다는 데 동의하는 최근 문헌을 기반으로 기존 FBS 첨가 배지를 hPL 16으로 대체했습니다. hPL로 세포 배양을 지원함으로써 세포 수율 감소와 기계적 분리와 관련된 느린 회복을 극복했습니다. 이러한 덜 조작된 hASC는 효율적이고 안전한 방식으로 임상적으로 관련된 부피에 도달하는 데 필요한 확장을 허용하는 속도로 시험관 내에서 증식했습니다30,31. 더욱이, hPL을 사용한 배양은 hASCs의 전형적인 줄기-유사 특징 및 면역표현형을 변화시키지 않았으며, 따라서 이들 세포의 치료적 관심이 유지되었음을 의미한다.
우리가 아는 한, ASC에 대해 다양한 체외이식편 분리 프로토콜이 설명되었지만, 우리의 방법은 ASC의 이종 없는 기계적 분리와 hPL 보충 배지 배양을 결합하여 번역 적용을 위한 귀중한 세포 집단을 얻는 최초의 방법입니다.
그 외에도 이 작업에서 설명하는 방법에는 더 자세히 설명해야 하는 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. 첫째, 다진 지방 조직 조각의 직경은 플라스틱 표면과의 접착을 촉진하고 hASC가 조직 밖으로 이동할 수 있도록 5mm를 초과해서는 안됩니다. 둘째, 플레이트에 이미 부착 된 hASC와 함께 배양 중 지방 조직 단편의 존재는 오염 위험과 충분한 수의 이동 된 세포의 필요성을 고려하여 균형을 이루어야한다. 셋째, 연구자들은 이식편 파종 후 처음 24시간 동안 성장률이 감소할 수 있음을 인식해야 합니다. 이 기간이 지나면 hPL 보충은 고전적인 FBS30에 비해 세포 회복 및 증식을 자극합니다.
현재로서는 위에서 설명한 원래 프로토콜과 비교하여 추가 단계나 수정 사항이 도입되지 않았습니다.
결론적으로, 여기에 기술된 완전한 이종발생 없는 방법은 동물 유래 생성물, 화학적 효소 또는 원심분리 단계 없이 지방 흡인 및 복부 지방 조직 모두를 포함하는 지방 조직으로부터 hASC를 분리하는 간단한 방법을 제공한다. 또한, hPL 보충 배지는 hASC의 치료 특성을 변경하지 않고 유지하면서 결과적인 초기 세포 수율 저하를 상쇄하고 세포 증식을 향상시킵니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 인정하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
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