O presente protocolo descreve como medir dados de parâmetros de vida comuns em mosquitos Aedes aegypti , incluindo fecundidade, tamanho da asa, fertilidade, proporção sexual, viabilidade, tempos de desenvolvimento, contribuição masculina e longevidade adulta. Essas medições podem ser usadas para avaliar a aptidão de mosquitos transgênicos.
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Artigo de método
Quantificando os custos de aptidão em mosquitos Aedes aegypti transgênicos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os mosquitos transgênicos geralmente apresentam custos de condicionamento físico em comparação com seus equivalentes do tipo selvagem. Nesse sentido, os estudos de custo de aptidão envolvem a coleta de dados de parâmetros de vida de mosquitos geneticamente modificados e a comparação com mosquitos sem transgenes do mesmo fundo genético. Este manuscrito ilustra como medir características comuns da história de vida no mosquito Aedes aegypti, incluindo fecundidade, tamanho e forma das asas, fertilidade, proporção sexual, viabilidade, tempos de desenvolvimento, contribuição masculina e longevidade adulta. Esses parâmetros foram escolhidos por refletirem o sucesso reprodutivo, serem simples de mensurar e serem comumente relatados na literatura. Os resultados representativos quantificam os custos de aptidão associados a um nocaute genético ou a uma única inserção de um elemento de condução genética. Padronizar como os dados dos parâmetros de vida são coletados é importante porque esses dados podem ser usados para comparar a saúde dos mosquitos transgênicos gerados em estudos ou para modelar a taxa de fixação do transgene em uma população simulada de mosquitos do tipo selvagem. Embora este protocolo seja específico para Aedes aegypti transgênico, o protocolo também pode ser usado para outras espécies de mosquitos ou outras condições experimentais de tratamento, com a ressalva de que certos contextos biológicos podem exigir adaptações especiais.
Introdução
A sobrevivência do mais apto é a ideia darwiniana de que os indivíduos que abrigam genes mais bem adaptados ao seu ambiente passarão esses genes paraas gerações subsequentes. Isso significa que é a aptidão que determina se seus genes sobreviverão. Esse conceito de mais de 150 anos é talvez o determinante mais significativo da engenharia de um gene drive bem-sucedido em mosquitos transgênicos. Os impulsos genéticos, ou o padrão de herança super-mendeliano de um elemento genético egoísta que permite que ele se espalhe pelas populações2, estão sendo explorados para o manejo genético de pragas3. No co....
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Protocolo
NOTA: Este protocolo foi escrito para linhagens transgênicas e selvagens de Ae. aegypti que foram previamente validadas e estabelecidas. Para mais informações sobre a geração de Ae. aegypti transgênico, ver Kistler et al.22 e Coates et al.23. Todos os experimentos descritos abaixo foram realizados sob procedimentos padrão de criação de Ae. aegypti . Os mosquitos foram mantidos a 28 °C com umidade relativa de 75% a 80% e um ciclo de 12 h de luz / 12 h de escuridão. Um mínimo de 100 papéis de ovo individuais por mancha de mosquito é altamente recomendado para fins estatísticos. ....
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Resultados
Seguindo o protocolo acima, a aptidão de duas linhagens de mosquitos foi avaliada: (1) knock out mediado por CRISPR/Cas9 da proteína salivar D7L1 (AAEL006424) de Ae. aegypti e (2) linhagens de Ae. aegypti expressando unidades gênicas autônomas mediadas por CRISPR/Cas99. No caso do primeiro, uma linha de knock-out D7L1 homozigótica foi estabelecida explorando a via de junção final não homóloga (NHEJ) para gerar a interrupção após microinjetar embriões com sgRNAs específicos para o.......
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Discussão
Os estudos de aptidão de Ae. aegypti são frequentemente realizados em laboratório para avaliar os custos de aptidão associados à carga transgênica (por exemplo, elementos de genética dirigida) ou nocautes genéticos, conforme discutido neste manuscrito; no entanto, esses estudos podem ser realizados para uma variedade de propósitos - qualquer um que vise avaliar a saúde de um grupo de Ae. aegypti, como infectado por Wolbachia 30,31
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Bill Reid e Alexander Franz, da Universidade de Missouri, por seu apoio com este protocolo. Os autores também gostariam de agradecer ao Dr. Benjamin Krajacich do NIH / NIAID por seu apoio com a análise R. Este estudo foi financiado pelo NIH, número de concessão R01 AI130085 (KEO) e pela Divisão NIH / NIAID do Programa de Pesquisa Intramural AI001246 (EC).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Copos de suflê de plástico translúcido de 1 oz. | WebstaurantStore | 301100PC | |
| Copos de suflê de poliestireno translúcido de 2 oz. | WebstaurantStore | 760P200N | |
| Pipetadores de plástico de 3 mL | Cornin | 357524 | |
| tubos cônicos de 50 mL | Qualquer marca | ||
| 64 oz. copo de comida de papel poli-revestido branco duplo | WebstaurantStore | 999SOUP64WB | para encolhimento de mosquitos |
| lente de 65 mm | Canon | MP-E 65mm f/2.8 1-5x Foto Macro | Canon Foto Macro MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; para fotografar asas ou papéis de ovo, embora outras câmeras sejam provavelmente suficientes |
| Aedes aegypti mosquitos | BEI | várias cepas como ovos estão disponíveis | |
| Alimentadores de membrana artificiais | https://lillieglassblowers.com/ | alimentador de membrana Meduim, feito sob medida, 33mm | Chemglass também oferece, mas os tamanhos estão errados para nós. Os nossos têm cerca de 3 cm? |
| ATP | MP Biomedical | ICN15026605 | Qualquer alíquotas estéreis de boa qualidade ATP, filtro de 10mM a -20 |
| Autoclave | para esterilização de água para incubação | ||
| Câmera Canon EOS 7D | Canon | 3814B004 | para fotografar asas ou papéis de ovo, embora outras câmeras provavelmente sejam suficientes |
| para sangue de ovelha desfibrinado | Colorado Serum Co. | 60 ml, a cada 2 semanas | https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated |
| Iluminador de microscópio pescoço de ganso duplo | Dolan Jenner Fiber-Lite 180 | 181-1 Sistema | |
| etanol | |||
| Fórceps | Dumont | 5SF | |
| Gaze | omnisorb ii | 4 "esponjas não tecidas | |
| lâmina | de microscópio de vidroFisher Scientific | 12-544-2 | |
| Placas de Petri de Vidro, 100 &vezes; 15 mm | VWR | 75845-546 | para anestesia/manipulação de mosquitos no gelo |
| Intestino de porco | Qualquer delicatessen | que compramos a granel, dividimos, lavamos e armazenamos em pequenas alíquotas de ~4X12" a -20 em 50 ml cônico | |
| Balde | |||
| de gelo | |||
| Kimwipe | Microscópio | ||
| Leica GZ4 StereoZoom | para triagem de mosquitos transgênicos (se aplicável) | ||
| tamanho 10-0 | para manipulação de larvas/pupas (Amazon) | ||
| Mangueira de calcinha | Walmart | L'eggs Everyday | Meias de Nylon Plus Joelho para Mulheres Bico Transparente, 16 pares (mais cabe na caixa) |
| Lápis | Qualquer marca | ||
| Recipientes de plástico para 2° armazenamento de caixas | Walmart | Sterilite 58 Qt Caixa de Armazenamento Base Transparente Tampa Branca Conjunto de 8 | |
| recipientes de plástico para larvas em crescimento | Walmart | Sterilite 28 Qt. Caixa de Armazenamento de Plástico, Branco, Conjunto de 10 | |
| Recipientes de Plástico para Chocar Larvas | Walmart | Sterilite 6 Qt. Caixa de Armazenamento Plástico, Recipientes | |
| de Deli transparentes de polipropileno branco | Loja Webstaurant | 127DM12BULK | 12 oz, ou 16 oz se necessário para maiores (127RD16BULK) |
| Elásticos | Office Max | #100736/#909606 /#3777415 | 12", #64 e #10 |
| Tampa de borracha | VWR | 217-0515 | para fechamento de mosquitos |
| Fonte de açúcar, como cubos de açúcar ou passas | |||
| Tetramin flake food Tetramin | 16106 | ||
| tpsDig | Stony Brook Morphometrics | Um software gratuito de processamento de imagem morfométrica distribuído on-line disponível em https://www.sbmorphometrics.org/ | |
| tpsUtil | Stony Brook Morphometrics | Um software gratuito de processamento de imagem morfométrica distribuído on-line disponível em https://www.sbmorphometrics.org/ | |
| Tecido de organza branco 8 "&vezes; 8" | FabricWholesale.com | 4491676 | Tecido de Organza da Coleção Casa Joann da Casa Collection |
| Papel de filtro qualitativo Whitman Grade 1 | Whitman | 1001-824 | para papéis de ovo. A cor branca facilita a visualização dos ovos pretos. |
Referências
- Dawkins, R. The Selfish Gene. New edition. , University Press. Oxford, New York. Oxford. (1989).
- Crow, J. F. Unmasking a Cheating Gene. Science. 283 (5408), 1651-1652 (1999).
- Gould, F.
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Reimpressões e permissões
