Artigo de método

Plataforma de impedância elétrica baseada em células para avaliar inibidores do vírus Zika em tempo real

DOI:

10.3791/65149

⸱

24 de março de 2023

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Rega Institute for Medical Research, Laboratory of Virology and Chemotherapy, KU Leuven

Neste artigo

Resumo

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Aqui, demonstramos o uso da impedância elétrica baseada em células (CEI) como um método muito fácil e direto para estudar a infecção e replicação do vírus Zika em células humanas em tempo real. Além disso, o ensaio CEI é útil para a avaliação de compostos antivirais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A tecnologia de impedância elétrica baseada em células (CEI) mede as mudanças na impedância causadas por uma monocamada celular aderente crescente ou manipulada em poços de placa de cultura embutidos com eletrodos. A tecnologia pode ser usada para monitorar as consequências da infecção pelo vírus Zika (ZIKV) e a replicação celular aderente em tempo real, já que esse vírus é altamente citopatogênico. É um ensaio simples que não requer o uso de rótulos ou métodos invasivos e tem o benefício de fornecer dados em tempo real. A cinética da infecção pelo VZIK é altamente dependente da linhagem celular empregada, da cepa viral e da multiplicidade de infecção (MOI), que não podem ser facilmente estudadas com ensaios convencionais de desfecho. Além disso, o ensaio CEI também pode ser usado para a avaliação e caracterização de compostos antivirais, que também podem ter propriedades inibitórias dinâmicas ao longo da infecção. Este artigo de métodos fornece uma explicação detalhada da execução prática do ensaio CEI e suas potenciais aplicações na pesquisa do VZIK e na pesquisa antiviral em geral.

Introdução

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Surtos do vírus Zika (VZIK) estão associados a complicações graves da doença, como microcefaliae síndrome de Guillain-Barré1,2,3. Embora futuras epidemias sejam plausíveis devido a vários fatores de risco, como a disseminação da distribuição do mosquito vetor e o aumento da urbanização, até o momento, nenhuma vacina ou medicamento antiviral chegou ao mercadoaté o momento 3,4. Portanto, os métodos tradicionais de pesquisa do VZIK devem ser complementados com novas ferramentas para estudar este vírus e seus potenciais compostos antivirais. A pesquisa antiviral é frequentemente baseada em ensaios fenotípicos, onde o desfecho é a presença de um parâmetro específico, como o aparecimento de um efeito citopático induzido por vírus (CPE) ou a produção de uma determinada proteína induzida por vírus por meio de um gene repórter 5,6,7. No entanto, esses métodos têm leituras de endpoint, são trabalhosos e podem exigir análises complexas. Portanto, os métodos baseados em impedância oferecem uma alternativa atraente.

A impedância elétrica baseada em células (CEI) é definida como a resistência ao fluxo de corrente de um eletrodo para outro, causada por uma camada celular aderente semeada em poços contendo eletrodos. A tecnologia CEI estabelecida empregada nesta metodologia é o Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS), originalmente desenvolvido por Giaever e Keese 8,9. É utilizado em um amplo campo de domínios de pesquisa biológica, como metástase de câncer, toxicologia e cicatrização de feridas10,11,12. Seu princípio baseia-se em um campo elétrico que é gerado por uma varredura contínua de tensões de corrente alternada (CA) em uma faixa de frequências13. As células são expostas a esses campos elétricos não invasivos e, em intervalos pré-determinados, são medidas as mudanças de impedância causadas pelo crescimento celular ou alterações na aderência ou morfologiacelular14. Além disso, a viabilidade celular alterada também leva a alterações de impedância, tornando a tecnologia uma ferramenta útil para monitorar a infecção por vírus citopatogênicos15,16,17. Como mudanças morfológicas da camada celular serão detectadas na faixa nanométrica, a tecnologia oferece uma ferramenta de detecção altamente sensível. O ensaio CEI descrito neste artigo é um método fácil, não invasivo, em tempo real e livre de rótulos para medir as mudanças de impedância da camada celular ao longo do tempo.

Embora o CEI não tenha sido usado para avaliar o curso da infecção pelo VZIK ou seus potenciais antivirais, seu uso como ferramenta diagnóstica foi investigado antesde 18. Em um estudo recente, o uso do ensaio CEI para determinar a atividade antiviral de vários inibidores do VZIK em células A549 foi validado pela primeira vez19. Este artigo de métodos descreve este ensaio CEI em mais detalhes e expande-o para várias linhagens celulares aderentes, bem como uma variedade de cepas ZIKV em várias multiplicidades de infecção (MOI). Assim, o uso versátil deste método na pesquisa antiviral de flavivírus é demonstrado. O método tem o benefício crucial do monitoramento celular em tempo real, que permite a detecção de pontos de tempo importantes de infecção e a atividade inibidora dinâmica por potenciais compostos antivirais. Em conjunto, a tecnologia CEI oferece uma ferramenta poderosa e valiosa para complementar a gama atual de metodologias antivirais.

Protocolo

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Todas as etapas descritas são realizadas em condições estéreis em um gabinete de fluxo laminar de um laboratório de nível 2 de Biossegurança. Todos os vírus utilizados foram obtidos e utilizados conforme aprovado, de acordo com as regras de um comitê de revisão institucional belga (Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, protocolo SBB 219 2011/0011) e do Comitê de Biossegurança da KU Leuven.

1. Manutenção da cultura celular

NOTA: Este protocolo é realizado com uma seleção de linhagens celulares, mas pode, naturalmente, ser adaptado a qualquer linhagem celular aderente, exigindo apenas otimização da densidade de semeadura celular.

  1. Cultivar a linhagem celular de adenocarcinoma de pulmão humano A549, a linhagem de células de glioblastoma maligno humano U87 e as células de fibroblastos de pulmão embrionário humano HEL 299 em frascos de cultura T75 a 37 °C e 5% CO2 em uma incubadora umedecida.
  2. Subcultivar as células na confluência de 80%-95%. Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (TR) antes da cultura das células.
  3. Remova o meio de cultura condicionado das células. Use 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco para lavar a monocamada celular uma vez.
  4. Distribuir uniformemente 1 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25% sobre a monocamada celular. Em seguida, incubar por até 3 min a 37 °C até que as células comecem a se desprender.
  5. Adicionar 9 mL de meio de crescimento fresco completo (consulte a Tabela de materiais para obter detalhes). Pipetar suavemente para cima e para baixo para ressuspender as células.
  6. Transferir o volume desejado de suspensão celular para um novo frasco de cultura T75 e adicionar um volume apropriado de meio de crescimento fresco para obter um volume total de 15 mL.
    NOTA: As linhagens celulares in vitro utilizadas neste protocolo são subcultivadas em diluições de 1:4 a 1:10, dependendo da linhagem celular específica, para permitir condições ideais de crescimento. As subculturas são realizadas a cada 3-4 dias, de modo que o volume de suspensão celular desejado também pode variar com base no número de dias de incubação.

2. Preparo da placa CEI

  1. Pegue uma placa de 96 poços com eletrodos interdigitados (veja Tabela de Materiais) e preencha todos os poços com 100 μL de meio de cultura de crescimento.
  2. Preencha os espaços entre os poços com DPBS.
    NOTA: Isso é feito para reduzir o efeito de borda devido à evaporação que é observada ao cultivar células em placas de 96 poços.
  3. Incubar a placa durante 4 h a 37 °C numa estufa com 5% de CO2.

3. Semeadura de células

  1. Retirar as células do balão de cultura, conforme descrito na secção 1, e ressuspendê-las em meio de crescimento fresco num tubo de 50 ml.
  2. Conte o número de células viáveis usando o método de escolha.
    NOTA: No caso das células A549, a viabilidade geralmente atinge ~100%. Para determinar o número de células, usamos um sistema automatizado de análise celular baseado na coloração laranja de acridina/iodeto de propídio (ver Tabela de Materiais). Outros métodos de contagem de células funcionam igualmente bem.
  3. Ressuspender as células em meio de crescimento fresco para obter a densidade celular desejada. Neste estudo, a densidade celular A549 ótima é de 0,15 × 106 células (viáveis)/mL.
  4. Retire a placa de 96 poços com eletrodos interdigitados da incubadora e remova o meio com uma pipeta multicanal.
  5. Dispensar 100 μL da suspensão celular (correspondente a 15 × 103 células neste caso) por poço na placa de 96 poços.
  6. Deixe as células se equilibrarem por 15 min à temperatura ambiente antes de colocá-las no dispositivo CEI.

4. Configuração e execução do ensaio CEI

  1. Coloque a incubadora que abriga o suporte da placa do dispositivo CEI a 37 °C e 5% CO2.
  2. Coloque a placa de 96 poços no dispositivo.
  3. Abra o software do dispositivo e configure um novo experimento clicando em Configuração no painel Coletar Dados. Aguarde até que o laptop se conecte ao dispositivo ECIS e configure a placa verificando as impedâncias dos poços. Verifique se todos os poços estão configurados corretamente, conforme indicado por uma cor verde. Caso contrário, repita a etapa 4.2 até que todos os poços estejam verdes.
  4. No painel Configuração de Poço, selecione o tipo de matriz, de acordo com o material de cultura usado.
  5. Selecione o modo Frequência/Tempo múltiplo.
    NOTA: Neste modo, o dispositivo mede as alterações de impedância numa gama de frequências.
  6. Inicie a medição clicando em Iniciar.
    NOTA: A impedância em tempo real pode ser monitorada na interface do software. Selecione a frequência desejada a ser mostrada. Neste exemplo, 16 kHz é escolhido.

5. Preparação e incubação de compostos

NOTA: Como exemplo de um composto antiviral, a labirinthopeptina A1 é usada (consulte a Tabela de Materiais). Uma vez que este protocolo pode ser generalizado para todos os compostos com potencial atividade antiviral, nós nos referimos a ele como "o composto".

  1. Permitir que o meio de cultura celular completo sem a adição de soro fetal bovino (FBS) (referido como "tampão de ensaio") se equilibre na RT.
  2. Mantenha os compostos no gelo.
  3. Preparar uma diluição concentrada de 10x de cada composto em meio de ensaio em tubos de polipropileno de 5 mL.
  4. Diluir os compostos em meio de ensaio em tubos de polipropileno de 5 mL para obter as concentrações desejadas de 10x.
  5. Pause o dispositivo CEI clicando em Pausar no painel Configuração da Coleta de Dados. Aguarde o momento atual ser concluído e retire a placa de 96 poços.
  6. Verificar a aderência e formação de monocamada das células sob microscópio de luz.
  7. Retire 20 μL de cada poço com uma pipeta multicanal.
  8. Adicionar 20 μL de solução composta ou veículo nos poços desejados. Prepare um layout com as condições específicas para a pipetagem adequada.
  9. Incubar a placa durante 15 minutos a 37 °C com 5% de CO2.
    Observação : uma incubadora de células normal é usada para esta etapa de incubação em vez de um dispositivo CEI. Poços de controle celular (CC) são poços tratados com veículos.

6. Preparação do vírus e infecção

  1. Descongele um frasco de estoque de vírus. Neste exemplo, ZIKV MR766 e ZIKV PRVABC59 são usados.
  2. Preparar diluições virais no MOI desejado ou diluições em meio de ensaio em um tubo de polipropileno de 15 mL.
    Observação : neste exemplo representativo, MOI 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.005 e 0.00005 são usados.
  3. Adicionar 100 μL de diluição do vírus nos poços designados da placa de 96 poços. Adicionar meio de ensaio aos poços CC.
  4. Descontaminar os recipientes de vírus empregados.
  5. Coloque a placa de volta no dispositivo CEI e continue as medições por 6 dias consecutivos clicando em Retomar Experimento.
    NOTA: Os poços de controle de vírus (VC) são células infectadas tratadas com veículo, enquanto nos poços CC o meio de ensaio é adicionado em vez da diluição do vírus. Se a citotoxicidade dos compostos for avaliada, adicionar 100 μL de tampão de ensaio em vez da diluição do vírus.

7. Análise dos dados

  1. Termine o experimento clicando em Concluir e adicione comentários de resumo opcionais, como informações sobre as condições experimentais específicas na janela exibida. Clique em OK quando a coleta de dados estiver concluída.
  2. Selecione a frequência desejada no painel Gráfico onde a maior diferença de impedância entre CC e VC é medida no final do experimento.
    1. Para determinar a melhor frequência, execute um experimento piloto com células não infectadas e infectadas e escolha a frequência que, no momento em que a impedância das células infectadas caiu para seu nível basal, leva à maior diferença de impedância observada entre as células não infectadas e infectadas. No caso de células A549 infectadas com ZIKV, isso é de 16 kHz.
  3. Para exportar todos os dados em um formato de planilha, verifique se todos os poços estão selecionados no painel Configuração de Poço e clique em Arquivo | Exportar dados | Dados gráficos.
  4. Normalizar os dados subtraindo o valor médio de impedância de CV medido no final do experimento de todos os pontos de dados e dividindo-o pelo valor médio de impedância CC do último ponto de tempo medido antes da infecção.
  5. Plotar os dados normalizados na função do tempo para obter gráficos de perfil CEI.
  6. Calcular a área normalizada sob a curva (AUCn) de cada condição para determinar parâmetros como concentrações inibitórias de 50% (IC50).
  7. Calcule outros parâmetros úteis, como o CIT50, para, por exemplo, comparar a infectividade de várias cepas de vírus.

Resultados

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Neste artigo, o uso do ensaio CEI na pesquisa do VZIK é descrito em detalhes. O fluxo de trabalho deste ensaio é ilustrado na Figura 1. Demonstramos a conveniência do monitoramento em tempo real da infecção pelo VZIK em um tipo celular desejado, bem como a avaliação da inibição da infecção por um composto antiviral. Como exemplo antiviral, utilizamos o bem descrito peptídeo labirinthopeptina A1 (Laby A1); Referimo-nos a isso como "o composto", uma vez que suas propriedades específicas fogem ao escopo deste artigo de métodos e são discutidas em outra publicação20,21. Vale ressaltar que a reprodutibilidade do método não é discutida na seção de resultados, uma vez que queremos focar nos perfis individuais de impedância obtidos com a metodologia. No entanto, isso já foi descrito anteriormente19.

No primeiro conjunto de experimentos, demonstramos a importância da otimização da densidade celular na realização de ensaios de infecção por ICE (Figura 2). Quando muitas células são semeadas, a monocamada celular terá crescido completamente e será incapaz de se espalhar ainda mais pelos eletrodos CEI. Isso leva a uma menor diferença entre CC e CV e, portanto, a uma resolução menor, diminuindo a janela de detecção da atividade antiviral. Isso é bem exemplificado na Figura 2E. Para certos tipos de células maiores, como as células U87, a semeadura de células muito densas pode até levar ao desprendimento completo da monocamada celular ao manipular a placa, como demonstrado aqui (Figura 2F). Isso também é observado microscopicamente.

A Figura 2 também demonstra que o ensaio é muito útil para a realização de estudos de suscetibilidade celular. Está claro na Figura 2A,B que a cinética de infecção é altamente dependente do tipo celular. A Figura 2C demonstra que as células U87 só são suscetíveis à infecção pelo VZIK em MOIs elevados.

No segundo conjunto de experimentos, destaca-se o uso versátil do ensaio de infecção por CEI usando várias cepas de ZIKV em diferentes MOIs e na presença de um composto antiviral bem descrito (Figura 3). Esses experimentos são realizados com células A549, modelo comumente utilizado na pesquisa deflavivírus22,23. Essa linhagem celular também tem sido utilizada em outros estudos que demonstraram sua adequação em ensaios deICE24. Primeiro, a cinética de infecção por uma cepa representativa do ZIKV da linhagem africana MR766, é comparada com a da linhagem asiática PRVABC59. A Figura 3A demonstra que ambas as cepas têm padrões de CEI comparáveis, com PRVABC59 tendo propriedades indutoras de CPE ligeiramente mais lentas. Isso também é refletido pelos valores do CIT50 (Figura 3B). Esse interessante parâmetro foi introduzido pela primeira vez por Fang et al.16 e leva em consideração a cinética das medidas do ICE. É definido como o tempo necessário para reduzir a impedância em 50% em relação ao controle celular.

Em seguida, as células foram infectadas com três diferentes MOIs do ZIKV MR766 ou PRVABC59, na presença ou ausência de várias concentrações de compostos, e os perfis de impedância foram monitorados. Como pode ser observado na Figura 3C-H, certas concentrações de compostos inibem ou retardam a queda de impedância causada pela infecção pelo VZIK. Isso também é refletido quando os valores de AUC são calculados. Os resultados do ensaio CEI também demonstram visualmente que a atividade antiviral depende do MOI e do momento de avaliação da potência. Os cálculos de AUCn podem ser usados para determinar os valores de IC50, como demonstrado na Figura 3I. Finalmente, a Figura 3H mostra que os valores de CIT50 também podem ser usados para determinar e comparar potências compostas. Compostos inativos ou concentrações de compostos são caracterizados por perfis de CEI, AUC e valores de CIT50 comparáveis aos de VC.

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Figura 1: Visão geral esquemática do fluxo de trabalho do ensaio. A linha do tempo e as diferentes etapas de manuseio e incubação do ensaio CEI são descritas aqui. Abreviações: CEI = impedância elétrica baseada em células; ZIKV = vírus Zika; D = dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Perfis CEI normalizados de células infectadas pelo ZIKV em diferentes densidades. (A,D) A549, (B,E) HEL 299 ou (C,F) U87 células foram semeadas em (A-C) 15.000-20.000 ("ótima") ou (D-F) 75.000 ("subótima") células por poço em uma placa CEI de 96 poços. Após 24 h de impedância, as células foram infectadas com diluições dez vezes maiores de MOI do ZIKV MR766. A impedância foi monitorada por 5 dias consecutivos. São apresentados perfis CEI (média ± intervalo de duas réplicas técnicas) de uma experiência representativa. Abreviações: CEI = impedância elétrica baseada em células; MOI = multiplicidade de infecção; ZIKV = vírus Zika; Norma = normalizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Perfis normalizados de CEI de células A549 após infecção com duas cepas de ZIKV e inibição por um composto antiviral. (A) Células A549 aderentes foram infectadas com vários MOIs do ZIKV MR766 ou ZIKV PRVABC59, e a impedância foi monitorada continuamente. A média ± DP de três réplicas técnicas de um experimento representativo é mostrada. (B) Os valores de CIT50 foram calculados com base no perfil de A do ICE e comparados. A média ± DP das três réplicas técnicas realizadas é mostrada. (C-H) Células A549 aderentes foram tratadas com várias concentrações de compostos e posteriormente infectadas com um MOI específico de ZIKV MR766 (C-E) ou ZIKV PRVABC59 (F-H). A impedância foi monitorada continuamente. Mostra-se ± intervalo médio de duas réplicas técnicas de um experimento representativo. (I) Para comparar a inibição dos compostos contra diferentes cepas e diluições do ZIKV, a AUC n foi calculada, e as porcentagens inibitórias foram determinadas subtraindo-se todas as condições pela AUCCC n e dividindo-se pela AUCVC n. (J) Os valores de CIT50 do experimento mostrados em C-H foram calculados para comparar as diferentes cepas de ZIKV e MOI. A média ± intervalo de duas réplicas técnicas é mostrada. Abreviações: CEI = impedância elétrica baseada em células; MOI = multiplicidade de infecção; ZIKV = vírus Zika; Norma = normalizada; CIT 50 = tempo em que a impedância diminuiu50% em relação ao controle não tratado; AUC = área sob a curva; CC = controle celular; CV = controle viral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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Este artigo descreve o uso do ensaio CEI na pesquisa antiviral do ZIKV. O ensaio tem o benefício do monitoramento em tempo real e, portanto, pode ser usado para avaliar a cinética de infecção pelo VZIK e a inibição antiviral com compostos seletivos. Os dados obtidos com este método permitem uma observação objetiva e visual do ECP induzido pelo vírus e da potência de um potencial composto antiviral.

Como o CEI é um método muito sensível, muito cuidado deve ser tomado ao realizar este ensaio celular. É fundamental que a pipetagem precisa seja realizada para evitar ao máximo a variação da pipetagem. Além disso, outros fatores que podem influenciar os resultados experimentais, como o número de células e o estoque viral utilizado, devem ser mantidos constantes entre as repetições do experimento. Esses são fatores que influenciam fortemente a cinética de crescimento celular e infecção e, portanto, podem levar à variação nos valores calculados de CIT50 e/ou outros parâmetros.

Ao realizar o ensaio CEI na presença de compostos antivirais (potenciais), é importante determinar se eles influenciam a impedância das células na ausência de um vírus. A técnica é tão sensível que as alterações de impedância podem ser medidas bem abaixo das concentrações citotóxicas do composto19.

Embora apenas os dados do VZIK sejam mostrados neste artigo, o ensaio pode ser facilmente aplicado a outros vírus citopatogênicos (flavi), com apenas um mínimo esforço de otimização, como a determinação da frequência de monitoramento ideal do CEI. Adaptações do ensaio CEI têm sido empregadas com vários vírus humanos e animais, como chikungunya, influenza A e herpesvírus humano e equino25,26,27,28. Aqui, também é usado como um método simples para a quantificação de títulos virais ou para a identificação de compostos antivirais. Esses estudos utilizaram a análise celular em tempo real, um método alternativo de ICE.

O uso da tecnologia CEI é limitado aos tipos de células aderentes, pois o princípio do ensaio baseia-se nas propriedades das células aderentes para se espalharem pelos poços embutidos no eletrodo. Revestimentos superficiais de poços, como a fibronectina, podem ser usados para melhorar a fixação celular29. A metodologia tem algumas outras desvantagens, a primeira relacionada ao seu custo. Além do investimento no dispositivo de monitoramento CEI e no software que o acompanha, os consumíveis também são um pouco caros. Além disso, como o protocolo requer o monitoramento da infecção viral por vários dias, uma placa de 96 poços por semana pode ser avaliada. Juntamente com o alto custo, isso limita o uso a configurações de baixa a média taxa de transferência.

Devido a esses problemas de rendimento, a tecnologia não é adequada para configurações de triagem antiviral. No entanto, é altamente atraente em fases experimentais iniciais, por exemplo, quando se avalia a suscetibilidade celular para o estudo da infecção pelo VZIK em um determinado cenário relacionado à doença. A tecnologia também é útil com linhagens celulares transfectadas ou nocaute para observar facilmente mudanças na cinética de infecção, por exemplo, na presença ou ausência de certos receptores de entrada. Isso é interessante quando se investiga o envolvimento de fatores celulares na infecção pelo VZIK. Além disso, em fases pré-clínicas posteriores, quando um determinado candidato a chumbo foi selecionado, o ensaio CEI pode ser usado para uma caracterização mais aprofundada de um composto selecionado. Os biossensores CEI também podem ser modificados pela imobilização de certos elementos de biorreconhecimento, como anticorpos vírus-específicos, para a detecção de vírus18. Em conjunto, isso destaca o uso versátil de CEI em um ambiente de virologia.

Divulgações

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Os autores confirmam a inexistência de conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Os autores agradecem a Clément Heymann e Gorrit Lootsma pela revisão do manuscrito. O estudo foi apoiado por subsídios internos do Laboratório de Virologia e Quimioterapia (Rega Institute, KU Leuven).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células A549American Type Culture Collection (ATCC)CCL-185Essas células são cultivadas em MEM Rega-3 suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 0,075% de bicarbonato de sódio.
Mancha de Laranja de Acridina/Iodeto de PropídioLogos BiosystemsF23001Mancha viva/morta
Tubos de polipropileno Cellstar, 15 mLGreiner bio-one1,88,271
Tubos de polipropileno Cellstar, 50 mLGreiner bio-one2,27,261
Meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM)Gibco, Thermo Fisher Scientific41965-039Meio de cultura celular para U87 e células HEL 299
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific14190-094
ECIS cultureware 96W20idfApplied BioPhysics96W20idfPlaca de ensaio PET para dispositivo CEI
Sensor de impedância de substrato de célula elétrica (ECIS) Estação de matriz ZBiofísicaAplicadaDispositivo CEI, incluindo estação de 96 poços, módulo de controle externo e laptop com software de controle, aquisição e exibição. O software necessário é instalado antes do envio. NOTA: este dispositivo está atualmente fora de produção e foi substituído pelo dispositivo ECIS Z-Theta mais avançado Tubos de
poliestireno Falcon, 5 mLCorning352054
Fetal Bovine Serum (FBS)CytivaSV30160.03Aditivo de meio de cultura de células para todas as células usadas
HEL 299 célulasATCCCCL-137Essas células são cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS e 0,01 M de HEPES.
Buffer HEPES, 1 MGibco, Thermo Fisher Scientific15630-056Aditivo de meio de cultura celular para células U87
Labirinthopeptin A1Presente gentil do Prof. Dr. Roderich Sü ssmuth, Technische Universitä t Berlim, AlemanhaComposto antiviral usado como exemplo neste protocolo. É dissolvido em DMSO.
L-Glutamina, 200mM Gibco, Thermo Fisher Scientific25030-024Aditivo de meio de cultura celular para células A549
Lâminas de contagem de células LunaLogos BiosystemsL12001
Luna-FL contador de células de fluorescência duplaLogos BiosystemsL20001Contador de viabilidade celular
Meio Essencial Mínimo Rega-3 (MEM Rega-3)Gibco, Thermo Fisher Scientific19993013Meio de cultura celular para células A549
Bicarbonato de sódio, 7,5%Gibco, Thermo Fisher Scientific25080-060Aditivo de meio de cultura celular para células A549
Frasco de cultura de tecidos T75TPPY9076
Tripsina-EDTA, 0,25%Gibco, Thermo Fisher Scientific25200-056Reagente de dissociação
Células U87ATCCHTB-14Essas células são cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS e 0,01 M de HEPES.
  Comprimidos Virkon Rely+OnLanxess115-0020Solução desinfetante
Zika vírus (ZIKV) MR766ATCCVR-84Cepa protótipo de ZIKV, isolada de macaco sentinela Rhesus em Uganda em 1968
ZIKV PRVABC59ATCCVR-1843Cepa de ZIKV isolada de paciente em Porto Rico em 2015

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cao-Lormeau, V. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  2. Mlakar, J., et al. Zika virus associated with microcephaly. The New England. Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
  3. Pierson, T. C., Diamond, M. S. The emergence of Zika virus and its new clinical syndromes. Nature. 560 (7720), 573-581 (2018).
  4. Pergolizzi, J., et al. The Zika virus: Lurking behind the COVID-19 pandemic. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 46 (2), 267-276 (2021).
  5. Bernatchez, J. A., et al. Development and validation of a phenotypic high-content imaging assay for assessing the antiviral activity of small-molecule inhibitors targeting Zika virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), e00725(2018).
  6. Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
  7. Mottin, M., et al. Discovery of new Zika protease and polymerase inhibitors through the open science collaboration Project OpenZika. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (24), 6825-6843 (2022).
  8. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (12), 3761-3764 (1984).
  9. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  10. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (50), e2792(2011).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  12. Li, X., et al. Hsp70 suppresses mitochondrial reactive oxygen species and preserves pulmonary microvascular barrier integrity following exposure to bacterial toxins. Frontiers in Immunology. 9, 1309(2018).
  13. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  14. Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors and Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
  15. Pennington, M. R., Van de Walle, G. R. Electric cell-substrate impedance sensing to monitor viral growth and study cellular responses to infection with alphaherpesviruses in real time. mSphere. 2 (2), e00039(2017).
  16. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  17. McCoy, M. H., Wang, E. Use of electric cell-substrate impedance sensing as a tool for quantifying cytopathic effect in influenza a virus infected MDCK cells in real-time. Journal of Virological Methods. 130 (1-2), 157-161 (2005).
  18. Stukovnik, Z., Bren, U. Recent developments in electrochemical-impedimetric biosensors for virus detection. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 15922(2022).
  19. Oeyen, M., Meyen, E., Doijen, J., Schols, D. In-depth characterization of Zika virus inhibitors using cell-based electrical impedance. Microbiology Spectrum. 10 (4), e0049122(2022).
  20. Prochnow, H., et al. Labyrinthopeptins exert broad-spectrum antiviral activity through lipid-binding-mediated virolysis. Journal of Virology. 94 (2), e01471(2020).
  21. Oeyen, M., et al. Labyrinthopeptin A1 inhibits dengue and Zika virus infection by interfering with the viral phospholipid membrane. Virology. 562, 74-86 (2021).
  22. Vicenti, I., et al. Comparative analysis of different cell systems for Zika virus (ZIKV) propagation and evaluation of anti-ZIKV compounds in vitro. Virus Research. 244, 64-70 (2018).
  23. Gobillot, T. A., Humes, D., Sharma, A., Kikawa, C., Overbaugh, J. The robust restriction of Zika virus by type-I interferon in A549 cells varies by viral lineage and is not determined by IFITM3. Viruses. 12 (5), 503(2020).
  24. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137(2012).
  25. Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
  26. Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e61133(2021).
  27. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  28. Zandi, K. A real-time cell analyzing assay for identification of novel antiviral compounds against chikungunya virus. Methods in Molecular Biology. 1426, 255-262 (2016).
  29. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126(2022).

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