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Artigo de método

Caracterização comportamental de um modelo de camundongo com síndrome de Angelman

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DOI:

10.3791/65182

⸱

20 de outubro de 2023

 ,  , 
1Czech Centre for Phenogenomics, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2Laboratory of Transgenic Models of Diseases, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito apresenta um conjunto de testes comportamentais altamente reprodutíveis para validar um modelo de camundongo com síndrome de Angelman.

Resumo

Este manuscrito descreve uma bateria de testes comportamentais disponíveis para caracterizar fenótipos semelhantes à síndrome de Angelman (SA) em um modelo murino estabelecido de EA. Usamos o paradigma de aprendizado de rotarod, análise detalhada da marcha e teste de construção de ninhos para detectar e caracterizar deficiências motoras em animais. Testamos a emocionalidade dos animais em campo aberto e testes de labirinto em cruz elevados, bem como o efeito no teste de suspensão de cauda. Quando camundongos SA são testados no teste de campo aberto, os resultados devem ser interpretados com cuidado, uma vez que disfunções motoras influenciam o comportamento de camundongos no labirinto e alteram os escores de atividade.

A reprodutibilidade e eficácia dos testes comportamentais apresentados já foi validada em várias linhagens independentes de camundongos Uba3a com diferentes variantes knockout, estabelecendo este conjunto de testes como uma excelente ferramenta de validação em pesquisas de EA. Modelos com validade de construto e de face relevantes justificarão novas investigações para elucidar a fisiopatologia da doença e propiciar o desenvolvimento de tratamentos causais.

Introdução

A síndrome de Angelman (SA) é uma doença rara do neurodesenvolvimento. A origem genética mais comum da EA é uma grande deleção da região 15q11-q13 do cromossomo materno, que é encontrada em quase 74% dos pacientes1. A deleção dessa região causa a perda de UBE3A, o principal gene causador da EA que codifica uma ubiquitina ligase E3. O alelo paterno do gene UBE3A em neurônios é silenciado em um processo conhecido como imprinting. Como consequência, o imprinting paterno do gene permite apenas a expressão materna no sistema nervoso central (SNC)2. Portanto, a deleção do gene UBE3A do cromossomo materno leva ao desenvolvimento de sintomas de EA. Em humanos, a EA manifesta-se por volta dos 6 meses de idade, com retardo do desenvolvimento que persiste em todos os estágios de desenvolvimento e resulta em sintomas debilitantes graves nos indivíduos afetados 3,4. Os principais sintomas do transtorno incluem o déficit de habilidades motoras finas e grossas, incluindo marcha atáxica brusca, comprometimento grave da fala e deficiência intelectual. Aproximadamente 80% dos pacientes com EA também sofrem de distúrbios do sono e epilepsia. Até o momento, o único tratamento disponível são as drogas sintomáticas, que reduzem as crises epilépticas e melhoram a qualidade do sono1. Portanto, o desenvolvimento de modelos animais robustos com fenótipos comportamentais reprodutíveis, juntamente com análises fenotípicas refinadas, será essencial para elucidar os mecanismos fisiopatológicos do transtorno e descobrir medicamentos e tratamentos eficazes.

A complexidade da desordem humana que afeta o SNC exige que os organismos-modelo possuam genoma, fisiologia e comportamento comparáveis. Os camundongos são populares como um organismo modelo devido ao seu curto ciclo reprodutivo, tamanho pequeno e relativa facilidade de modificação do DNA. Em 1984, Paul Willner propôs três critérios de validação do modelo básico de doença: validade de construto, validade de face e preditiva, que são usados para determinar o valor do modelo5. Simplesmente, a validade de construto reflete os mecanismos biológicos responsáveis pelo desenvolvimento do transtorno, a validade de face recapitula seus sintomas e a validade preditiva descreve a resposta do modelo a drogas terapêuticas.

Para aderir aos princípios acima, escolhemos a etiologia genética mais comum, uma grande deleção do locus 15q11.2-13q materno, incluindo o gene UBE3A, para criar camundongos modelo AS. Usamos a técnica CRISPR/Cas9 para excluir uma região longa de 76.225 pb abrangendo todo o gene UBE3A, englobando tanto os elementos codificantes quanto os não codificantes do gene, em camundongos deum fundo C57BL/6N6. Em seguida, criamos os animais para obter camundongos heterozigotos UBE3A+/−. Para validação de face do modelo, foram utilizados animais de cruzamentos de fêmeas UBE3A+/− e machos selvagens para ganhar progênie UBE3A+/- (cepa denominada C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph e posteriormente designada como UBE3A mGenedel/+) e companheiros controle. Testamos suas habilidades motoras finas e grossas, emocionalidade e afeto para recapitular os sintomas centrais da EA. Em artigo anterior, também avaliamos as funções cognitivas dos animais, uma vez que pacientes com EA também sofrem de deficiência intelectual6. No entanto, não encontramos prejuízos cognitivos em camundongos UBE3AmGenedel/+, talvez devido à pouca idade dos animais no momento do teste7. Exames posteriores dos animais mais velhos, por volta das 18 semanas de idade, revelaram um déficit na flexibilidade comportamental durante o aprendizado de reversão no paradigma de preferência de lugar. No entanto, a complexidade dos equipamentos empregados para esta análise requer um módulo metodológico separado e não está aqui incluído.

Os testes comportamentais aqui apresentados pertencem às ferramentas de fenotipagem comuns na pesquisa genética, graças ao seu alto valor preditivo e suficiente validade de construto8,9,10. Usamos esses testes para validar um modelo de EA em camundongos, recapitulando os principais sintomas da doença humana de maneira reprodutível e independente da idade. A emocionalidade do animal foi avaliada nos testes de labirinto em cruz elevado e campo aberto. Ambos os testes são baseados no conflito abordagem-evitação, em que os animais exploram um novo ambiente em busca de alimento, abrigo ou oportunidades de acasalamento, evitando simultaneamente compartimentos ansiogênicos11. Além disso, o teste de campo aberto é utilizado para testar a atividade locomotora de camundongos8. O teste de suspensão de cauda é amplamente utilizado em pesquisas de depressão para rastrear novas drogas antidepressivas ou fenótipos semelhantes aos depressivos em modelos knockout de camundongos12. Este teste avalia o desespero que os animais desenvolvem ao longo do tempo em uma situação inescapável. Aprendizado motor e características detalhadas da marcha foram determinadas no rotarod e no DigiGait, respectivamente. A resistência do animal na haste aceleradora caracteriza suas habilidades de equilíbrio e coordenação do movimento, enquanto a análise detalhada dos padrões de passos de um camundongo é uma avaliação sensível de comprometimentos neuromusculares ligados a muitos distúrbios neurogenerativos do movimento13,14,15. O teste de trituração de filhotes faz parte da metodologia padrão para detecção de comportamento impulsivo em roedores e, por utilizar o comportamento natural de construção de roedores, indica o bem-estar do animal16,17.

O tamanho dos grupos experimentais foi resultado de um compromisso em atender às exigências da regra 3R e ao uso eficiente do desempenho reprodutivo das colônias. No entanto, para a obtenção do poder estatístico, os grupos possuíam nada menos que 10 indivíduos, devido ao estabelecimento de uma quantidade suficiente de pares reprodutores. Infelizmente, o desempenho reprodutivo nem sempre resultou em um número suficiente de animais.

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Protocolo

Todos os animais e experimentos utilizados neste estudo foram submetidos à revisão ética e conduzidos de acordo com a Diretiva Europeia 2010/63/UE. O estudo foi aprovado pela Comissão Central Checa para o Bem-Estar Animal. Os camundongos foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente e mantidos a uma temperatura constante de 22 ± 2 °C com um ciclo claro/escuro de 12 horas. Os camundongos receberam ração e água ad libitum. Os camundongos foram alojados em grupos de três a seis animais por gaiola. Nenhuma manipulação além da pesagem foi realizada antes dos testes. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e equipamentos utilizados neste protocolo.

1. Considerações gerais que precedem e durante os ensaios

NOTA: Por uma questão de clareza e compreensão, são apresentados comentários gerais antes da descrição dos testes individuais. Isto aplica-se a cada ensaio, com a excepção óbvia do ensaio de trituração de ninhos, que é realizado numa sala de alojamento e não requer a utilização de qualquer equipamento experimental.

  1. Acomodar os animais na instalação de pesquisa por pelo menos 14 dias antes do teste para minimizar qualquer estresse resultante do transporte e mudanças no ambiente.
  2. Registre o peso dos animais antes dos testes, pois o peso é um fator de confusão comum em pesquisas comportamentais.
  3. Deixar os animais aclimatarem-se na sala experimental por pelo menos 1 h após o transporte de sua sala de alojamento para minimizar o estresse de transporte, sempre que esse transporte ocorrer (ou seja, todos os testes descritos abaixo, exceto a trituração de ninhos, que é realizada na sala de alojamento).
  4. Rotular cada animal na cauda com um marcador atóxico à base de água para permitir uma rápida identificação durante o experimento.
  5. Retirar toda a urina e fezes depositadas pelos animais no aparato experimental durante os ensaios após cada ensaio.
  6. Limpar todo o aparato experimental com álcool a 75% antes e depois de cada animal testado. A limpeza remove vestígios olfativos depositados durante o teste e ajuda a manter condições experimentais estáveis.
  7. Transportar os animais de sua gaiola de origem para o aparato experimental com o máximo de cuidado possível, de preferência em um pequeno recipiente opaco, e depois liberá-los livremente, a menos que outras manipulações sejam necessárias.
  8. Coloque cada animal numa gaiola de detenção temporária após os testes para evitar que influenciem os animais não testados na gaiola doméstica.
  9. Testar machos e fêmeas em dias consecutivos. Alternar a ordem dos diferentes genótipos durante o teste para contrabalançar fatores ambientais imprevisíveis entre os grupos experimentais.
  10. Coloque os animais de volta em sua gaiola de origem depois que todos os animais tiverem sido testados e devolva-os de volta à sala de alojamento.
  11. No caso de ensaios repetidos em animais, manter um intervalo de pelo menos 1 dia entre cada ensaio.

2. Testes comportamentais

  1. Labirinto em cruz elevado (EPM)
    NOTA: Ambos os sexos das linhagens C57BL/6NCrl e UBE3AmGenedel/+ foram testados para este estudo com 9-12 semanas de idade. Os pesos dos animais variaram de 22 a 36 g para machos e 18 a 28 g para fêmeas no momento do teste.
    1. Coloque o labirinto em forma de plus na plataforma de teste logo abaixo da câmera. Usando o potenciômetro na parede, ajuste a intensidade da luz para 70 lux em seu centro com a ajuda de um luxômetro, com seu sensor colocado no centro do labirinto durante o ajuste.
    2. Abra o software clicando duas vezes no ícone do software Viewer e carregue a configuração para teste de EPM clicando no ícone no lado superior esquerdo da guia Configuração . Carregue o plugin EPM no menu Arquivo . Preencha as informações do animal usando o teclado do computador - ID do animal, genótipo, sexo e as informações do experimento (data, intensidade da luz) - nos campos correspondentes da guia Experimento . Verifique se a posição da zona, os braços abertos e os braços fechados estão configurados corretamente. Com a ajuda de um controle visual e do mouse do computador, verifique se as zonas virtuais delineadas correspondem às zonas EPM correspondentes na visualização de vídeo.
    3. O EPM é um teste usado para avaliar a ansiedade geral de um animal, que se baseia em abordagem - evitar conflitos. Os roedores naturalmente tendem a evitar áreas desprotegidas bem iluminadas (braços abertos), em favor das mais seguras (braços fechados). Como este teste totalmente automatizado é baseado em um sistema de rastreamento de vídeo, deixe o software calcular automaticamente o tempo gasto em cada zona, bem como o número de entradas.
    4. Durante os testes, grave os animais em vídeo por meio de uma câmera industrial sensível à luz infravermelha. Permitir que o software detecte a posição do animal em tempo real durante a gravação. Em seguida, deixe o software avaliar automaticamente os rastros do animal para calcular todos os parâmetros que descrevem o comportamento do animal no labirinto. Use o tempo gasto nos braços abertos ansiogênicos e a porcentagem de visitas de braços abertos para avaliar o nível de comportamento semelhante à ansiedade nos animais.
      NOTA: O labirinto feito sob medida é feito de material permeável à luz infravermelha e é colocado em uma plataforma de fonte de luz infravermelha de diodo emissor de luz (LED).
    5. Coloque o cursor do mouse no ícone de seta no lado superior esquerdo da guia Aquisição . Retire um animal da gaiola doméstica à mão e coloque-o suavemente no centro do EPM. Inicie o protocolo clicando com o botão esquerdo do mouse do computador e saia imediatamente da sala experimental.
    6. Quando o protocolo de gravação terminar após 5 min de exploração gratuita do labirinto, salve os dados gravados clicando em OK na janela que aparece após o término do protocolo, nomeie o arquivo apropriadamente e clique em Salvar. Exporte os resultados para um arquivo de .csv para cada animal testado para análise off-line clicando no ícone no painel vertical esquerdo da guia Análise de dados .
    7. Retire o animal do labirinto à mão e coloque-o na gaiola de retenção temporária. Proceder aos testes de todos os animais da mesma maneira. Copie os resultados de todos os animais testados para um arquivo do Bloco de Notas para análise off-line clicando no ícone Copiar Resultados na guia de resultados do plug-in do labirinto Elevated Plus .
      NOTA: O software e o hardware podem ser diferentes e os manuais relevantes devem ser seguidos. Além disso, a montagem experimental, como iluminação ou colocação de computadores, pode variar dependendo da construção do biotério.
  2. Teste de campo aberto (FO)
    NOTA: O teste de campo aberto avalia o movimento geral de um animal, que é desencadeado pelo comportamento exploratório em um ambiente novo. Além disso, é comumente usado como uma ferramenta de triagem para detectar ansiedade geral em um espaço desprotegido e bem iluminado. Este é um teste totalmente automatizado que utiliza um sistema de rastreamento de vídeo, que também foi usado no teste anterior.
    1. Coloque as quatro caixas de teste OF na plataforma de teste logo abaixo da câmera. Usando o potenciômetro na parede, ajuste a intensidade da luz para 200 lux no centro de cada teste de FO, com a ajuda de um luxômetro, com seu sensor colocado no centro de cada caixa durante o ajuste.
    2. Abra o software clicando duas vezes no ícone do software Viewer e carregue a configuração para o teste OF clicando no ícone no lado superior esquerdo da guia Configuração . Preencha as informações do animal usando o teclado do computador - ID do animal, genótipo, sexo e informações do experimento (data, intensidade da luz) - nos campos correspondentes da guia Experimento . Verifique se a posição da zona (centro e periferia) corresponde às caixas de teste OF e ajuste-as, se necessário. Com a ajuda de um controle visual e do mouse do computador, verifique se as zonas de centro e periferia delineadas virtuais correspondem às zonas de teste OF correspondentes na visualização de vídeo.
    3. Durante os testes, registre os animais em vídeo por meio de uma câmera industrial sensível à luz infravermelha. Permitir que o software detecte a posição do animal em tempo real durante o registro e avaliar automaticamente os rastros do animal para calcular todos os parâmetros que descrevem o comportamento do animal na caixa de teste FO. A distância percorrida, a velocidade média e o tempo de repouso são parâmetros usados para avaliar a atividade animal em um novo ambiente, enquanto o número de entradas do centro e a duração no centro descrevem o comportamento semelhante à ansiedade nos animais.
      NOTA: O labirinto feito sob medida é feito de material permeável à luz infravermelha e é colocado em uma plataforma de fonte de luz infravermelha LED.
    4. Coloque o cursor do mouse no ícone de seta no lado superior esquerdo da guia Aquisição . Retire quatro animais da gaiola doméstica à mão e coloque-os suavemente no canto de cada caixa de teste FO. Inicie o protocolo clicando com o botão esquerdo do mouse do computador e saia imediatamente da sala experimental.
    5. Quando o protocolo terminar após 10 min de exploração gratuita do labirinto, salve os dados clicando em OK na janela que aparece após o término do protocolo, nomeie o arquivo apropriadamente e clique em Salvar. Exporte os resultados para um arquivo .csv de cada animal testado para análise off-line clicando no ícone no painel vertical esquerdo da guia Análise de dados .
    6. Retire os animais do labirinto à mão e coloque-os na gaiola de retenção temporária. Proceder aos testes de todos os animais da mesma maneira. Analise os dados exportados.
      NOTA: O software e o hardware podem ser diferentes e os manuais relevantes devem ser seguidos. Além disso, a configuração experimental, como iluminação, número de labirintos ou colocação de computadores, pode variar dependendo da construção do biotério.
  3. Teste de suspensão traseira (TST)
    NOTA: Três ratos são testados simultaneamente com o aparelho de suspensão de cauda automatizado.
    1. Mantenha a intensidade da luz ambiente em 100-120 lux.
    2. Conecte o sistema TST com o computador através de um cabo USB. Insira o dongle USB no computador e inicie o software clicando duas vezes no ícone do software BIO-TST . Na guia Configurações em Global, ajuste a duração da aquisição para 360 s. Na guia Experimento , selecione Nova lista de assuntos e crie um novo arquivo de experimento e uma nova lista de sujeitos testados seguindo as instruções na guia aberta.
    3. Inicie a execução clicando em Iniciar execução | continuar na guia Aquisição . Preparar os animais para o teste enrolando fita adesiva unilateral, como a fita médica transpore, em torno de 3/4 da cauda do animal, a partir da base.
    4. Passe o gancho de suspensão através da fita e suspenda o animal sobre ela. Comece a adquirir dados para cada animal individualmente imediatamente após pendurá-lo no gancho clicando no ícone Iniciar sob a posição visualizada para cada animal e observe os animais continuamente durante o teste.
    5. Após a conclusão da aquisição para o primeiro conjunto de animais, clique em Iniciar a próxima corrida, retire os animais do gancho, retire a fita adesiva de suas caudas, corte cuidadosamente a fita com tesoura ao longo da cauda e coloque os animais na gaiola de retenção temporária.
    6. Limpar o aparelho com álcool a 75% e lenços de papel e proceder com o resto dos animais como descrito acima. Na guia Análise, selecione os últimos 4 min da aquisição para análise, selecione todas as execuções válidas no período de análise, clique em Analisar assuntos selecionados, escolha o formato de dados desejado e clique em Exportar dados selecionados para exportar os dados coletados para análise posterior.
      NOTA: O teste dura 6 min. Durante os primeiros 2 min, os animais lutarão vigorosamente, mas como a reação de desespero se torna predominante durante os 4 min restantes, o tempo de imobilidade durante esse período é levado para a análise. O software e o hardware podem ser diferentes, e os manuais relevantes devem ser seguidos. Além disso, o próprio equipamento pode variar (por exemplo, número de posições de teste).
  4. Análise da marcha
    1. Ligue a esteira e ajuste manualmente a velocidade da correia para 20 cm/s no painel do equipamento clicando no símbolo + ou - situado ao lado do indicador de velocidade. Acenda a luz do aparelho girando o botão no sentido horário. Inicie o software DigiGait Imager clicando duas vezes no ícone do software e defina a velocidade do obturador para 100 para mouses albinos ou 130 para mouses pretos/escuros no campo para velocidade do obturador.
    2. Retire o primeiro animal da gaiola doméstica com a mão e coloque-o delicadamente no cinto da esteira. Feche a porta do compartimento do animal. Inspecione visualmente para garantir que a cauda do animal não fique presa entre a porta e a moldura.
    3. Permita que o mouse explore a esteira antes da gravação. Verifique se o animal é capaz de realizar o teste colocando a esteira em uma velocidade de caminhada lenta por ~3 s e, em seguida, parando-a, observando o animal continuamente.
    4. Inicie a correia pressionando o botão Start no painel do equipamento e grave por aproximadamente 10 s. Certifique-se de que uma locomoção clara e fluente de pelo menos 10-15 passos seja observável. Pare a correia pressionando o botão Parar no painel do equipamento e devolva o mouse para a gaiola de fixação temporária com a mão.
    5. Filtre a gravação para uma sequência de imagens com passos fluentes clicando em PLAY e revisando a gravação com o controle visual no modo EDIT . Escolha de 10 a 15 movimentos fluentes escrevendo manualmente seus números de quadro inicial e final nos campos relevantes (Do quadro# para o primeiro quadro e Para para o último quadro). Preencha as informações do animal – identificação do animal, data de nascimento, sexo, peso, velocidade do cinto e ângulo do cinto – e comente quando necessário nos campos pertinentes. Salve o arquivo para análise adicional clicando em Salvar.
    6. Limpe o cinto com água e proceda com o resto dos animais da mesma forma. Escolha CÂMERA para prosseguir com a gravação do próximo animal caminhando. Quando forem adquiridos registros para todos os animais, proceda à análise.
      NOTA: Os animais que não são capazes de andar a uma velocidade definida do cinto são excluídos dos ensaios. Com base em nossa experiência, observamos que animais mais velhos (acima de 50 semanas) apresentam mais dificuldades para andar na esteira, com frequência variável entre 2% a 50%, dependendo do genótipo. Os dejetos animais são coletados em bandejas na frente ou atrás da esteira. As bandejas são esvaziadas após cada estudo e lavadas com água morna e sabão. O cinto é limpo com um pano úmido.
    7. Realizar análise da marcha com base em uma análise totalmente automatizada de gravações de vídeo de pegadas de animais. Ajuste os dados no software DigiGait Analysis .
      NOTA: A análise da marcha fornece não apenas uma medida de coordenação motora, mas também uma descrição cinemática detalhada baseada na análise do sinal dinâmico da marcha, representando a história temporal do posicionamento da pata através de passadas sequenciais. Os seguintes parâmetros são medidos automaticamente pelo software: duração do balanço, percentagem da duração da passada no balanço, duração da travagem, percentagem da duração da passada na travagem, duração da propulsão, percentagem da passada na propulsão, duração da postura, percentagem da passada na posição, duração da passada, percentagem da travagem da posição, percentagem da propulsão da fase de apoio, relação oscilação/apoio, comprimento da passada, frequência da passada, ângulo da pata, variabilidade do ângulo da pata, largura da postura, ângulo do passo, variabilidade do comprimento da passada, variabilidade da largura da passada, variabilidade do ângulo da passada, coeficiente de variação do comprimento da passada, coeficiente de variação da largura da passada, coeficiente de variação da largura da haste, coeficiente de variação da duração da oscilação, área da pata na altura do pico, variabilidade da área da pata na posição do pico, duração do apoio compartilhado dos membros posteriores, porcentagem de posição compartilhada, relação entre as durações dos apoios traseiros esquerdo e direito, simetria da marcha, taxa máxima de mudança da área da pata em contato com o cinto da esteira durante a fase de frenagem, taxa máxima de mudança da área da pata em contato com o cinto da esteira durante a fase de propulsão, propulsão tau, distância de sobreposição da pata, posicionamento da pata, coeficiente de ataxia, distância da linha média, distância do eixo e arrasto da pata. O software permite uma pequena correção do ruído do traço do passo, que deve ser preenchida antes da análise estatística. O software e o hardware podem ser diferentes, e os manuais relevantes devem ser seguidos.
  5. Rotarod
    NOTA: O teste rotarod é utilizado para avaliar as funções motoras dos roedores-equilíbrio e coordenação motora. O teste requer que um mouse ande sobre uma haste giratória de diâmetro fixo (5 cm), com a rotação acelerando por um determinado período de tempo (5 min) até que o animal não possa mais permanecer.
    1. Ligue o equipamento rotarod pressionando o botão liga/desliga no equipamento e inicie o software clicando duas vezes no ícone do software Rod . Inicialize um novo arquivo na guia Arquivo e salve-o com o nome apropriado. Na janela Configuração , preencha os detalhes do experimento, como a data, o nome do usuário e eventuais comentários. Defina o perfil de velocidade para 300 s, velocidade inicial para 4 rpm e velocidade terminal para 40 rpm.
    2. Prepare um cronograma para os animais testados no campo animal e atribua a cada animal sua posição na haste. As posições não são indicadas no software explicitamente, mas correspondem à linha da lista; Por exemplo, a primeira linha indicaria a primeira posição da haste, a quinta linha indicaria a quinta posição da haste e assim por diante. Lembre-se de contrabalançar cada posição da haste entre os grupos experimentais.
      NOTA: Cinco animais podem ser testados simultaneamente.
    3. Feche o painel Configuração clicando em Fechar e abra o painel de medição clicando em Medir. Inicie a rotação inicial da haste a 4 rpm clicando em Iniciar/Parar e coloque os cinco primeiros animais em suas posições atribuídas. Quando todos os animais estiverem na haste, inicie o protocolo de teste clicando em Iniciar Perfil, e a haste acelerará gradualmente até 40 rpm ao longo de 5 min. Se um animal cair da vara, devolva-o à haste antes do início do protocolo.
      NOTA: Os animais geralmente não ficam na haste por tempo suficiente para colocar todos os ratos nela de uma só vez durante a primeira tentativa. É importante ter paciência ao colocar os animais na haste com a velocidade constante de rotação no início. O objetivo do teste não é determinar a resistência do animal na haste em uma velocidade de rotação fixa, mas encontrar a velocidade em que o animal é incapaz de permanecer na haste. A velocidade da haste é proporcional à latência de permanecer nela; Assim, é usado para expressar o equilíbrio do animal.
    4. Mova os animais para a gaiola de detenção temporária depois de todos terem caído da vara ou depois de 5 minutos terem passado. Retire todos os dejetos de animais e limpe a haste e a bandeja com álcool.
    5. Clique em Animais -> para prosseguir com o próximo grupo de animais da mesma maneira. Depois de testar todos os animais, feche a janela Medir clicando em Fechar e clique em Mostrar para exibir os dados coletados. Exporte os dados adquiridos em .csv formato de arquivo para análise adicional clicando em Exportar CSV.
    6. Testar cada animal na haste três vezes com intervalos interexperimentais de 15 min. Use o valor médio da latência para cair ao longo das três tentativas para análise estatística adicional. Avaliar o aprendizado motor do animal repetindo o teste por 5 dias consecutivos.
      NOTA: O software e o hardware podem ser diferentes e os manuais relevantes devem ser seguidos. Além disso, o equipamento em si pode variar, por exemplo, em número de posições de teste, construção geral e dimensão da haste.
  6. Edifício do ninho de trituração
    1. Separe os animais em gaiolas únicas de policarbonato com equipamento padrão (cama, tela de alimentação e fornecimento de água) por 1 semana. Pegue aproximadamente 12 g de ninho de algodão usando pinças, registre seu peso manualmente usando balanças e coloque-o aleatoriamente em uma gaiola, mas no lado oposto ao abastecimento de água. Devolva as gaiolas com os animais para a sala de alojamento.
    2. Pesar cada ninho à mesma hora todos os dias durante os próximos 4 dias manualmente usando balanças. Registre os pesos em papel ou em uma planilha pré-elaborada. Certifique-se de que cada ninho esteja seco quando pesado; Caso contrário, seque em uma almofada de aquecimento e devolva todos os ninhos para suas gaiolas designadas ao mesmo tempo no local onde o rato fez seu ninho. Se o ninho for rasgado em várias partes, pese a maior.
    3. Para análise dos dados, expressar o decréscimo no peso dos filhotes em cada dia em relação ao peso inicial e apresentá-lo em porcentagem do material utilizado.
      NOTA: Trazer os machos de volta para uma gaiola comum pode levar ao aumento da agressividade e lesões indesejadas entre os animais. Portanto, o teste de trituração de filhotes deve ser agendado no final do regime de teste para evitar comprometer o bem-estar animal.

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Resultados

Testes de labirinto em cruz elevado e em campo aberto
Os testes de EPM e FO utilizam a tendência natural dos roedores em explorar novos ambientes18,19. A exploração é regida por um conflito de abordagem-evitação, onde os roedores escolhem entre a exploração de um novo ambiente e evitar possíveis perigos. Os animais exploram lugares desconhecidos em busca de abrigo, contato social ou forrageamento. No entanto, novos locais podem envolver fatore...

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Discussão

Modelos de EA criados em diferentes linhagens murinas são comumente validados com testes de estado emocional, funções motoras e habilidades cognitivas de animais para facilitar a comparação com sintomas humanos31,32. Um déficit motor em modelos de EA é o achado mais consistente entre os laboratórios, seguido por um estado de emocionalidade inalterado dos mutantes e dificuldades na construção de ninhos31,32,33

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pela Academia Tcheca de Ciências RVO 68378050, LM2018126 Centro Tcheco de Fenogenômica fornecido por MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Atualização do Centro Tcheco de Fenogenômica: desenvolvendo para a pesquisa de tradução por MEYS e ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II por MEYS e ESIF) e OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (maior qualidade e capacidade para modelos transgênicos por MEYS e FEDER). Além disso, este estudo recebeu financiamento da ONG "Association of Gene Therapy (ASGENT)", da Chéquia (https://asgent.org/) e LM2023036 Centro Checo de Fenogenómica fornecido pelo Ministério da Educação, Juventude e Desportos da República Checa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Gaiolas, ventiladas individualmenteTechniplast
DigiGaitMouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA		O equipamento foi licitado, nenhum número de catálogo foi fornecido, nem pôde ser encontrado no site da empresaAnálise detalhada da marcha do mouse, hardware e software fornecidos. 
FDA Nestlet squaresDatesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, Reino UnidoO material foi comprado do fornecedor Velaz por meio de solicitação direta por e-mail. A Velaz não fornece nenhum número de catálogo.Nestlets de algodão para teste de construção de ninhos. Descrição do ninho: 2-3 g cada, com diâmetro em torno de 5 x 5 x 0,5 cm.
Ração para ratosAltramion
RotarodTSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlim, Alemanha		O equipamento foi licitado, nenhum número de catálogo foi fornecido, nem foi possível encontrar no site da empresaRotarod para 5 mouses, hardware e software fornecidos. Dimensões do tambor: Diâmetro: 30 mm, largura por pista: 50 mm, distância de queda 147 mm.
Teste de Suspensão de CaudaBioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANÇA		Referência: BIO-TST5Equipamento totalmente automatizado para avaliação do tempo de imobilidade de 3 ratos pendurados pela cauda, hardware e software fornecidos
Fita médica TransporeMedical M, Ltd.P-AIRO1291A fita usada para prender um animal ao anzol pela cauda.
Visualizador - Sistema de Rastreamento de VídeoBiobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
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Referências

  1. Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
  2. Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
  3. Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
  4. Jolleff, N., Ryan, M. M. Communication development in Angelman's syndrome. Archives of Disease in Childhood. 69 (1), 148-150 (1993).
  5. Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
  6. Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815(2022).
  7. Huang, H. -S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
  8. Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
  9. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  10. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
  11. Carola, V., D'Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
  12. Yan, H. -C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -H., Gao, T. -M. Behavioral animal models of depression. Neuroscience Bulletin. 26 (4), 327-337 (2010).
  13. Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
  14. Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
  15. Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
  16. Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
  17. Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478(2018).
  18. Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
  19. La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145(2020).
  20. Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
  21. Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
  22. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
  23. Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
  24. Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D'Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
  25. Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92(2010).
  26. Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20(2005).
  27. Hampton, T. G., et al. Gait disturbances in dystrophic hamsters. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 235354(2011).
  28. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
  29. Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
  30. Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
  31. Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47(2018).
  32. Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
  33. Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451(2017).
  34. File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
  35. Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
  36. Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509(2020).
  37. Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
  38. Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
  39. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  40. Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
  41. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
  42. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284(2017).
  43. Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426(2022).
  44. Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
  45. Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991(2021).

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