Summary

Caracterização comportamental de um modelo de camundongo com síndrome de Angelman

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

Este manuscrito apresenta um conjunto de testes comportamentais altamente reprodutíveis para validar um modelo de camundongo com síndrome de Angelman.

Abstract

Este manuscrito descreve uma bateria de testes comportamentais disponíveis para caracterizar fenótipos semelhantes à síndrome de Angelman (SA) em um modelo murino estabelecido de EA. Usamos o paradigma de aprendizado de rotarod, análise detalhada da marcha e teste de construção de ninhos para detectar e caracterizar deficiências motoras em animais. Testamos a emocionalidade dos animais em campo aberto e testes de labirinto em cruz elevados, bem como o efeito no teste de suspensão de cauda. Quando camundongos SA são testados no teste de campo aberto, os resultados devem ser interpretados com cuidado, uma vez que disfunções motoras influenciam o comportamento de camundongos no labirinto e alteram os escores de atividade.

A reprodutibilidade e eficácia dos testes comportamentais apresentados já foi validada em várias linhagens independentes de camundongos Uba3a com diferentes variantes knockout, estabelecendo este conjunto de testes como uma excelente ferramenta de validação em pesquisas de EA. Modelos com validade de construto e de face relevantes justificarão novas investigações para elucidar a fisiopatologia da doença e propiciar o desenvolvimento de tratamentos causais.

Introduction

A síndrome de Angelman (SA) é uma doença rara do neurodesenvolvimento. A origem genética mais comum da EA é uma grande deleção da região 15q11-q13 do cromossomo materno, que é encontrada em quase 74% dos pacientes1. A deleção dessa região causa a perda de UBE3A, o principal gene causador da EA que codifica uma ubiquitina ligase E3. O alelo paterno do gene UBE3A em neurônios é silenciado em um processo conhecido como imprinting. Como consequência, o imprinting paterno do gene permite apenas a expressão materna no sistema nervoso central (SNC)2. Portanto, a deleção do gene UBE3A do cromossomo materno leva ao desenvolvimento de sintomas de EA. Em humanos, a EA manifesta-se por volta dos 6 meses de idade, com retardo do desenvolvimento que persiste em todos os estágios de desenvolvimento e resulta em sintomas debilitantes graves nos indivíduos afetados 3,4. Os principais sintomas do transtorno incluem o déficit de habilidades motoras finas e grossas, incluindo marcha atáxica brusca, comprometimento grave da fala e deficiência intelectual. Aproximadamente 80% dos pacientes com EA também sofrem de distúrbios do sono e epilepsia. Até o momento, o único tratamento disponível são as drogas sintomáticas, que reduzem as crises epilépticas e melhoram a qualidade do sono1. Portanto, o desenvolvimento de modelos animais robustos com fenótipos comportamentais reprodutíveis, juntamente com análises fenotípicas refinadas, será essencial para elucidar os mecanismos fisiopatológicos do transtorno e descobrir medicamentos e tratamentos eficazes.

A complexidade da desordem humana que afeta o SNC exige que os organismos-modelo possuam genoma, fisiologia e comportamento comparáveis. Os camundongos são populares como um organismo modelo devido ao seu curto ciclo reprodutivo, tamanho pequeno e relativa facilidade de modificação do DNA. Em 1984, Paul Willner propôs três critérios de validação do modelo básico de doença: validade de construto, validade de face e preditiva, que são usados para determinar o valor do modelo5. Simplesmente, a validade de construto reflete os mecanismos biológicos responsáveis pelo desenvolvimento do transtorno, a validade de face recapitula seus sintomas e a validade preditiva descreve a resposta do modelo a drogas terapêuticas.

Para aderir aos princípios acima, escolhemos a etiologia genética mais comum, uma grande deleção do locus 15q11.2-13q materno, incluindo o gene UBE3A, para criar camundongos modelo AS. Usamos a técnica CRISPR/Cas9 para excluir uma região longa de 76.225 pb abrangendo todo o gene UBE3A, englobando tanto os elementos codificantes quanto os não codificantes do gene, em camundongos deum fundo C57BL/6N6. Em seguida, criamos os animais para obter camundongos heterozigotos UBE3A+/−. Para validação de face do modelo, foram utilizados animais de cruzamentos de fêmeas UBE3A+/− e machos selvagens para ganhar progênie UBE3A+/- (cepa denominada C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph e posteriormente designada como UBE3A mGenedel/+) e companheiros controle. Testamos suas habilidades motoras finas e grossas, emocionalidade e afeto para recapitular os sintomas centrais da EA. Em artigo anterior, também avaliamos as funções cognitivas dos animais, uma vez que pacientes com EA também sofrem de deficiência intelectual6. No entanto, não encontramos prejuízos cognitivos em camundongos UBE3AmGenedel/+, talvez devido à pouca idade dos animais no momento do teste7. Exames posteriores dos animais mais velhos, por volta das 18 semanas de idade, revelaram um déficit na flexibilidade comportamental durante o aprendizado de reversão no paradigma de preferência de lugar. No entanto, a complexidade dos equipamentos empregados para esta análise requer um módulo metodológico separado e não está aqui incluído.

Os testes comportamentais aqui apresentados pertencem às ferramentas de fenotipagem comuns na pesquisa genética, graças ao seu alto valor preditivo e suficiente validade de construto8,9,10. Usamos esses testes para validar um modelo de EA em camundongos, recapitulando os principais sintomas da doença humana de maneira reprodutível e independente da idade. A emocionalidade do animal foi avaliada nos testes de labirinto em cruz elevado e campo aberto. Ambos os testes são baseados no conflito abordagem-evitação, em que os animais exploram um novo ambiente em busca de alimento, abrigo ou oportunidades de acasalamento, evitando simultaneamente compartimentos ansiogênicos11. Além disso, o teste de campo aberto é utilizado para testar a atividade locomotora de camundongos8. O teste de suspensão de cauda é amplamente utilizado em pesquisas de depressão para rastrear novas drogas antidepressivas ou fenótipos semelhantes aos depressivos em modelos knockout de camundongos12. Este teste avalia o desespero que os animais desenvolvem ao longo do tempo em uma situação inescapável. Aprendizado motor e características detalhadas da marcha foram determinadas no rotarod e no DigiGait, respectivamente. A resistência do animal na haste aceleradora caracteriza suas habilidades de equilíbrio e coordenação do movimento, enquanto a análise detalhada dos padrões de passos de um camundongo é uma avaliação sensível de comprometimentos neuromusculares ligados a muitos distúrbios neurogenerativos do movimento13,14,15. O teste de trituração de filhotes faz parte da metodologia padrão para detecção de comportamento impulsivo em roedores e, por utilizar o comportamento natural de construção de roedores, indica o bem-estar do animal16,17.

O tamanho dos grupos experimentais foi resultado de um compromisso em atender às exigências da regra 3R e ao uso eficiente do desempenho reprodutivo das colônias. No entanto, para a obtenção do poder estatístico, os grupos possuíam nada menos que 10 indivíduos, devido ao estabelecimento de uma quantidade suficiente de pares reprodutores. Infelizmente, o desempenho reprodutivo nem sempre resultou em um número suficiente de animais.

Protocol

Todos os animais e experimentos utilizados neste estudo foram submetidos à revisão ética e conduzidos de acordo com a Diretiva Europeia 2010/63/UE. O estudo foi aprovado pela Comissão Central Checa para o Bem-Estar Animal. Os camundongos foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente e mantidos a uma temperatura constante de 22 ± 2 °C com um ciclo claro/escuro de 12 horas. Os camundongos receberam ração e água ad libitum. Os camundongos foram alojados em grupos de três a seis animais por gaiola. Nenhuma manipulação além da pesagem foi realizada antes dos testes. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e equipamentos utilizados neste protocolo. 1. Considerações gerais que precedem e durante os ensaios NOTA: Por uma questão de clareza e compreensão, são apresentados comentários gerais antes da descrição dos testes individuais. Isto aplica-se a cada ensaio, com a excepção óbvia do ensaio de trituração de ninhos, que é realizado numa sala de alojamento e não requer a utilização de qualquer equipamento experimental. Acomodar os animais na instalação de pesquisa por pelo menos 14 dias antes do teste para minimizar qualquer estresse resultante do transporte e mudanças no ambiente. Registre o peso dos animais antes dos testes, pois o peso é um fator de confusão comum em pesquisas comportamentais. Deixar os animais aclimatarem-se na sala experimental por pelo menos 1 h após o transporte de sua sala de alojamento para minimizar o estresse de transporte, sempre que esse transporte ocorrer (ou seja, todos os testes descritos abaixo, exceto a trituração de ninhos, que é realizada na sala de alojamento). Rotular cada animal na cauda com um marcador atóxico à base de água para permitir uma rápida identificação durante o experimento. Retirar toda a urina e fezes depositadas pelos animais no aparato experimental durante os ensaios após cada ensaio. Limpar todo o aparato experimental com álcool a 75% antes e depois de cada animal testado. A limpeza remove vestígios olfativos depositados durante o teste e ajuda a manter condições experimentais estáveis. Transportar os animais de sua gaiola de origem para o aparato experimental com o máximo de cuidado possível, de preferência em um pequeno recipiente opaco, e depois liberá-los livremente, a menos que outras manipulações sejam necessárias. Coloque cada animal numa gaiola de detenção temporária após os testes para evitar que influenciem os animais não testados na gaiola doméstica. Testar machos e fêmeas em dias consecutivos. Alternar a ordem dos diferentes genótipos durante o teste para contrabalançar fatores ambientais imprevisíveis entre os grupos experimentais. Coloque os animais de volta em sua gaiola de origem depois que todos os animais tiverem sido testados e devolva-os de volta à sala de alojamento. No caso de ensaios repetidos em animais, manter um intervalo de pelo menos 1 dia entre cada ensaio. 2. Testes comportamentais Labirinto em cruz elevado (EPM)NOTA: Ambos os sexos das linhagens C57BL/6NCrl e UBE3AmGenedel/+ foram testados para este estudo com 9-12 semanas de idade. Os pesos dos animais variaram de 22 a 36 g para machos e 18 a 28 g para fêmeas no momento do teste.Coloque o labirinto em forma de plus na plataforma de teste logo abaixo da câmera. Usando o potenciômetro na parede, ajuste a intensidade da luz para 70 lux em seu centro com a ajuda de um luxômetro, com seu sensor colocado no centro do labirinto durante o ajuste. Abra o software clicando duas vezes no ícone do software Viewer e carregue a configuração para teste de EPM clicando no ícone no lado superior esquerdo da guia Configuração . Carregue o plugin EPM no menu Arquivo . Preencha as informações do animal usando o teclado do computador – ID do animal, genótipo, sexo e as informações do experimento (data, intensidade da luz) – nos campos correspondentes da guia Experimento . Verifique se a posição da zona, os braços abertos e os braços fechados estão configurados corretamente. Com a ajuda de um controle visual e do mouse do computador, verifique se as zonas virtuais delineadas correspondem às zonas EPM correspondentes na visualização de vídeo. O EPM é um teste usado para avaliar a ansiedade geral de um animal, que se baseia em abordagem – evitar conflitos. Os roedores naturalmente tendem a evitar áreas desprotegidas bem iluminadas (braços abertos), em favor das mais seguras (braços fechados). Como este teste totalmente automatizado é baseado em um sistema de rastreamento de vídeo, deixe o software calcular automaticamente o tempo gasto em cada zona, bem como o número de entradas. Durante os testes, grave os animais em vídeo por meio de uma câmera industrial sensível à luz infravermelha. Permitir que o software detecte a posição do animal em tempo real durante a gravação. Em seguida, deixe o software avaliar automaticamente os rastros do animal para calcular todos os parâmetros que descrevem o comportamento do animal no labirinto. Use o tempo gasto nos braços abertos ansiogênicos e a porcentagem de visitas de braços abertos para avaliar o nível de comportamento semelhante à ansiedade nos animais.NOTA: O labirinto feito sob medida é feito de material permeável à luz infravermelha e é colocado em uma plataforma de fonte de luz infravermelha de diodo emissor de luz (LED). Coloque o cursor do mouse no ícone de seta no lado superior esquerdo da guia Aquisição . Retire um animal da gaiola doméstica à mão e coloque-o suavemente no centro do EPM. Inicie o protocolo clicando com o botão esquerdo do mouse do computador e saia imediatamente da sala experimental. Quando o protocolo de gravação terminar após 5 min de exploração gratuita do labirinto, salve os dados gravados clicando em OK na janela que aparece após o término do protocolo, nomeie o arquivo apropriadamente e clique em Salvar. Exporte os resultados para um arquivo de .csv para cada animal testado para análise off-line clicando no ícone no painel vertical esquerdo da guia Análise de dados . Retire o animal do labirinto à mão e coloque-o na gaiola de retenção temporária. Proceder aos testes de todos os animais da mesma maneira. Copie os resultados de todos os animais testados para um arquivo do Bloco de Notas para análise off-line clicando no ícone Copiar Resultados na guia de resultados do plug-in do labirinto Elevated Plus .NOTA: O software e o hardware podem ser diferentes e os manuais relevantes devem ser seguidos. Além disso, a montagem experimental, como iluminação ou colocação de computadores, pode variar dependendo da construção do biotério. Teste de campo aberto (FO)NOTA: O teste de campo aberto avalia o movimento geral de um animal, que é desencadeado pelo comportamento exploratório em um ambiente novo. Além disso, é comumente usado como uma ferramenta de triagem para detectar ansiedade geral em um espaço desprotegido e bem iluminado. Este é um teste totalmente automatizado que utiliza um sistema de rastreamento de vídeo, que também foi usado no teste anterior.Coloque as quatro caixas de teste OF na plataforma de teste logo abaixo da câmera. Usando o potenciômetro na parede, ajuste a intensidade da luz para 200 lux no centro de cada teste de FO, com a ajuda de um luxômetro, com seu sensor colocado no centro de cada caixa durante o ajuste. Abra o software clicando duas vezes no ícone do software Viewer e carregue a configuração para o teste OF clicando no ícone no lado superior esquerdo da guia Configuração . Preencha as informações do animal usando o teclado do computador – ID do animal, genótipo, sexo e informações do experimento (data, intensidade da luz) – nos campos correspondentes da guia Experimento . Verifique se a posição da zona (centro e periferia) corresponde às caixas de teste OF e ajuste-as, se necessário. Com a ajuda de um controle visual e do mouse do computador, verifique se as zonas de centro e periferia delineadas virtuais correspondem às zonas de teste OF correspondentes na visualização de vídeo. Durante os testes, registre os animais em vídeo por meio de uma câmera industrial sensível à luz infravermelha. Permitir que o software detecte a posição do animal em tempo real durante o registro e avaliar automaticamente os rastros do animal para calcular todos os parâmetros que descrevem o comportamento do animal na caixa de teste FO. A distância percorrida, a velocidade média e o tempo de repouso são parâmetros usados para avaliar a atividade animal em um novo ambiente, enquanto o número de entradas do centro e a duração no centro descrevem o comportamento semelhante à ansiedade nos animais.NOTA: O labirinto feito sob medida é feito de material permeável à luz infravermelha e é colocado em uma plataforma de fonte de luz infravermelha LED. Coloque o cursor do mouse no ícone de seta no lado superior esquerdo da guia Aquisição . Retire quatro animais da gaiola doméstica à mão e coloque-os suavemente no canto de cada caixa de teste FO. Inicie o protocolo clicando com o botão esquerdo do mouse do computador e saia imediatamente da sala experimental. Quando o protocolo terminar após 10 min de exploração gratuita do labirinto, salve os dados clicando em OK na janela que aparece após o término do protocolo, nomeie o arquivo apropriadamente e clique em Salvar. Exporte os resultados para um arquivo .csv de cada animal testado para análise off-line clicando no ícone no painel vertical esquerdo da guia Análise de dados . Retire os animais do labirinto à mão e coloque-os na gaiola de retenção temporária. Proceder aos testes de todos os animais da mesma maneira. Analise os dados exportados.NOTA: O software e o hardware podem ser diferentes e os manuais relevantes devem ser seguidos. Além disso, a configuração experimental, como iluminação, número de labirintos ou colocação de computadores, pode variar dependendo da construção do biotério. Teste de suspensão traseira (TST)NOTA: Três ratos são testados simultaneamente com o aparelho de suspensão de cauda automatizado.Mantenha a intensidade da luz ambiente em 100-120 lux. Conecte o sistema TST com o computador através de um cabo USB. Insira o dongle USB no computador e inicie o software clicando duas vezes no ícone do software BIO-TST . Na guia Configurações em Global, ajuste a duração da aquisição para 360 s. Na guia Experimento , selecione Nova lista de assuntos e crie um novo arquivo de experimento e uma nova lista de sujeitos testados seguindo as instruções na guia aberta. Inicie a execução clicando em Iniciar execução | continuar na guia Aquisição . Preparar os animais para o teste enrolando fita adesiva unilateral, como a fita médica transpore, em torno de 3/4 da cauda do animal, a partir da base. Passe o gancho de suspensão através da fita e suspenda o animal sobre ela. Comece a adquirir dados para cada animal individualmente imediatamente após pendurá-lo no gancho clicando no ícone Iniciar sob a posição visualizada para cada animal e observe os animais continuamente durante o teste. Após a conclusão da aquisição para o primeiro conjunto de animais, clique em Iniciar a próxima corrida, retire os animais do gancho, retire a fita adesiva de suas caudas, corte cuidadosamente a fita com tesoura ao longo da cauda e coloque os animais na gaiola de retenção temporária. Limpar o aparelho com álcool a 75% e lenços de papel e proceder com o resto dos animais como descrito acima. Na guia Análise, selecione os últimos 4 min da aquisição para análise, selecione todas as execuções válidas no período de análise, clique em Analisar assuntos selecionados, escolha o formato de dados desejado e clique em Exportar dados selecionados para exportar os dados coletados para análise posterior.NOTA: O teste dura 6 min. Durante os primeiros 2 min, os animais lutarão vigorosamente, mas como a reação de desespero se torna predominante durante os 4 min restantes, o tempo de imobilidade durante esse período é levado para a análise. O software e o hardware podem ser diferentes, e os manuais relevantes devem ser seguidos. Além disso, o próprio equipamento pode variar (por exemplo, número de posições de teste). Análise da marchaLigue a esteira e ajuste manualmente a velocidade da correia para 20 cm/s no painel do equipamento clicando no símbolo + ou – situado ao lado do indicador de velocidade. Acenda a luz do aparelho girando o botão no sentido horário. Inicie o software DigiGait Imager clicando duas vezes no ícone do software e defina a velocidade do obturador para 100 para mouses albinos ou 130 para mouses pretos/escuros no campo para velocidade do obturador. Retire o primeiro animal da gaiola doméstica com a mão e coloque-o delicadamente no cinto da esteira. Feche a porta do compartimento do animal. Inspecione visualmente para garantir que a cauda do animal não fique presa entre a porta e a moldura. Permita que o mouse explore a esteira antes da gravação. Verifique se o animal é capaz de realizar o teste colocando a esteira em uma velocidade de caminhada lenta por ~3 s e, em seguida, parando-a, observando o animal continuamente. Inicie a correia pressionando o botão Start no painel do equipamento e grave por aproximadamente 10 s. Certifique-se de que uma locomoção clara e fluente de pelo menos 10-15 passos seja observável. Pare a correia pressionando o botão Parar no painel do equipamento e devolva o mouse para a gaiola de fixação temporária com a mão. Filtre a gravação para uma sequência de imagens com passos fluentes clicando em PLAY e revisando a gravação com o controle visual no modo EDIT . Escolha de 10 a 15 movimentos fluentes escrevendo manualmente seus números de quadro inicial e final nos campos relevantes (Do quadro# para o primeiro quadro e Para para o último quadro). Preencha as informações do animal – identificação do animal, data de nascimento, sexo, peso, velocidade do cinto e ângulo do cinto – e comente quando necessário nos campos pertinentes. Salve o arquivo para análise adicional clicando em Salvar. Limpe o cinto com água e proceda com o resto dos animais da mesma forma. Escolha CÂMERA para prosseguir com a gravação do próximo animal caminhando. Quando forem adquiridos registros para todos os animais, proceda à análise.NOTA: Os animais que não são capazes de andar a uma velocidade definida do cinto são excluídos dos ensaios. Com base em nossa experiência, observamos que animais mais velhos (acima de 50 semanas) apresentam mais dificuldades para andar na esteira, com frequência variável entre 2% a 50%, dependendo do genótipo. Os dejetos animais são coletados em bandejas na frente ou atrás da esteira. As bandejas são esvaziadas após cada estudo e lavadas com água morna e sabão. O cinto é limpo com um pano úmido. Realizar análise da marcha com base em uma análise totalmente automatizada de gravações de vídeo de pegadas de animais. Ajuste os dados no software DigiGait Analysis .NOTA: A análise da marcha fornece não apenas uma medida de coordenação motora, mas também uma descrição cinemática detalhada baseada na análise do sinal dinâmico da marcha, representando a história temporal do posicionamento da pata através de passadas sequenciais. Os seguintes parâmetros são medidos automaticamente pelo software: duração do balanço, percentagem da duração da passada no balanço, duração da travagem, percentagem da duração da passada na travagem, duração da propulsão, percentagem da passada na propulsão, duração da postura, percentagem da passada na posição, duração da passada, percentagem da travagem da posição, percentagem da propulsão da fase de apoio, relação oscilação/apoio, comprimento da passada, frequência da passada, ângulo da pata, variabilidade do ângulo da pata, largura da postura, ângulo do passo, variabilidade do comprimento da passada, variabilidade da largura da passada, variabilidade do ângulo da passada, coeficiente de variação do comprimento da passada, coeficiente de variação da largura da passada, coeficiente de variação da largura da haste, coeficiente de variação da duração da oscilação, área da pata na altura do pico, variabilidade da área da pata na posição do pico, duração do apoio compartilhado dos membros posteriores, porcentagem de posição compartilhada, relação entre as durações dos apoios traseiros esquerdo e direito, simetria da marcha, taxa máxima de mudança da área da pata em contato com o cinto da esteira durante a fase de frenagem, taxa máxima de mudança da área da pata em contato com o cinto da esteira durante a fase de propulsão, propulsão tau, distância de sobreposição da pata, posicionamento da pata, coeficiente de ataxia, distância da linha média, distância do eixo e arrasto da pata. O software permite uma pequena correção do ruído do traço do passo, que deve ser preenchida antes da análise estatística. O software e o hardware podem ser diferentes, e os manuais relevantes devem ser seguidos. RotarodNOTA: O teste rotarod é utilizado para avaliar as funções motoras dos roedores-equilíbrio e coordenação motora. O teste requer que um mouse ande sobre uma haste giratória de diâmetro fixo (5 cm), com a rotação acelerando por um determinado período de tempo (5 min) até que o animal não possa mais permanecer.Ligue o equipamento rotarod pressionando o botão liga/desliga no equipamento e inicie o software clicando duas vezes no ícone do software Rod . Inicialize um novo arquivo na guia Arquivo e salve-o com o nome apropriado. Na janela Configuração , preencha os detalhes do experimento, como a data, o nome do usuário e eventuais comentários. Defina o perfil de velocidade para 300 s, velocidade inicial para 4 rpm e velocidade terminal para 40 rpm. Prepare um cronograma para os animais testados no campo animal e atribua a cada animal sua posição na haste. As posições não são indicadas no software explicitamente, mas correspondem à linha da lista; Por exemplo, a primeira linha indicaria a primeira posição da haste, a quinta linha indicaria a quinta posição da haste e assim por diante. Lembre-se de contrabalançar cada posição da haste entre os grupos experimentais.NOTA: Cinco animais podem ser testados simultaneamente. Feche o painel Configuração clicando em Fechar e abra o painel de medição clicando em Medir. Inicie a rotação inicial da haste a 4 rpm clicando em Iniciar/Parar e coloque os cinco primeiros animais em suas posições atribuídas. Quando todos os animais estiverem na haste, inicie o protocolo de teste clicando em Iniciar Perfil, e a haste acelerará gradualmente até 40 rpm ao longo de 5 min. Se um animal cair da vara, devolva-o à haste antes do início do protocolo.NOTA: Os animais geralmente não ficam na haste por tempo suficiente para colocar todos os ratos nela de uma só vez durante a primeira tentativa. É importante ter paciência ao colocar os animais na haste com a velocidade constante de rotação no início. O objetivo do teste não é determinar a resistência do animal na haste em uma velocidade de rotação fixa, mas encontrar a velocidade em que o animal é incapaz de permanecer na haste. A velocidade da haste é proporcional à latência de permanecer nela; Assim, é usado para expressar o equilíbrio do animal. Mova os animais para a gaiola de detenção temporária depois de todos terem caído da vara ou depois de 5 minutos terem passado. Retire todos os dejetos de animais e limpe a haste e a bandeja com álcool. Clique em Animais -> para prosseguir com o próximo grupo de animais da mesma maneira. Depois de testar todos os animais, feche a janela Medir clicando em Fechar e clique em Mostrar para exibir os dados coletados. Exporte os dados adquiridos em .csv formato de arquivo para análise adicional clicando em Exportar CSV. Testar cada animal na haste três vezes com intervalos interexperimentais de 15 min. Use o valor médio da latência para cair ao longo das três tentativas para análise estatística adicional. Avaliar o aprendizado motor do animal repetindo o teste por 5 dias consecutivos.NOTA: O software e o hardware podem ser diferentes e os manuais relevantes devem ser seguidos. Além disso, o equipamento em si pode variar, por exemplo, em número de posições de teste, construção geral e dimensão da haste. Edifício do ninho de trituraçãoSepare os animais em gaiolas únicas de policarbonato com equipamento padrão (cama, tela de alimentação e fornecimento de água) por 1 semana. Pegue aproximadamente 12 g de ninho de algodão usando pinças, registre seu peso manualmente usando balanças e coloque-o aleatoriamente em uma gaiola, mas no lado oposto ao abastecimento de água. Devolva as gaiolas com os animais para a sala de alojamento. Pesar cada ninho à mesma hora todos os dias durante os próximos 4 dias manualmente usando balanças. Registre os pesos em papel ou em uma planilha pré-elaborada. Certifique-se de que cada ninho esteja seco quando pesado; Caso contrário, seque em uma almofada de aquecimento e devolva todos os ninhos para suas gaiolas designadas ao mesmo tempo no local onde o rato fez seu ninho. Se o ninho for rasgado em várias partes, pese a maior. Para análise dos dados, expressar o decréscimo no peso dos filhotes em cada dia em relação ao peso inicial e apresentá-lo em porcentagem do material utilizado.NOTA: Trazer os machos de volta para uma gaiola comum pode levar ao aumento da agressividade e lesões indesejadas entre os animais. Portanto, o teste de trituração de filhotes deve ser agendado no final do regime de teste para evitar comprometer o bem-estar animal.

Representative Results

Testes de labirinto em cruz elevado e em campo abertoOs testes de EPM e FO utilizam a tendência natural dos roedores em explorar novos ambientes18,19. A exploração é regida por um conflito de abordagem-evitação, onde os roedores escolhem entre a exploração de um novo ambiente e evitar possíveis perigos. Os animais exploram lugares desconhecidos em busca de abrigo, contato social ou forrageamento. No entanto, novos locais podem envolv…

Discussion

Modelos de EA criados em diferentes linhagens murinas são comumente validados com testes de estado emocional, funções motoras e habilidades cognitivas de animais para facilitar a comparação com sintomas humanos31,32. Um déficit motor em modelos de EA é o achado mais consistente entre os laboratórios, seguido por um estado de emocionalidade inalterado dos mutantes e dificuldades na construção de ninhos31,32,33<sup class…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pela Academia Tcheca de Ciências RVO 68378050, LM2018126 Centro Tcheco de Fenogenômica fornecido por MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Atualização do Centro Tcheco de Fenogenômica: desenvolvendo para a pesquisa de tradução por MEYS e ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II por MEYS e ESIF) e OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (maior qualidade e capacidade para modelos transgênicos por MEYS e FEDER). Além disso, este estudo recebeu financiamento da ONG “Association of Gene Therapy (ASGENT)”, da Chéquia (https://asgent.org/) e LM2023036 Centro Checo de Fenogenómica fornecido pelo Ministério da Educação, Juventude e Desportos da República Checa.

Materials

Cages, individually ventilated Techniplast
DigiGait Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. 
FDA Nestlet squares Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow Altramion
Rotarod TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlin, Germany
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANCE
Reference: BIO-TST5 Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape Medical M, Ltd. P-AIRO1291 The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer – Video Tracking System Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Germany
Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. 

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Kubik-Zahorodna, A., Prochazka, J., Sedlacek, R. Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (200), e65182, doi:10.3791/65182 (2023).

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