Todos os animais e experimentos utilizados neste estudo foram submetidos à revisão ética e conduzidos de acordo com a Diretiva Europeia 2010/63/UE. O estudo foi aprovado pela Comissão Central Checa para o Bem-Estar Animal. Os camundongos foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente e mantidos a uma temperatura constante de 22 ± 2 °C com um ciclo claro/escuro de 12 horas. Os camundongos receberam ração e água ad libitum. Os camundongos foram alojados em grupos de três a seis animais por gaiola. Nenhuma manipulação além da pesagem foi realizada antes dos testes. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e equipamentos utilizados neste protocolo. 1. Considerações gerais que precedem e durante os ensaios NOTA: Por uma questão de clareza e compreensão, são apresentados comentários gerais antes da descrição dos testes individuais. Isto aplica-se a cada ensaio, com a excepção óbvia do ensaio de trituração de ninhos, que é realizado numa sala de alojamento e não requer a utilização de qualquer equipamento experimental. Acomodar os animais na instalação de pesquisa por pelo menos 14 dias antes do teste para minimizar qualquer estresse resultante do transporte e mudanças no ambiente. Registre o peso dos animais antes dos testes, pois o peso é um fator de confusão comum em pesquisas comportamentais. Deixar os animais aclimatarem-se na sala experimental por pelo menos 1 h após o transporte de sua sala de alojamento para minimizar o estresse de transporte, sempre que esse transporte ocorrer (ou seja, todos os testes descritos abaixo, exceto a trituração de ninhos, que é realizada na sala de alojamento). Rotular cada animal na cauda com um marcador atóxico à base de água para permitir uma rápida identificação durante o experimento. Retirar toda a urina e fezes depositadas pelos animais no aparato experimental durante os ensaios após cada ensaio. Limpar todo o aparato experimental com álcool a 75% antes e depois de cada animal testado. A limpeza remove vestígios olfativos depositados durante o teste e ajuda a manter condições experimentais estáveis. Transportar os animais de sua gaiola de origem para o aparato experimental com o máximo de cuidado possível, de preferência em um pequeno recipiente opaco, e depois liberá-los livremente, a menos que outras manipulações sejam necessárias. Coloque cada animal numa gaiola de detenção temporária após os testes para evitar que influenciem os animais não testados na gaiola doméstica. Testar machos e fêmeas em dias consecutivos. Alternar a ordem dos diferentes genótipos durante o teste para contrabalançar fatores ambientais imprevisíveis entre os grupos experimentais. Coloque os animais de volta em sua gaiola de origem depois que todos os animais tiverem sido testados e devolva-os de volta à sala de alojamento. No caso de ensaios repetidos em animais, manter um intervalo de pelo menos 1 dia entre cada ensaio. 2. Testes comportamentais Labirinto em cruz elevado (EPM)NOTA: Ambos os sexos das linhagens C57BL/6NCrl e UBE3AmGenedel/+ foram testados para este estudo com 9-12 semanas de idade. Os pesos dos animais variaram de 22 a 36 g para machos e 18 a 28 g para fêmeas no momento do teste.Coloque o labirinto em forma de plus na plataforma de teste logo abaixo da câmera. Usando o potenciômetro na parede, ajuste a intensidade da luz para 70 lux em seu centro com a ajuda de um luxômetro, com seu sensor colocado no centro do labirinto durante o ajuste. Abra o software clicando duas vezes no ícone do software Viewer e carregue a configuração para teste de EPM clicando no ícone no lado superior esquerdo da guia Configuração . Carregue o plugin EPM no menu Arquivo . Preencha as informações do animal usando o teclado do computador – ID do animal, genótipo, sexo e as informações do experimento (data, intensidade da luz) – nos campos correspondentes da guia Experimento . Verifique se a posição da zona, os braços abertos e os braços fechados estão configurados corretamente. Com a ajuda de um controle visual e do mouse do computador, verifique se as zonas virtuais delineadas correspondem às zonas EPM correspondentes na visualização de vídeo. O EPM é um teste usado para avaliar a ansiedade geral de um animal, que se baseia em abordagem – evitar conflitos. Os roedores naturalmente tendem a evitar áreas desprotegidas bem iluminadas (braços abertos), em favor das mais seguras (braços fechados). Como este teste totalmente automatizado é baseado em um sistema de rastreamento de vídeo, deixe o software calcular automaticamente o tempo gasto em cada zona, bem como o número de entradas. Durante os testes, grave os animais em vídeo por meio de uma câmera industrial sensível à luz infravermelha. Permitir que o software detecte a posição do animal em tempo real durante a gravação. Em seguida, deixe o software avaliar automaticamente os rastros do animal para calcular todos os parâmetros que descrevem o comportamento do animal no labirinto. Use o tempo gasto nos braços abertos ansiogênicos e a porcentagem de visitas de braços abertos para avaliar o nível de comportamento semelhante à ansiedade nos animais.NOTA: O labirinto feito sob medida é feito de material permeável à luz infravermelha e é colocado em uma plataforma de fonte de luz infravermelha de diodo emissor de luz (LED). Coloque o cursor do mouse no ícone de seta no lado superior esquerdo da guia Aquisição . Retire um animal da gaiola doméstica à mão e coloque-o suavemente no centro do EPM. Inicie o protocolo clicando com o botão esquerdo do mouse do computador e saia imediatamente da sala experimental. Quando o protocolo de gravação terminar após 5 min de exploração gratuita do labirinto, salve os dados gravados clicando em OK na janela que aparece após o término do protocolo, nomeie o arquivo apropriadamente e clique em Salvar. Exporte os resultados para um arquivo de .csv para cada animal testado para análise off-line clicando no ícone no painel vertical esquerdo da guia Análise de dados . Retire o animal do labirinto à mão e coloque-o na gaiola de retenção temporária. Proceder aos testes de todos os animais da mesma maneira. Copie os resultados de todos os animais testados para um arquivo do Bloco de Notas para análise off-line clicando no ícone Copiar Resultados na guia de resultados do plug-in do labirinto Elevated Plus .NOTA: O software e o hardware podem ser diferentes e os manuais relevantes devem ser seguidos. Além disso, a montagem experimental, como iluminação ou colocação de computadores, pode variar dependendo da construção do biotério. Teste de campo aberto (FO)NOTA: O teste de campo aberto avalia o movimento geral de um animal, que é desencadeado pelo comportamento exploratório em um ambiente novo. Além disso, é comumente usado como uma ferramenta de triagem para detectar ansiedade geral em um espaço desprotegido e bem iluminado. Este é um teste totalmente automatizado que utiliza um sistema de rastreamento de vídeo, que também foi usado no teste anterior.Coloque as quatro caixas de teste OF na plataforma de teste logo abaixo da câmera. Usando o potenciômetro na parede, ajuste a intensidade da luz para 200 lux no centro de cada teste de FO, com a ajuda de um luxômetro, com seu sensor colocado no centro de cada caixa durante o ajuste. Abra o software clicando duas vezes no ícone do software Viewer e carregue a configuração para o teste OF clicando no ícone no lado superior esquerdo da guia Configuração . Preencha as informações do animal usando o teclado do computador – ID do animal, genótipo, sexo e informações do experimento (data, intensidade da luz) – nos campos correspondentes da guia Experimento . Verifique se a posição da zona (centro e periferia) corresponde às caixas de teste OF e ajuste-as, se necessário. Com a ajuda de um controle visual e do mouse do computador, verifique se as zonas de centro e periferia delineadas virtuais correspondem às zonas de teste OF correspondentes na visualização de vídeo. Durante os testes, registre os animais em vídeo por meio de uma câmera industrial sensível à luz infravermelha. Permitir que o software detecte a posição do animal em tempo real durante o registro e avaliar automaticamente os rastros do animal para calcular todos os parâmetros que descrevem o comportamento do animal na caixa de teste FO. A distância percorrida, a velocidade média e o tempo de repouso são parâmetros usados para avaliar a atividade animal em um novo ambiente, enquanto o número de entradas do centro e a duração no centro descrevem o comportamento semelhante à ansiedade nos animais.NOTA: O labirinto feito sob medida é feito de material permeável à luz infravermelha e é colocado em uma plataforma de fonte de luz infravermelha LED. Coloque o cursor do mouse no ícone de seta no lado superior esquerdo da guia Aquisição . Retire quatro animais da gaiola doméstica à mão e coloque-os suavemente no canto de cada caixa de teste FO. Inicie o protocolo clicando com o botão esquerdo do mouse do computador e saia imediatamente da sala experimental. Quando o protocolo terminar após 10 min de exploração gratuita do labirinto, salve os dados clicando em OK na janela que aparece após o término do protocolo, nomeie o arquivo apropriadamente e clique em Salvar. Exporte os resultados para um arquivo .csv de cada animal testado para análise off-line clicando no ícone no painel vertical esquerdo da guia Análise de dados . Retire os animais do labirinto à mão e coloque-os na gaiola de retenção temporária. Proceder aos testes de todos os animais da mesma maneira. Analise os dados exportados.NOTA: O software e o hardware podem ser diferentes e os manuais relevantes devem ser seguidos. Além disso, a configuração experimental, como iluminação, número de labirintos ou colocação de computadores, pode variar dependendo da construção do biotério. Teste de suspensão traseira (TST)NOTA: Três ratos são testados simultaneamente com o aparelho de suspensão de cauda automatizado.Mantenha a intensidade da luz ambiente em 100-120 lux. Conecte o sistema TST com o computador através de um cabo USB. Insira o dongle USB no computador e inicie o software clicando duas vezes no ícone do software BIO-TST . Na guia Configurações em Global, ajuste a duração da aquisição para 360 s. Na guia Experimento , selecione Nova lista de assuntos e crie um novo arquivo de experimento e uma nova lista de sujeitos testados seguindo as instruções na guia aberta. Inicie a execução clicando em Iniciar execução | continuar na guia Aquisição . Preparar os animais para o teste enrolando fita adesiva unilateral, como a fita médica transpore, em torno de 3/4 da cauda do animal, a partir da base. Passe o gancho de suspensão através da fita e suspenda o animal sobre ela. Comece a adquirir dados para cada animal individualmente imediatamente após pendurá-lo no gancho clicando no ícone Iniciar sob a posição visualizada para cada animal e observe os animais continuamente durante o teste. Após a conclusão da aquisição para o primeiro conjunto de animais, clique em Iniciar a próxima corrida, retire os animais do gancho, retire a fita adesiva de suas caudas, corte cuidadosamente a fita com tesoura ao longo da cauda e coloque os animais na gaiola de retenção temporária. Limpar o aparelho com álcool a 75% e lenços de papel e proceder com o resto dos animais como descrito acima. Na guia Análise, selecione os últimos 4 min da aquisição para análise, selecione todas as execuções válidas no período de análise, clique em Analisar assuntos selecionados, escolha o formato de dados desejado e clique em Exportar dados selecionados para exportar os dados coletados para análise posterior.NOTA: O teste dura 6 min. Durante os primeiros 2 min, os animais lutarão vigorosamente, mas como a reação de desespero se torna predominante durante os 4 min restantes, o tempo de imobilidade durante esse período é levado para a análise. O software e o hardware podem ser diferentes, e os manuais relevantes devem ser seguidos. Além disso, o próprio equipamento pode variar (por exemplo, número de posições de teste). Análise da marchaLigue a esteira e ajuste manualmente a velocidade da correia para 20 cm/s no painel do equipamento clicando no símbolo + ou – situado ao lado do indicador de velocidade. Acenda a luz do aparelho girando o botão no sentido horário. Inicie o software DigiGait Imager clicando duas vezes no ícone do software e defina a velocidade do obturador para 100 para mouses albinos ou 130 para mouses pretos/escuros no campo para velocidade do obturador. Retire o primeiro animal da gaiola doméstica com a mão e coloque-o delicadamente no cinto da esteira. Feche a porta do compartimento do animal. Inspecione visualmente para garantir que a cauda do animal não fique presa entre a porta e a moldura. Permita que o mouse explore a esteira antes da gravação. Verifique se o animal é capaz de realizar o teste colocando a esteira em uma velocidade de caminhada lenta por ~3 s e, em seguida, parando-a, observando o animal continuamente. Inicie a correia pressionando o botão Start no painel do equipamento e grave por aproximadamente 10 s. Certifique-se de que uma locomoção clara e fluente de pelo menos 10-15 passos seja observável. Pare a correia pressionando o botão Parar no painel do equipamento e devolva o mouse para a gaiola de fixação temporária com a mão. Filtre a gravação para uma sequência de imagens com passos fluentes clicando em PLAY e revisando a gravação com o controle visual no modo EDIT . Escolha de 10 a 15 movimentos fluentes escrevendo manualmente seus números de quadro inicial e final nos campos relevantes (Do quadro# para o primeiro quadro e Para para o último quadro). Preencha as informações do animal – identificação do animal, data de nascimento, sexo, peso, velocidade do cinto e ângulo do cinto – e comente quando necessário nos campos pertinentes. Salve o arquivo para análise adicional clicando em Salvar. Limpe o cinto com água e proceda com o resto dos animais da mesma forma. Escolha CÂMERA para prosseguir com a gravação do próximo animal caminhando. Quando forem adquiridos registros para todos os animais, proceda à análise.NOTA: Os animais que não são capazes de andar a uma velocidade definida do cinto são excluídos dos ensaios. Com base em nossa experiência, observamos que animais mais velhos (acima de 50 semanas) apresentam mais dificuldades para andar na esteira, com frequência variável entre 2% a 50%, dependendo do genótipo. Os dejetos animais são coletados em bandejas na frente ou atrás da esteira. As bandejas são esvaziadas após cada estudo e lavadas com água morna e sabão. O cinto é limpo com um pano úmido. Realizar análise da marcha com base em uma análise totalmente automatizada de gravações de vídeo de pegadas de animais. Ajuste os dados no software DigiGait Analysis .NOTA: A análise da marcha fornece não apenas uma medida de coordenação motora, mas também uma descrição cinemática detalhada baseada na análise do sinal dinâmico da marcha, representando a história temporal do posicionamento da pata através de passadas sequenciais. Os seguintes parâmetros são medidos automaticamente pelo software: duração do balanço, percentagem da duração da passada no balanço, duração da travagem, percentagem da duração da passada na travagem, duração da propulsão, percentagem da passada na propulsão, duração da postura, percentagem da passada na posição, duração da passada, percentagem da travagem da posição, percentagem da propulsão da fase de apoio, relação oscilação/apoio, comprimento da passada, frequência da passada, ângulo da pata, variabilidade do ângulo da pata, largura da postura, ângulo do passo, variabilidade do comprimento da passada, variabilidade da largura da passada, variabilidade do ângulo da passada, coeficiente de variação do comprimento da passada, coeficiente de variação da largura da passada, coeficiente de variação da largura da haste, coeficiente de variação da duração da oscilação, área da pata na altura do pico, variabilidade da área da pata na posição do pico, duração do apoio compartilhado dos membros posteriores, porcentagem de posição compartilhada, relação entre as durações dos apoios traseiros esquerdo e direito, simetria da marcha, taxa máxima de mudança da área da pata em contato com o cinto da esteira durante a fase de frenagem, taxa máxima de mudança da área da pata em contato com o cinto da esteira durante a fase de propulsão, propulsão tau, distância de sobreposição da pata, posicionamento da pata, coeficiente de ataxia, distância da linha média, distância do eixo e arrasto da pata. O software permite uma pequena correção do ruído do traço do passo, que deve ser preenchida antes da análise estatística. O software e o hardware podem ser diferentes, e os manuais relevantes devem ser seguidos. RotarodNOTA: O teste rotarod é utilizado para avaliar as funções motoras dos roedores-equilíbrio e coordenação motora. O teste requer que um mouse ande sobre uma haste giratória de diâmetro fixo (5 cm), com a rotação acelerando por um determinado período de tempo (5 min) até que o animal não possa mais permanecer.Ligue o equipamento rotarod pressionando o botão liga/desliga no equipamento e inicie o software clicando duas vezes no ícone do software Rod . Inicialize um novo arquivo na guia Arquivo e salve-o com o nome apropriado. Na janela Configuração , preencha os detalhes do experimento, como a data, o nome do usuário e eventuais comentários. Defina o perfil de velocidade para 300 s, velocidade inicial para 4 rpm e velocidade terminal para 40 rpm. Prepare um cronograma para os animais testados no campo animal e atribua a cada animal sua posição na haste. As posições não são indicadas no software explicitamente, mas correspondem à linha da lista; Por exemplo, a primeira linha indicaria a primeira posição da haste, a quinta linha indicaria a quinta posição da haste e assim por diante. Lembre-se de contrabalançar cada posição da haste entre os grupos experimentais.NOTA: Cinco animais podem ser testados simultaneamente. Feche o painel Configuração clicando em Fechar e abra o painel de medição clicando em Medir. Inicie a rotação inicial da haste a 4 rpm clicando em Iniciar/Parar e coloque os cinco primeiros animais em suas posições atribuídas. Quando todos os animais estiverem na haste, inicie o protocolo de teste clicando em Iniciar Perfil, e a haste acelerará gradualmente até 40 rpm ao longo de 5 min. Se um animal cair da vara, devolva-o à haste antes do início do protocolo.NOTA: Os animais geralmente não ficam na haste por tempo suficiente para colocar todos os ratos nela de uma só vez durante a primeira tentativa. É importante ter paciência ao colocar os animais na haste com a velocidade constante de rotação no início. O objetivo do teste não é determinar a resistência do animal na haste em uma velocidade de rotação fixa, mas encontrar a velocidade em que o animal é incapaz de permanecer na haste. A velocidade da haste é proporcional à latência de permanecer nela; Assim, é usado para expressar o equilíbrio do animal. Mova os animais para a gaiola de detenção temporária depois de todos terem caído da vara ou depois de 5 minutos terem passado. Retire todos os dejetos de animais e limpe a haste e a bandeja com álcool. Clique em Animais -> para prosseguir com o próximo grupo de animais da mesma maneira. Depois de testar todos os animais, feche a janela Medir clicando em Fechar e clique em Mostrar para exibir os dados coletados. Exporte os dados adquiridos em .csv formato de arquivo para análise adicional clicando em Exportar CSV. Testar cada animal na haste três vezes com intervalos interexperimentais de 15 min. Use o valor médio da latência para cair ao longo das três tentativas para análise estatística adicional. Avaliar o aprendizado motor do animal repetindo o teste por 5 dias consecutivos.NOTA: O software e o hardware podem ser diferentes e os manuais relevantes devem ser seguidos. Além disso, o equipamento em si pode variar, por exemplo, em número de posições de teste, construção geral e dimensão da haste. Edifício do ninho de trituraçãoSepare os animais em gaiolas únicas de policarbonato com equipamento padrão (cama, tela de alimentação e fornecimento de água) por 1 semana. Pegue aproximadamente 12 g de ninho de algodão usando pinças, registre seu peso manualmente usando balanças e coloque-o aleatoriamente em uma gaiola, mas no lado oposto ao abastecimento de água. Devolva as gaiolas com os animais para a sala de alojamento. Pesar cada ninho à mesma hora todos os dias durante os próximos 4 dias manualmente usando balanças. Registre os pesos em papel ou em uma planilha pré-elaborada. Certifique-se de que cada ninho esteja seco quando pesado; Caso contrário, seque em uma almofada de aquecimento e devolva todos os ninhos para suas gaiolas designadas ao mesmo tempo no local onde o rato fez seu ninho. Se o ninho for rasgado em várias partes, pese a maior. Para análise dos dados, expressar o decréscimo no peso dos filhotes em cada dia em relação ao peso inicial e apresentá-lo em porcentagem do material utilizado.NOTA: Trazer os machos de volta para uma gaiola comum pode levar ao aumento da agressividade e lesões indesejadas entre os animais. Portanto, o teste de trituração de filhotes deve ser agendado no final do regime de teste para evitar comprometer o bem-estar animal.