Lipid Nanopartikül (LNP) Formülasyon Optimizasyonu için Tasarlanmış Karışım-Proses Deneyleri ve Kendi Kendini Doğrulayan Topluluk Modelleri (SVEM) Kullanarak Bir İş Akışı

Summary

Bu protokol, deneysel tasarım yapımında öznel seçimleri en aza indiren karışım, sürekli ve kategorik çalışma faktörleri üzerinden formülasyon optimizasyonuna bir yaklaşım sağlar. Analiz aşaması için etkili ve kullanımı kolay bir modelleme montaj prosedürü kullanılır.

Abstract

Bilim insanlarına erişilebilir bir iş akışı sunmayı amaçlayan lipid nanopartikül (LNP) formülasyonlarını optimize etmek için Tasarımla Kalite (QbD) tarzı bir yaklaşım sunuyoruz. İyonlaştırılabilir, yardımcı ve PEG lipitlerinin molar oranlarının% 100'e kadar eklenmesi gereken bu çalışmalardaki doğal kısıtlama, bu karışım kısıtlamasını karşılamak için özel tasarım ve analiz yöntemleri gerektirir. LNP tasarım optimizasyonunda yaygın olarak kullanılan lipit ve proses faktörlerine odaklanarak, boşluk doldurma tasarımlarını kullanarak ve yakın zamanda geliştirilen kendi kendini doğrulayan topluluk modellerinin (SVEM) istatistiksel çerçevesini kullanarak, karışım-proses deneylerinin tasarımında ve analizinde geleneksel olarak ortaya çıkan zorlukların çoğundan kaçınan adımlar sunuyoruz. Aday optimal formülasyonlar üretmenin yanı sıra, iş akışı aynı zamanda sonuçların yorumlanmasını basitleştiren uygun istatistiksel modellerin grafiksel özetlerini de oluşturur. Yeni belirlenen aday formülasyonlar onay çalışmaları ile değerlendirilir ve isteğe bağlı olarak daha kapsamlı bir ikinci aşama çalışması bağlamında gerçekleştirilebilir.

Introduction

İn vivo gen dağıtım sistemleri için lipid nanopartikül (LNP) formülasyonları genellikle iyonlaştırılabilir, yardımcı ve PEG lipitleri ^1,2,3 kategorilerinden dört bileşen lipit içerir. Bu lipitlerin tek başına veya diğer karışım dışı faktörlerle eşzamanlı olarak çalışılıp çalışılmadığına bakılmaksızın, bu formülasyonlar için yapılan deneyler "karışım" tasarımları gerektirir, çünkü - aday bir formülasyon göz önüne alındığında - lipitlerden herhangi birinin oranının arttırılması veya azaltılması zorunlu olarak diğer üç lipitin oranlarının toplamında karşılık gelen bir azalmaya veya artışa yol açar.

Örnek olarak, şu anda kriter olarak ele alınacak bir set tarifi kullanan bir LNP formülasyonunu optimize ettiğimiz varsayılmaktadır. Amaç, LNP'nin gücünü en üst düzeye çıkarırken, ikincil olarak ortalama parçacık boyutunu en aza indirmeyi amaçlamaktadır. Deneyde değişen çalışma faktörleri, dört kurucu lipitin (iyonize edilebilir, kolesterol, DOPE, PEG) molar oranları, N: P oranı, akış hızı ve iyonize edilebilir lipit tipidir. İyonlaştırılabilir ve yardımcı lipitlerin (kolesterol dahil), bu çizimde% 1-5 arasında değişecek olan PEG'den% 10-60 daha geniş bir molar oran aralığında değişmesine izin verilir. Kıyaslama formülasyonu tarifi, diğer faktörlerin aralıkları ve yuvarlama ayrıntı düzeyleri Ek Dosya 1'de belirtilmiştir. Bu örnek için, bilim adamları tek bir günde 23 çalışma (benzersiz parçacık grupları) gerçekleştirebilirler ve minimum gereksinimleri karşılıyorsa bunu örneklem büyüklüğü olarak kullanmak isterler. Bu denemenin simülasyon sonuçları Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3'te sağlanmıştır.

Rampado ve Peer⁴, nanopartikül tabanlı ilaç dağıtım sistemlerinin optimizasyonu için tasarlanmış deneyler konusunda yeni bir inceleme makalesi yayınladı. Kauffman ve ^ark.5, kesirli faktöriyel ve kesin tarama tasarımları kullanarak LNP optimizasyon çalışmalarını ele almıştır⁶; Bununla birlikte, bu tür tasarımlar, verimsiz "gevşek değişkenler"7 kullanımına başvurmadan bir karışım kısıtlamasına uyum sağlayamaz ve tipik olarak karışım faktörleri mevcut olduğunda kullanılmaz ^7,8. Bunun yerine, bir karışım kısıtlaması içerebilen "optimal tasarımlar" geleneksel olarak karışım-proses deneyleri için kullanılır⁹. Bu tasarımlar, çalışma faktörlerinin kullanıcı tarafından belirlenen bir işlevini hedefler ve yalnızca bu işlev çalışma faktörleri ve yanıtlar arasındaki gerçek ilişkiyi yakalarsa (bir dizi olası duyudan birinde) optimaldir. Metinde "optimal tasarımlar" ve "optimal formülasyon adayları" arasında bir ayrım olduğunu ve ikincisinin istatistiksel bir model tarafından tanımlanan en iyi formülasyonlara atıfta bulunduğunu unutmayın. Optimum tasarımlar, karışım-proses deneyleri için üç ana dezavantajla birlikte gelir. İlk olarak, bilim adamı hedef modeli belirlerken çalışma faktörlerinin etkileşimini öngöremezse, ortaya çıkan model önyargılı olacak ve daha düşük aday formülasyonlar üretebilecektir. İkincisi, optimum tasarımlar, koşuların çoğunu faktör alanının dış sınırına yerleştirir. LNP çalışmalarında, parçacıklar lipit veya proses ayarlarının herhangi bir uç noktasında doğru şekilde oluşmazsa, bu çok sayıda kayıp çalışmaya yol açabilir. Üçüncüsü, bilim adamları genellikle tepki yüzeyinin modelden bağımsız bir duygusunu kazanmak ve süreci doğrudan faktör uzayının daha önce keşfedilmemiş bölgelerinde gözlemlemek için faktör uzayının iç kısmında deneysel çalışmalar yapmayı tercih ederler.

Alternatif bir tasarım ilkesi, (karışım kısıtlamalı) faktör alanının yaklaşık olarak eşit bir kapsamını boşluk doldurma tasarımı¹⁰ ile hedeflemektir. Bu tasarımlar, optimal tasarımlara göre bazı deneysel verimlilikleri feda eder⁹ (tüm faktör alanının geçerli formülasyonlara yol açtığını varsayarsak), ancak bu uygulamada yararlı olan bir takasta çeşitli faydalar sunar. Boşluk doldurma tasarımı, tepki yüzeyinin yapısı hakkında herhangi bir a priori varsayımda bulunmaz; Bu, çalışma faktörleri arasındaki beklenmedik ilişkileri yakalama esnekliği sağlar. Bu aynı zamanda tasarım oluşturmayı da kolaylaştırır, çünkü istenen çalıştırma boyutu ayarlanırken hangi regresyon terimlerinin ekleneceği veya kaldırılacağı konusunda karar vermeyi gerektirmez. Bazı tasarım noktaları (tarifler) başarısız formülasyonlara yol açtığında, boşluk doldurma tasarımları, çalışma faktörleri üzerindeki başarısızlık sınırını modellemeyi mümkün kılarken, aynı zamanda başarılı faktör kombinasyonları üzerindeki çalışma yanıtları için istatistiksel modelleri de destekler. Son olarak, faktör uzayının iç kapsama alanı, tepki yüzeyinin modelden bağımsız grafiksel olarak araştırılmasına izin verir.

Bir karışım-işlem deneyinin karışım faktörü alt alanını görselleştirmek için, özel üçgen "üçlü grafikler" kullanılır. Şekil 1 bu kullanımı motive eder: üç bileşenin her birinin 0 ila 1 arasında değişmesine izin verilen noktalar küpünde, bileşenlerin toplamının 1'e eşit olduğu bir kısıtlamayı karşılayan noktalar kırmızı renkle vurgulanır. Üç bileşen üzerindeki karışım kısıtlaması, uygulanabilir faktör alanını bir üçgene indirger. Dört karışım bileşeni içeren LNP uygulamalarında, diğer lipitlerin toplamını temsil eden bir "Diğerleri" eksenine karşı bir seferde iki lipit çizerek faktör uzayını temsil etmek için altı farklı üçlü grafik üretiyoruz.

Resim 1: Üçgen faktör bölgeleri. Küp içindeki boşluk doldurma grafiğinde, küçük gri noktalar karışım kısıtlamasıyla tutarsız formülasyonları temsil eder. Daha büyük kırmızı noktalar, küpün içine yazılmış bir üçgen üzerinde bulunur ve karışım kısıtlamasının karşılandığı formülasyonları temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Lipid karışım faktörlerine ek olarak, genellikle N: P oranı, tampon konsantrasyonu veya akış hızı gibi bir veya daha fazla sürekli proses faktörü vardır. İyonlaştırılabilir lipit tipi, yardımcı lipit tipi veya tampon tipi gibi kategorik faktörler mevcut olabilir. Amaç, bir miktar potens ölçüsünü en üst düzeye çıkaran ve / veya partikül boyutunu ve PDI'yı (polidispersite indeksi) en aza indirmek, yüzde kapsüllemeyi en üst düzeye çıkarmak ve vücut ağırlığı kaybı gibi yan etkileri en aza indirmek gibi fizyokimyasal özellikleri geliştiren bir formülasyon (lipitlerin ve proses faktörleri için ayarların bir karışımı) bulmaktır. in vivo çalışmalar. Makul bir kıyaslama tarifinden başlarken bile, genetik yükteki bir değişiklik göz önüne alındığında veya proses faktörlerindeki veya lipit tiplerindeki değişiklikler göz önüne alındığında yeniden optimizasyona ilgi duyulabilir.

Cornell⁷ , karışım ve karışım-proses deneylerinin istatistiksel yönleri hakkında kesin bir metin sunarken, Myers ve ^ark.9 , optimizasyon için en alakalı karışım tasarımı ve analiz konularının mükemmel bir özetini sunmaktadır. Bununla birlikte, bu çalışmalar bilim adamlarını istatistiksel ayrıntılarla ve özel terminolojiyle aşırı yükleyebilir. Deneylerin tasarımı ve analizi için modern yazılım, ilgili teoriye başvurmak zorunda kalmadan çoğu LNP optimizasyon problemini yeterince destekleyecek sağlam bir çözüm sunar. Daha karmaşık veya yüksek öncelikli çalışmalar hala bir istatistikçi ile işbirliğinden faydalanacak ve alan doldurma tasarımları yerine optimal kullanabilse de, amacımız bilim adamlarının konfor seviyesini iyileştirmek ve LNP formülasyonlarının optimizasyonunu teşvik etmektir. verimsiz bir kerede bir faktörlü (OFAT) test¹¹ veya sadece spesifikasyonları karşılayan ilk formülasyona razı olmadan.

Bu makalede, genel bir LNP formülasyon problemini optimize etmek için istatistiksel yazılımı kullanan, tasarım ve analiz sorunlarını karşılaşacakları sırayla ele alan bir iş akışı sunulmaktadır. Aslında, yöntem genel optimizasyon problemleri için işe yarayacaktır ve LNP'lerle sınırlı değildir. Yol boyunca, ortaya çıkan birkaç yaygın soru ele alınmakta ve deneyime ve simülasyon sonuçlarına dayanan öneriler sağlanmaktadır¹². Yakın zamanda geliştirilen kendi kendini doğrulayan topluluk modelleri (SVEM)¹³ çerçevesi, karışım-proses deneylerinden elde edilen sonuçları analiz etmek için aksi takdirde kırılgan olan yaklaşımı büyük ölçüde geliştirmiştir ve bu yaklaşımı formülasyon optimizasyonu için basitleştirilmiş bir strateji sağlamak için kullanıyoruz. İş akışı, diğer yazılım paketleri kullanılarak takip edilebilecek genel bir şekilde inşa edilmiş olsa da, JMP 17 Pro, karışım-süreç deneylerinin aksi takdirde gizemli analizini basitleştirmek için gerekli olduğunu bulduğumuz grafiksel özet araçlarıyla birlikte SVEM'i sunma konusunda benzersizdir. Sonuç olarak, JMP'ye özgü talimatlar da protokolde sağlanmaktadır.

SVEM, geleneksel yaklaşımla aynı doğrusal regresyon modeli temelini kullanır, ancak ileri seçim veya cezalı seçim (Lasso) temel yaklaşımını kullanarak aday etkilerin "tam modeline" uyması gereken sıkıcı değişikliklerden kaçınmamızı sağlar. Ek olarak, SVEM, verilerde görünen gürültüyü (proses artı analitik varyans) dahil etme potansiyelini en aza indiren gelişmiş bir "azaltılmış model" uyumu sağlar. 13,14,15,16,17,18 modelindeki her bir çalıştırmanın göreceli öneminin tekrar tekrar ağırlıklandırılmasından kaynaklanan tahmin edilen modellerin ortalamasını alarak çalışır. SVEM, karışım-proses deneylerinin modellenmesi için hem geleneksel tek atışlı regresyondan daha kolay uygulanabilir hem de daha kaliteli optimal formülasyon adayları^12,13 sağlayan bir çerçeve sağlar. SVEM'in matematiksel detayları bu makalenin kapsamı dışındadır ve ilgili literatür taramasının ötesinde üstünkörü bir özet bile bu uygulamadaki ana avantajından uzaklaşacaktır: uygulayıcılar için basit, sağlam ve doğru bir tıkla-çalıştır prosedürüne izin verir.

Sunulan iş akışı, farmasötik geliştirmeye yönelik Tasarıma Göre Kalite (QbD)¹⁹ yaklaşımı²⁰ ile tutarlıdır. Çalışmanın sonucu, malzeme niteliklerini ve proses parametrelerini kritik kalite niteliklerine (CQA'lar) bağlayan fonksiyonel ilişkinin anlaşılması ^olacaktır21. Daniel ve ^ark.22 , özellikle RNA platformu üretimi için bir QbD çerçevesi kullanmayı tartışıyor: iş akışımız bu çerçevede bir araç olarak kullanılabilir.

Protocol

Temsilci Sonuçlar bölümünde açıklanan deney, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitemiz (IACUC) tarafından belirlenen kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 6-8 haftalık dişi Balb/C fareleri ticari olarak elde edildi. Hayvanlar ad libitum standart chow ve su aldı ve standart koşullar altında,% 40-60 nem ile 65-75 ° F (~ 18-23 ° C) sıcaklıkta 12 saatlik açık / karanlık döngüleri ile barındırıldı.

1. Çalışma amacını, yanıtlarını ve faktörlerini kaydetme

NOT: Bu protokol boyunca, deneyi tasarlamak ve analiz etmek için JMP 17 Pro kullanılır. Benzer adımlar izlenerek eşdeğer yazılımlar kullanılabilir. Bölüm 1'de gerçekleştirilen tüm adımlara ilişkin örnekler ve daha fazla talimat için lütfen Ek Dosya 1'e bakın.

1. Denemenin amacını tarih damgalı bir belgede özetleyin.
2. Deneme sırasında ölçülecek birincil yanıtları (CQA) listeleyin.
3. Ölçülebilecek ikincil yanıtları (örneğin, fizyokimyasal özellikler üzerindeki aşağı akış kısıtlamaları) listeleyin.
4. Çalışmanın amacı ile en alakalı olanlar da dahil olmak üzere yanıtlarla ilgili olabilecek süreç parametrelerini listeleyin.
5. Çalışma birden fazla gün boyunca sürecekse, bir Gün kategorik "engelleme" faktörü ekleyin.
   NOT: Bu, süreç ortalamasındaki gün düzeyindeki değişimlerin çalışma faktörleriyle karıştırılmasını önlemek için faktör ayarlarını günler arasında dengeler.
6. Çalışma sırasında çeşitlendirilecek ve sabit tutulacak faktörleri seçin.
   NOT: En ilgili faktörler alt kümesini seçmek için hata modu etki analizleri²⁰ gibi risk önceliklendirme araçlarını kullanın (Şekil 2). Genellikle, tüm lipitlerin değişmesine izin verilmelidir; ancak bazı bütçe kısıtlı durumlarda, PEG'i sabit bir oranda kilitlemek mantıklıdır.
7. Değişen faktörler için aralıkları ve her biri için ilgili ondalık hassasiyeti belirleyin.
8. Minimum ve maksimum sezgisel yöntemleri kullanarak etüt tasarım boyutuna (benzersiz parçacık gruplarının sayısı) karar verin. El ile dahil edilen kontrol kıyaslama çalıştırmaları, sezgisel yöntemler tarafından önerilen çalıştırma boyutuna dahil edilmez.
   NOT: Aşağıdaki buluşsal yöntemler, yanıtların sürekli olduğunu varsayar. Minimum sezgisel yöntem, aday optimal formülasyonları için doğrulama çalışmaları gerçekleştirmenin yanı sıra, gerekirse bir takip çalışması yapmanın mümkün olacağını varsayar. Yalnızca onay çalıştırmaları gerçekleştirmek mümkün olacaksa, maksimum sezgisel yöntemden elde edilen çalıştırma sayısını bütçelemek daha iyidir. İkili birincil yanıtlar için, uygun çalıştırma sayısını belirlemek üzere bir istatistikçiden yardım isteyin.
   1. Minimum sezgisel yöntem: Karışım faktörü başına üç, sürekli proses faktörü başına iki ve her kategorik faktörün seviyesi başına bir çalışma ayırın.
      NOT: Dört lipit faktörü, iki sürekli ve bir üç yönlü kategorik süreç değişkeni olan bir çalışma için bu, (3 x 4) + (2 x 2) + 3 = 19 boşluk doldurma çalışması önerisine yol açar. Bazılarının formülasyon veya ölçüm sorunları nedeniyle başarısız olma olasılığı varsa ek çalıştırmalar ekleyin.
   2. Maksimum sezgisel yöntem: En uygun tasarımları oluşturmak için yazılımı başlatın ve ikinci bir sipariş için gerekli parametreleri girin (ana etkiler, tüm efektler arasındaki iki yönlü etkileşimler ve sürekli proses faktörleri için ikinci dereceden etkiler dahil). Yazılımın algoritmasına göre minimum çalışma boyutunu hesaplayın. Maksimum sezgisel yöntemi tanımlamak için yazılımdan elde edilen sonuca 1 ekleyin.
      NOT: Bu adımların gerçekleştirilmesiyle ilgili ayrıntılı yönergeler için Ek Dosya 1'e bakın. Dört lipid faktörü, iki sürekli ve bir üç yönlü kategorik proses değişkeni içeren örnek bir vaka, önerilen çalışma boyutunun 34 (yazılım önerisinden 33 + 1) olmasına yol açar. Bunun ötesindeki herhangi bir çalışma muhtemelen doğrulama veya takip çalışmaları için daha iyi kullanılacaktır.

Şekil 2: Neden ve sonuç diyagramı. Diyagram, bir LNP formülasyon optimizasyonu problemindeki ortak faktörleri göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Boşluk doldurma tasarımına sahip tasarım tablosunun oluşturulması

1. JMP'yi açın ve menü çubuğunda DOE > Özel Amaçlı > Alanı Doldurma Tasarımı'na gidin.
2. Çalışma yanıtlarını girin (bkz. Ek Dosya 1).
3. İsteğe bağlı: Ek yanıtlar için, Yanıt Ekle'yi tıklayarak her birinin ekranı kaplayıp kaplamayacağını, simge durumuna küçültüleceğini veya hedeflenip hedeflenmeyeceğini belirten sütunlar ekleyin.
   NOT: Bu ayarlar daha sonra değiştirilebilir ve tasarımı etkilemez. Benzer şekilde, tasarım tablosu oluşturulduktan sonra ek yanıtlar için ek sütunlar eklenebilir.
4. Etüt faktörlerini ve ilgili aralıkları girin. Karışım faktörleri eklemek için Karışım düğmesini, sürekli faktörler eklemek için Sürekli düğmesini veya kategorik faktörler eklemek için Kategorik düğmesini kullanın.
   NOT: Bu örnek çalışma, İyonlaştırılabilir molar oranı (0.1 ile 0.6 arasında değişen), Yardımcı molar oranı (ayrıca 0.1 ile 0.6 arasında), Kolesterol molar oranını (0.1 ile 0.6 arasında), PEG molar oranını (0.01 ila 0.05 arasında) ve İyonlaştırılabilir Lipid Tipini (H101 olabilir) içeren Şekil 3'te gösterilen faktörleri ve aralıkları kullanır. H102 veya H103).
5. Tasarım için önceden belirlenmiş çalıştırma sayısını Çalıştırma Sayısı alanına girin.
6. İsteğe bağlı: Boşluk Doldurma Tasarımı başlığının yanındaki kırmızı üçgen menüden ve Gelişmiş Seçenekler alt menüsündeki Ortalama Küme Boyutu'nu varsayılan değer olan 50'den 2000'e yükseltin.
   NOT: Bu, ek hesaplama süresi pahasına biraz daha iyi tasarım yapımına yol açabilecek alan doldurma algoritması için bir ayardır.
7. Seçilen faktörler ve çalışma boyutu için boşluk doldurma tasarım tablosunu oluşturun. Hızlı Esnek Dolgu'yu, ardından Tablo Yap'ı tıklayın.
   NOT: Örnek bir tasarımın ilk iki çalıştırması Şekil 4'te gösterilmiştir.
8. El ile oluşturulan çalıştırmalara açıklama eklemek için tabloya bir Notlar sütunu ekleyin. Sütun eklemek için ilk boş sütun başlığını çift tıklatın ve ardından adı düzenlemek için yeni sütun başlığını çift tıklatın.
9. Uygulanabilirse, kıyaslama kontrolü çalıştırmalarını tasarım tablosuna manuel olarak dahil edin. Kontrol ölçütlerinden biri için bir çoğaltma ekleyin. Notlar sütununda karşılaştırma adını işaretleyin ve grafiğin kolay tanımlanması için karşılaştırma çoğaltma satırlarının renk kodunu oluşturun.
   1. İlk boş satır başlığını çift tıklatarak yeni bir satır ekleyin ve karşılaştırma faktörü ayarlarını girin. Karşılaştırma testinin bir çoğaltmasını oluşturmak için bu satırı çoğaltın. Her iki satırı da vurgulayın ve grafik oluşturma amacıyla bir renk atamak için Satırlar > Renkler'e gidin.
      NOT: Çoğaltma, işlemin modelden bağımsız bir tahminini ve analitik varyansı sağlar ve ek grafik içgörü sağlar.
10. Herhangi bir kıyaslama kontrol çalışması etüt faktörlerinin aralığını aşarsa, gelecekte analizden hariç tutulmak için bunu "Notlar" sütununda belirtin.
11. Karışım faktörlerini uygun granülerliğe yuvarlayın. Bunu yapmak için,
    1. Karışım faktörleri için sütun başlıklarını vurgulayın, sütun başlıklarından birini sağ tıklatın ve Yeni Formül Sütunu > Dönüştür > Yuvarlama...'ya gidin, doğru yuvarlama aralığını girin ve Tamam'ı tıklatın.
    2. Satır ve sütun başlıklarının kesiştiği yerdeki alt üçgeni tıklatarak hiçbir satırın seçilmediğinden emin olun.
    3. Yeni oluşturulan yuvarlatılmış sütunlardaki (Ctrl + C) değerleri kopyalayın ve orijinal karışım sütunlarına yapıştırın (Ctrl + V). Son olarak, geçici yuvarlatılmış değer sütunlarını silin.
12. Lipid oranlarını yuvarladıktan sonra, karışım faktörleri için sütun başlıklarını seçip, birini sağ tıklatıp Yeni Formül Sütunu > Toplamı Birleştir'e giderek toplamlarının %>100'e eşit olduğunu doğrulayın. Herhangi bir satırın toplamı 1'e eşit değilse, faktör ayarının faktör aralığında kalmasını sağlamak için karışım faktörlerinden birini manuel olarak ayarlayın. Ayarlamalar yapıldıktan sonra toplam sütununu silin.
13. Proses faktörlerini ilgili taneciklerine yuvarlamak için karışım faktörlerini yuvarlamak için kullanılan prosedürü izleyin.
14. Lipid sütunlarını, istenen ondalık sayı sayısına sahip yüzdeler olarak görüntülenecek şekilde biçimlendirin: sütun başlıklarını seçin, sağ tıklayın ve Öznitelikleri Standartlaştır...'ı seçin. Bir sonraki pencerede, Biçim'i Yüzde olarak ayarlayın ve ondalık sayı sayısını gerektiği gibi ayarlayın.
15. Karşılaştırma testleri gibi el ile çalıştırmalar eklenirse, tablo satır sırasını yeniden rasgele hale getirin: rasgele değerlere sahip yeni bir sütun ekleyin (Son sütun başlığını sağ tıklatın ve Yeni Formül Sütunu> Rastgele > Rastgele Normal'i seçin). Bu sütunu, sütun başlığını sağ tıklatarak artan düzende sıralayın ve ardından sütunu silin.
16. İsteğe bağlı: Bir Run ID sütunu ekleyin. Bunu tablodaki geçerli tarih, deneme adı ve satır numarasıyla doldurun.
    NOT: Örnek için bkz. (Şekil 5).
17. Lipit faktörleri üzerindeki tasarım noktalarını görselleştirmek için üçlü grafikler oluşturun (Şekil 6). Ayrıca, süreç faktörleri üzerindeki çalışma dağılımını inceleyin (Şekil 7): Grafik > Üçlü Grafik'i seçin. X, Plotting için sadece karışım faktörlerini seçin.
18. İşlem faktörleri üzerindeki dağılımı incelemek için Dağıtımı Analiz > seçin ve Y, Sütunlar için işlem faktörlerini girin.
    NOT: Formülasyon bilimcisi, tüm çalışmaların fizibilitesini onaylamalıdır. Mümkün olmayan çalıştırmalar varsa, yeni keşfedilen kısıtlamaları göz önünde bulundurarak tasarımı yeniden başlatın.

Şekil 3: Çalışma faktörleri ve aralıkları. Deneysel yazılım içindeki ayarların ekran görüntüleri, çalışma kurulumunu yeniden üretmek için kullanışlıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Boşluk doldurma tasarımının ilk çıktısı. Tablonun ilk iki satırını gösteren ayarların istenen hassasiyete yuvarlanması ve lipit miktarlarının toplamının 1 olduğundan emin olunması gerekir. Karşılaştırma tablosuna el ile eklenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Biçimlendirilmiş etüt tablosu. Faktör düzeyleri yuvarlanıp biçimlendirildi ve bir Çalıştırma Kimliği sütunu eklendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Üçlü bir arsa üzerindeki tasarım noktaları. 23 formülasyon, karşılık gelen İyonlaştırılabilir, Yardımcı ve "Diğerleri" (Kolesterol + PEG) oranlarının bir fonksiyonu olarak gösterilmektedir. Merkezdeki yeşil nokta, İyonlaştırılabilir (H101):Kolesterol:Yardımcı (DOPE):P EG'nin 33:33:33:1 molar oranını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Deneyde karışım dışı proses faktörlerinin dağılımı. Histogramlar, deneysel çalışmaların İyonlaştırılabilir Lipid Tipi, N: P oranı ve Akış Hızı arasında nasıl aralıklı olduğunu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Denemeyi çalıştırma

1. Denemeyi tasarım tablosu tarafından sağlanan sırada çalıştırın. Okumaları deneysel tabloda yerleşik sütunlara kaydedin.
2. Aynı formülasyon partisinde aynı yanıt için birden fazla tahlil yapılırsa, her partide bu sonuçlar için bir ortalama hesaplayın. Tabloya her tahlil ölçümü için bir sütun ekleyin.
   1. Ortalama elde etmek için, ilgili tüm sütunları seçin, seçili sütun başlıklarından birine sağ tıklayın ve Yeni Formül Sütunu > Ortalama > Birleştir'i seçin. Gelecekteki yanıt analizi için bu Ortalama sütununu kullanın.
      NOT: Tarife yeniden başlamadan, tekrarlanan tahlil ölçümleri sadece tahlil varyansını yakalar ve bağımsız replikalar oluşturmaz.
3. Formülasyon çökeltme veya in vivo tolere edilebilirlik sorunlarının (ciddi vücut ağırlığı kaybı veya ölüm gibi) herhangi bir oluşumunu, her sorun türü için yeni bir sütunda ikili (0/1) göstergelerle belgeleyin.

4. Deney sonuçlarının analiz edilmesi

1. Okumaları çizin ve yanıtların dağılımlarını inceleyin: Grafik Oluşturucu> yu açın ve her bir yanıtı tek tek grafikler için Y alanına sürükleyin. Tüm yanıtlar için bunu tekrarlayın.
2. Renk kodlu çoğaltma çalıştırmaları arasındaki göreli mesafeyi, eğer dahil edilmişse, inceleyin. Bu, tüm faktör uzayı boyunca faktör ayarlarındaki değişikliklerden kaynaklanan değişkenliğe kıyaslamadaki toplam (süreç ve analitik) varyasyonun anlaşılmasını sağlar (Şekil 8).
3. Ham yanıtın modellenmesi gerekip gerekmediğini veya bunun yerine bir dönüşümün kullanılması gerekip gerekmediğini belirleyin. Pozitif olmakla sınırlı ancak yukarıda sınırsız olan yanıtlar için (örneğin, potansiyel), deneysel sonuçlara hem normal bir dağılım hem de lognormal bir dağılım uymalıdır. Lognormal dağılım daha düşük bir AICc (düzeltilmiş Akaike'nin Bilgi Kriteri) ile daha iyi uyuyorsa, bu yanıtın günlük dönüşümünü alın.
   1. Dağıtımı Analiz > gidin ve Y, Sütunlar için yanıtı seçin. Ortaya çıkan dağıtım raporunda, yanıt adının yanındaki kırmızı üçgeni tıklatın ve açılır menüden Sürekli Sığdır'ı > Normale Sığdır'ı ve Sürekli Sığdır'ı > Lognormal'e Sığdır'ı seçin. Sonraki Dağıtımları Karşılaştır raporunda, hangi dağıtımın yanıta daha uygun olduğunu belirlemek için AICc değerlerini kontrol edin.
   2. Günlük dönüşümü gerçekleştirmek için, yanıt sütunu başlığını sağ tıklatın ve Yeni Formül Sütunu > Günlük > Günlük'ü seçin. Bir model oluşturulduğunda ve günlük ölçeğindeki bir tahmin sütunu kaydedildiğinde, Yeni Formül Sütunu > Günlük > Exp'i seçerek yanıtı özgün ölçeğe geri dönüştürün.
   3. 0 ile 1 arasında sınırlanan oran yanıtları için, normal ve beta dağılımının uyumunu karşılaştırın. Beta dağıtımında daha düşük bir AICc varsa, logit dönüşümü gerçekleştirin. Yanıtın Dağıtım raporunda, Sürekli Sığdır'ı > Normale Sığdır'ı ve Sürekli Sığdır'> Fit Beta'yı seçin.
      1. Logit dönüşümü için, veri tablosunda yanıt sütunu başlığını sağ tıklatın ve Logit'te Yeni Formül Sütunu > Uzmanlığı> seçin. Model oluşturma sonrasında, tahmin sütununu kaydedin. Orijinal ölçeğe geri dönmek için Yeni Formül Sütunu > Özel > Lojistik'i kullanın.
         NOT: Regresyon tabanlı SVEM analizi, yanıt dağılımındaki normallikten sapmalara karşı dayanıklıdır. Bununla birlikte, bu dönüşümler sonuçların daha kolay yorumlanmasına ve modellerin daha iyi oturmasına yol açabilir.
4. Üçlü bir arsa üzerindeki koşuları grafiklendirin. Noktaları yanıtlara (veya dönüşüm uygulanmışsa dönüştürülen yanıtlara) göre renklendirin: Grafiği Üçlü Grafik> açın. X, Plotting için sadece karışım faktörlerini seçin. Elde edilen grafiklerden herhangi birine sağ tıklayın, Satır Göstergesi'ni seçin ve ardından (dönüştürülmüş) yanıt sütununu seçin.
   NOT: Noktaları yanıtlara göre renklendirmek, karışım faktörleriyle ilişkili olarak modelden bağımsız bir görsel davranış perspektifi sağlar.
5. Alan Doldurma Tasarımı tarafından oluşturulan Model komut dosyasını silin.
6. Çalışma faktörlerinin bir fonksiyonu olarak her yanıt için bağımsız bir model oluşturun ve her yanıt için aşağıdaki adımları tekrarlayın.
   NOT: İkincil bir ikili yanıt durumunda (örneğin, formülasyon hatası veya fare ölümü), bu yanıtı da modelleyin. Hedef dağıtım ayarını Normal'den Binom'a değiştirin.
7. Tüm aday efektleri içeren "tam" bir model oluşturun. Bu model, her bir faktörün ana etkilerini, iki ve üç yönlü etkileşimleri, proses faktörlerinde ikinci dereceden ve kısmi kübik terimleri ve karışım faktörleri^23,24 için Scheffé kübik terimlerini içermelidir.
   NOT: Her yanıt için aynı aday efektler kümesini kullanın. SVEM model seçim tekniği, her yanıt için modelleri bağımsız olarak rafine edecek ve potansiyel olarak her biri için benzersiz azaltılmış modellerle sonuçlanacaktır. Şekil 9 , bu aday etkilerin bazılarını göstermektedir. Aşağıdaki alt adımlar bu işlemi ayrıntılarıyla açıklar.
   1. Modeli Analiz > Uydurur'u seçin.
   2. Engelleyici faktörlerin (örneğin, Gün) diğer çalışma faktörleriyle etkileşime girmesine izin verilmediğinden emin olun. Herhangi bir engelleme faktörünü seçin ve Ekle'yi tıklatın. Bu faktörleri sonraki alt adımların hiçbirine dahil etmeyin.
      NOT: Bloke edici faktörlerin modelde hesaba katılması önemlidir, ancak engelleyici faktörlerin diğer çalışma faktörleriyle etkileşime girmesine izin verilmemelidir. Bloke edici faktörlerin temel amacı, deneyin değişkenliğini kontrol etmeye yardımcı olmak ve deneyin duyarlılığını arttırmaktır.
   3. Tüm çalışma faktörlerini vurgulayın. Derece alanı değerini 3 olarak değiştirin (varsayılan olarak 2 olarak ayarlanır). Derece için Faktöriyel'e tıklayın.
      NOT: Bu eylem, modeldeki iki ve üç yönlü etkileşimlerin yanı sıra ana efektleri de içerir.
   4. Seçim penceresinde yalnızca karışım dışı faktörleri seçin. Makrolar > Kısmi Kübik'i tıklatın.
      NOT: Bu eylem, sürekli proses faktörleri ve bunların modeldeki diğer karışım dışı faktörlerle etkileşimi için ikinci dereceden etkiler sunar.
   5. Seçim listesinden yalnızca karışım faktörlerini seçin. Scheffe Cubic'> Makrolar'ı tıklatın. Varsayılan Müdahale Yok seçeneğini devre dışı bırakın ( Şekil 9'a bakın).
      NOT: Modele bir müdahale eklemek, Lasso yöntemlerini kullanırken önemli bir adımdır ve ileri seçim bağlamında da yararlıdır. Geleneksel varsayılan ayar No Intercept genellikle yürürlüktedir, çünkü SVEM yaklaşımı gibi değişiklikler olmadan, tüm karışım ana etkileriyle aynı anda bir kesişme takmak, normal en küçük kareler regresyon prosedürü¹² ile mümkün değildir.
   6. Yanıt sütununu belirtme: Yanıt sütununu vurgulayın ve Y'yi tıklayın.
   7. Kişilik ayarını Genelleştirilmiş Regresyon olarak değiştirin. Dağıtım'ı Normal olarak ayarlayın.
   8. Model Spesifikasyonu'nun yanındaki kırmızı üçgen menüye tıklayıp Veri Tablosuna Kaydet'i seçerek ek yanıtlarla kullanmak üzere bu model kurulumunu veri tablosuna kaydedin.
8. SVEM ileri seçim yöntemini, karışım faktörü ana etkilerinin zorunlu olarak dahil edilmesine gerek kalmadan indirgenmiş modele uyacak şekilde uygulayın ve tahmin formülü sütununu veri tablosunda saklayın.
   1. Modele Sığdır iletişim kutusundan, Çalıştır'ı tıklatın.
   2. Tahmin Yöntemi için SVEM İleri Seçimi'ni seçin.
   3. Gelişmiş Denetimler > Kuvvet Terimleri menülerini genişletin ve karışımın ana efektleriyle ilişkili kutuların seçimini kaldırın. Yalnızca Durdurma terimi kutusu işaretli kalmalıdır. Şekil 10, ana efektlerin zorlandığı varsayılan kurulumu görüntüler. Bu adımda, modelin ileri seçim yordamına bağlı olarak bu efektleri dahil etmesine veya hariç tutmasına izin vermek için bu kutuların işaretlerinin kaldırılması gerekir.
   4. SVEM İleri Seçim prosedürünü çalıştırmak için Git'i tıklatın.
9. Makul bir tahmine dayalı yeteneği doğrulamak için SVEM modelinden tahmin edilen yanıtlara göre gerçek yanıtları grafiklendirin. (Şekil 11).  SVEM İleri Seçim'in yanındaki kırmızı üçgene tıklayın ve Tanılama Grafikleri'ni > Tahmin Edilene Göre Gerçek Grafiği'ni seçin.
10. SVEM İleri Seçim'in yanındaki kırmızı üçgeni tıklatın ve veri tablosunda tahmin formülünü içeren yeni bir sütun oluşturmak için Sütunları Kaydet > Tahmin Formülünü Kaydet'i seçin.
11. İsteğe bağlı: Sonraki adımları uyguladıktan sonra farklı bir optimal tarifin önerilip önerilmediğini belirlemek için Tahmin Yöntemi olarak SVEM Lasso'yu kullanarak yukarıdaki adımları tekrarlayın. Öyleyse, hangisinin uygulama^12'de en iyi performansı gösterdiğini görmek için onay çalıştırılırken (Bölüm 5'te ele alınmıştır) her iki tarifi de çalıştırın.
12. Her yanıt için model oluşturma adımlarını yineleyin.
13. Tüm yanıtların tahmin sütunları veri tablosuna kaydedildikten sonra, Profil Oluşturucu platformunu kullanarak tüm tahmin edilen yanıt sütunları için yanıt izlemelerinin grafiğini çizin: Grafik > Profil Oluşturucu'yu seçin ve Y, Tahmin Formülü için önceki adımda oluşturulan tüm tahmin sütunlarını seçin ve Tamam'a tıklayın (Şekil 12).
14. Aday optimal formülasyon(lar)ı tanımlayın.
    1. Her yanıt için "arzu edilebilirlik işlevini" tanımlayın ve yanıtın en üst düzeye çıkarılması, en aza indirilmesi veya bir hedefle eşleştirilmesi gerekip gerekmediğini belirtin. Herhangi bir birincil yanıtı 1,0 önem ağırlığını kullanacak şekilde ve ikincil yanıtları 0,2 önem ağırlığı kullanacak şekilde ayarlayın. Tahmin Profili Oluşturucu kırmızı üçgen menüsünden, Optimizasyon ve Arzu Edilebilirlik İşlevleri'>, ardından Optimizasyon ve Arzu Edilebilirlik'> Arzu Edilebilirlikleri Ayarla'yı seçin. Ayarları sonraki pencerelere girin.
       NOT: Önemli ağırlıklar göreceli ve özneldir, bu nedenle kombine optimumun bu ağırlıklardaki makul bir aralıktaki değişikliklere duyarlılığını kontrol etmeye değerdir (örneğin, eşit ağırlıktan 1:5 ağırlığa kadar).
    2. İstenebilirlik işlevini en üst düzeye çıkaran en uygun faktör ayarlarını bulması için Profil Oluşturucu'ya komut verin (Şekil 12): Profil Oluşturucu'dan Optimizasyon ve Arzu Edilebilirlik'i > İstenebilirliği En Üst Düzeye Çıkar'ı seçin.
       NOT: En uygun adaylardaki yanıtların tahmin edilen değerleri, potens gibi sağa doğru çarpık yanıtların değerini abartabilir; Bununla birlikte, doğrulama çalışmaları bu aday formülasyonların daha doğru gözlemlerini sağlayacaktır. Temel amaç, en uygun formülasyonu (en uygun tarifin ayarları) bulmaktır.
    3. En uygun faktör ayarlarını kaydedin ve her yanıt için kullanılan önemli ağırlıklandırmaları not edin: Tahmin Profili Oluşturucu menüsünden, Faktör Ayarları > Ayarları Hatırla'yı seçin.
15. İsteğe bağlı: İyonlaştırılabilir lipit tipi gibi kategorik faktörler için, her faktör seviyesi için koşullu olarak en uygun formülasyonları bulun.
    1. Önce profil oluşturucuda faktörün istenen düzeyini ayarlayın, ardından Ctrl tuşunu basılı tutun ve bu faktörün grafiğinin içine sol tıklayın ve Faktörleri Kilitle Ayarı'nı seçin. Bu faktör geçerli ayarında kilitliyken koşullu optimum'u bulmak için Optimizasyon ve İstenebilirlik > İstenebilirliği En Üst Düzeye Çıkar'ı seçin.
    2. Devam etmeden önce, faktör ayarlarını kilitlemek için kullanılan aynı menüyü kullanarak faktör ayarlarının kilidini açın.
16. Yanıtların önem ağırlıklarını ayarladıktan sonra (Optimizasyon ve Arzu Edilebilirlik > İstenebilirlikleri Ayarla'yı kullanarak), belki de yalnızca birincil yanıtları optimize ettikten veya ikincil yanıtlardan bazılarını az ya da çok önem ağırlığına sahip olacak şekilde ayarladıktan sonra optimizasyon işlemini tekrarlayın (Şekil 13).
17. Yeni optimum adayı kaydedin (Tahmin Profili Oluşturucu menüsünden, Faktör Ayarları > Ayarları Hatırla'yı seçin.)
18. Faktör uzayının en uygun bölgelerinin grafik özetlerini oluşturun: İzin verilen faktör alanı içinde rastgele oluşturulan faktör ayarlarıyla doldurulmuş 50.000 satırlık bir veri tablosunun yanı sıra, yanıtların her biri için indirgenmiş modelden karşılık gelen tahmin edilen değerler ve ortak istenebilirlik işlevi oluşturun.
    1. Profil Oluşturucu'da, Çıktı Rasgele Tablosu'nu seçin. Simüle edilecek kaç çalıştırma? değerini 50.000 olarak ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın.
       NOT: Bu, 50.000 formülasyonun her birindeki yanıtların tahmin edilen değerlerini içeren yeni bir tablo oluşturur. İstenebilirlik sütunu, Çıktı Rasgele Tablosu seçeneği belirlendiğinde yerinde olan yanıtların önem ağırlıklarına bağlıdır.
    2. Yeni oluşturulan tabloda, Arzu Edilebilirlik sütununun yüzdelik dilimini hesaplayan yeni bir sütun ekleyin. Bu yüzdelik dilim sütununu, ham Arzu Edilebilirlik sütunu yerine üçlü grafiklerde kullanın. Arzu edilebilirlik sütun başlığına sağ tıklayın ve yeni bir Kümülatif Olasılık[İstenebilirlik] sütunu oluşturmak için Yeni Formül Sütunu > Dağıtımsal > Kümülatif Olasılık'ı seçin.
    3. Aşağıdaki adımlarda açıklanan grafikleri oluşturun. Her yanıtın ve Kümülatif Olasılık[İstenebilirlik] sütununun tahminlerini görüntülemek için grafiklerin renk düzenini art arda değiştirin.
    4. Dört lipit faktörü için üçlü grafikler oluşturun. Tabloda, Grafik > Üçlü Grafik'e gidin, X, Çizim için karışım faktörlerini seçin ve Tamam'ı tıklatın. Elde edilen grafiklerden birine sağ tıklayın, Satır Göstergesi'ni seçin ve ardından tahmin edilen yanıt sütununu seçin. Renkler açılır menüsünü Jet olarak değiştirin.
       NOT: Bu, lipit faktörlerine göre en iyi ve en kötü performans gösteren bölgeleri gösterir. Şekil 14 , üçlü grafik eksenlerinde gösterilmeyen herhangi bir faktörün ortalamasını alırken, Potansiyeli en üst düzeye çıkarmayı (önem = 1) ve Boyutu en aza indirmeyi (önem = 0.2) göz önünde bulundururken eklem arzu edilebilirliğinin yüzdeliklerini göstermektedir. Şekil 15 , ham tahmin edilen boyutu göstermektedir. Bu grafikleri, Yerel Veri Filtresi ile her iyonize edilebilir lipit türü için ayrı bir üçlü grafik kümesi oluşturmak gibi diğer faktörlere göre koşullu olarak ayırmak da mantıklıdır ( Üçlü Grafik'in yanındaki kırmızı üçgen menüsünden edinilebilir).
    5. Benzer şekilde, 50.000 renk kodlu noktayı (benzersiz formülasyonları temsil eden) karışım dışı işlem faktörlerine karşı ayrı ayrı veya birlikte çizmek ve yanıt(lar) ile faktör(ler) arasındaki ilişkileri aramak için Graph > Graph Builder'ı kullanın. En yüksek arzu edilebilirliği sağlayan faktör ayarlarını arayın. Grafiklerdeki farklı faktör kombinasyonlarını keşfedin.
       NOT: Grafikleri renklendirirken, Kümülatif Olasılık[Arzu Edilebilirlik] kullanın, ancak dikey eksende arzu edilebilirliği proses faktörlerine karşı çizerken ham İstenebilirlik sütununu kullanın. İstenebilirlik sütunu, çok değişkenli keşif için diğer iki işlem faktörüyle birlikte Grafik > Dağılım Grafiği 3B görselleştirmesinin bir eksenine de yerleştirilebilir. Şekil 16 , üç iyonize edilebilir lipit tipinin her biri ile oluşturulabilecek tüm formülasyonların ortak arzu edilebilirliğini göstermektedir. En çok arzu edilen formülasyonlar H102'yi kullanır ve H101 potansiyel olarak rekabetçi alternatifler sunar.
    6. Profil Oluşturucu'yu ve hatırlanan ayarlarını veri tablosuna geri kaydedin. Profil Oluşturucu'nun yanındaki kırmızı üçgene tıklayın ve Komut Dosyasını Veri Tablosuna > Kaydet...'i seçin.

Şekil 8: Deneyden gözlemlenen potens okumaları. Noktalar, 23 koşudan gözlemlenen potens değerlerini gösterir; Çoğaltılan karşılaştırma testleri yeşil renkle gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Analizi başlatmak için yazılım iletişim kutusu. Aday efektler, hedef potens yanıtı ile birlikte girildi ve Müdahale Yok seçeneğinin işareti kaldırıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10. SVEM seçeneklerini belirtmek için ek iletişim kutusu. Varsayılan olarak, lipit ana etkileri modele zorlanır. Bir durdurma eklendiğinden, etkileri zorlamamak için bu kutuların işaretini kaldırmanızı öneririz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11: Tahmin edilen arsa ile gerçek. Bu şekil, SVEM modeli tarafından her formülasyon için öngörülen değere karşı gözlemlenen Potens'i çizer. Korelasyonun bu örnekte olduğu kadar güçlü olması gerekmez, ancak beklenti en azından ılımlı bir korelasyon görmek ve aykırı değerleri kontrol etmektir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 12: Tahmin profil oluşturucusu. En üstteki iki grafik satırı, tahmin edilen yanıt fonksiyonunun dilimlerini optimum formülasyonda (SVEM yaklaşımı tarafından tanımlandığı gibi) gösterir. Grafiklerin alt satırı, potansiyelin en üst düzeye çıkarılması ve Boyutun en aza indirilmesi gerektiğini gösteren son grafik sütununun bir fonksiyonu olan formülasyonun ağırlıklı "arzu edilebilirliğini" gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 13: SVEM-İleri Seçimden üç optimal formülasyon adayı. Yanıtların göreceli önem ağırlığının değiştirilmesi, farklı optimal formülasyonlara yol açabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 14: İstenebilirlik yüzdelik dilimi için üçlü grafikler. Grafik, arzu edilebilirliğin yüzdelik dilimine göre kodlanmış 50.000 formülasyonun rengini göstermektedir, burada arzu edilebilirlik, Potens'i en üst düzeye çıkarmak için 1.0 ve boyutu en aza indirmek için 0.2 önem ağırlığı ile ayarlanmıştır, bu grafikler, formülasyonların optimal bölgesinin daha düşük iyonize edilebilir lipit yüzdelerinden ve daha yüksek PEG yüzdelerinden oluştuğunu göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 15: Tahmin edilen Boyut için üçlü grafik. Grafik, 50.000 formülasyonun her biri için SVEM modelinden boyut tahminlerini göstermektedir. Boyut, daha yüksek yardımcı lipit yüzdeleri ile en aza indirilir ve daha düşük yardımcı yüzdeleri ile en üst düzeye çıkarılır. Diğer faktörler, çizilen 50.000 formülasyon arasında serbestçe değiştiğinden, bu, bu ilişkinin diğer faktörlerin (PEG, akış hızı, vb.) aralıkları boyunca geçerli olduğu anlamına gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 16: Üç farklı iyonize edilebilir lipit tipini içeren formülasyonların istenebilirliği için keman grafikleri. 50.000 noktanın her biri, izin verilen faktör alanı boyunca benzersiz bir formülasyonu temsil eder. Bu dağılımların zirveleri, tahmin profil oluşturucu ile analitik olarak hesaplanan maksimum arzu edilebilirlik değerleridir. H102 en büyük pik noktasına sahiptir ve bu nedenle optimum formülasyonu üretir. Bu çıktıyı üreten modeli oluşturmaya yönelik SVEM yaklaşımı, istatistiksel olarak önemsiz faktörleri otomatik olarak filtreler: Bu grafiğin amacı, faktör düzeyleri arasında pratik önemi göz önünde bulundurmaktır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

5. Onay işlemleri

1. Daha önce belirlenen en uygun adayları listeleyen bir tablo hazırlayın (Şekil 17).
   NOT: Şekil 17'deki Gerçek Potens ve Gerçek Boyut değerleri, simüle edilmiş üretim fonksiyonları kullanılarak doldurulur: pratikte, bunlar formüle edilerek ve daha sonra bu tariflerin performansı ölçülerek elde edilecektir.
   1. Kıyaslama kontrolünü, formüle edilecek ve ölçülecek aday çalıştırma kümesine dahil edin.
   2. Deneyden elde edilen formülasyonlardan herhangi birinin, belki de kıyaslamadan daha iyi performans göstererek istenen sonuçları verdiği tespit edilirse, aday tabloya eklemek için en iyisini seçin ve yeni formülasyonlarla birlikte yeniden test edin.
      NOT: İstenen çalıştırmaları aday tabloya el ile ekleyin veya bu çalıştırmalar önceki denemedense Profil Oluşturucu penceresinin Hatırlanan Ayarları'nı kullanın. Çalıştırmanın satır numarasını belirleyin, Tahmin Profili Oluşturucu > Faktör Ayarları'na gidin > Satırdaki Verilere Ayarla'ya gidin ve satır numarasını girin. Ardından, Ayarları Hatırla > Faktör Ayarları > Tahmin Profili Oluşturucu'yu seçin ve uygun şekilde etiketleyin (ör. "kıyaslama" veya "önceki denemeden en iyi çalıştırma").
   3. Profil Oluşturucu'da Hatırlanan Ayarlar tablosuna sağ tıklayın ve Veri Tablosuna Dönüştür'ü seçin.
      NOT: Etüdün önceliğine ve bütçesine bağlı olarak, özellikle kıyaslamayı değiştiriyorsanız, her onay çalıştırması için çoğaltmalar çalıştırmayı düşünün. Sıralama için ortalama sonucu kullanarak her formülasyonu iki kez oluşturun ve analiz edin. İki çoğaltma boyunca geniş bir yanıt aralığına sahip adaylara dikkat edin, çünkü bu yüksek işlem varyansını gösterebilir.
   4. Bütçe kısıtlamaları nedeniyle gerekirse, deneysel bütçeyle eşleşmek veya gereksiz adayları ortadan kaldırmak için belirlenen adaylar arasından seçim yapın.
2. Onay çalıştırmalarını gerçekleştirin. Formülasyonları oluşturun ve okumaları toplayın.
3. Orijinal denemenin sonuçları ile karşılaştırma testleri veya diğer tekrarlanan tarifler için onay grubunun sonuçları arasında tutarlılık olup olmadığını kontrol edin. Büyük ve beklenmeyen bir kayma varsa, vardiyaya neyin katkıda bulunmuş olabileceğini ve onay grubundaki tüm çalıştırmaların etkilenmesinin mümkün olup olmadığını düşünün.
4. Aday optimal formülasyonların performansını karşılaştırın. Herhangi bir yeni adayın kıyaslamadan daha iyi performans gösterip göstermediğini araştırın.
5. İsteğe bağlı: Onay çalıştırmalarının sonucunu deneysel tabloya ekleyin ve Bölüm 4'teki analizi yeniden çalıştırın.
   NOT: İş akışının bir sonraki adımı, istenirse bu çalıştırmalarla birlikte bir takip etüdü oluşturmak için talimatlar sağlar.

Şekil 17: Onay çalışmaları sırasında çalıştırılacak on optimal adayın tablosu. Gerçek Potens ve Gerçek Boyut, simülasyon üreten fonksiyonlardan doldurulmuştur (herhangi bir ek proses veya analitik varyasyon olmadan). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. İsteğe bağlı: Onay çalıştırmalarıyla eşzamanlı olarak çalıştırılacak bir takip etüdü tasarlama

1. Aşağıdaki kriterleri göz önünde bulundurarak bir takip çalışmasına olan ihtiyacı değerlendirin:
   1. En uygun formülasyonun faktör sınırlarından biri boyunca uzanıp uzanmadığını ve faktör aralıklarından en az birini genişletmek için ikinci bir deneyin istenip istenmediğini belirleyin.
   2. İlk denemenin nispeten küçük bir çalıştırma boyutu mu yoksa nispeten büyük faktör aralıkları mı kullandığını ve ek çalıştırmalar ve güncelleştirilmiş analizlerle tanımlanan en uygun bölgede "yakınlaştırma" gerekip gerekmediğini değerlendirin.
   3. Ek bir faktörün eklenip getirilmediğini kontrol edin. Bu, ek bir iyonize edilebilir lipit gibi kategorik bir faktörün seviyesi veya ilk çalışmada sabit kalan bir faktör, örneğin tampon konsantrasyonu olabilir.
   4. Yukarıdaki koşullardan hiçbiri karşılanmazsa, Adım 7'ye geçin.
2. Onay çalıştırmalarıyla eşzamanlı olarak gerçekleştirilecek ek deneysel çalıştırmalara hazırlanın.
   1. İlk etütten itibaren bölge ile kısmi bir örtüşme sağlayan faktör sınırlarını tanımlayın. Çakışma yoksa, yeni bir çalışma tasarlanmalıdır.
   2. Boşluk dolduran bir tasarıma sahip yeni deneysel çalışmaları geliştirin. DOE > Özel Amaçlı > Alanı Doldurma Tasarımı'nı seçin.
      NOT: İleri düzey kullanıcılar için, DOE > Özel Tasarım aracılığıyla D-optimal bir tasarım düşünün.
   3. Alan doldurma çalıştırmaları oluşturulduktan sonra, orijinal denemeden yeni faktör alanı içinde yer alan iki veya üç çalıştırmayı el ile birleştirin. Satır eklemek ve ardından satır sırasını rasgele hale getirmek için Bölüm 2'de açıklanan adımları kullanarak bu çalıştırmaları deneysel tablo içinde rasgele olarak dağıtın.
      NOT: Bunlar, bloklar arasındaki yanıt araçlarındaki herhangi bir kaymayı tahmin etmek için kullanılacaktır.
   4. Onay çalıştırmalarını ve yeni boşluk doldurma çalıştırmalarını tek bir tabloda birleştirin ve çalıştırma sırasını rastgele sıralayın. Bölüm 2>de açıklandığı gibi, çalışma sırasını rasgele hale getirmek için Tablolar'ı Birleştir'i kullanın ve ardından yeni bir rasgele sütun oluşturup sıralayın.
3. Yeni tarifleri formüle edin ve sonuçları toplayın.
4. Yeni deneme sürümü çalıştırmalarını ve sonuçlarını orijinal deneme veri tablosuyla birleştirerek her sonucun kaynağını belirtmek için bir deneme kimliği sütunu ekleyin. Tabloları Birleştir > kullanın ve Kaynak Sütun Oluştur seçeneğini belirleyin.
5. Her faktörün sütun özelliklerinin her iki etüt üzerinde birleştirilmiş aralığı görüntülediğini doğrulayın: her faktör için sütun başlığına sağ tıklayın ve varsa Kodlama ve Karışım özellik aralıklarını inceleyin.
6. Yeni deneyin sonuçlarının analizine başlayın.
   1. Engelleme faktörü olarak hizmet etmesi için experiment-ID sütununu modele terim olarak ekleyin. Bu terimin çalışma faktörleriyle etkileşime girmediğinden emin olun. Bölüm 4'teki tabloya kaydedilen Modele Sığdır iletişim kutusu komut dosyasını çalıştırın, deneme kimliği sütununu seçin ve aday efektler listesine eklemek için Ekle'yi tıklatın.
   2. Yeni denemeden ve ilk etüdün sonuçlarını birlikte analiz etmek için birleştirilmiş veri tablosunda bu Modele Sığdır iletişim kutusunu çalıştırın. Güncellenmiş optimum formülasyon adayları ve grafik özetleri oluşturmak için önceki talimatlara uyun.
   3. Doğrulama için, ilk denemenin sonuçlarını hariç tutarak yeni denemenin sonuçlarını bağımsız olarak analiz edin. Diğer bir deyişle, yeni deney tablosunda Bölüm 4'te açıklanan adımları gerçekleştirin.
   4. Bu modeller tarafından tanımlanan optimal formülasyonların, ortak analiz tarafından tanınanlarla yakından uyumlu olduğundan emin olun.
   5. Yeni deneysel sonuçların hem ortak hem de bireysel analizlerinin benzer tepki yüzeyi davranışları sergilediğini doğrulamak için grafik özetleri gözden geçirin (yani yanıtlar ve faktörler arasında benzer bir ilişki olduğu anlamına gelir).
   6. Yeni sonuçların birleşik ve bireysel analizlerini, tutarlılık için ilk deneyle karşılaştırın. Karşılaştırma için benzer grafik yapıları kullanın ve farklılıklar için belirlenen en uygun tarifleri inceleyin.

7. Çalışmanın nihai bilimsel sonuçlarının belgelenmesi

1. Karşılaştırma kontrolü, etüt nedeniyle yeni tanımlanan bir tarife dönüşürse, yeni ayarı günlüğe kaydedin ve kaynağını kaydeden tasarım ve analiz dosyalarını belirtin.
2. Tüm deneysel tabloları ve analiz özetlerini, tercihen tarih damgalı dosya adlarıyla, ileride başvurmak üzere saklayın.

Representative Results

Bu yaklaşım, geniş olarak sınıflandırılmış lipit tiplerinin her ikisinde de doğrulanmıştır: MC3 benzeri klasik lipitler ve genellikle kombinatoryal kimyadan türetilen lipitoidler (örneğin, C12-200). Bir Seferde Bir Faktör (OFAT) yöntemi kullanılarak geliştirilen bir karşılaştırma LNP formülasyonu ile karşılaştırıldığında, iş akışımız aracılığıyla oluşturulan aday formülasyonlar, Şekil 18'deki fare karaciğer lusiferaz okumalarında gösterildiği gibi, logaritmik bir ölçekte sıklıkla 4 ila 5 kat potens artışı göstermektedir. Tablo 1 , iki optimizasyon aşaması boyunca (bir ilk çalışma ve sonraki bir takip çalışması) kıyaslama kontrol performansı üzerinde gözlemlenen fare karaciğeri lusiferaz ekspresyonundaki karşılık gelen gelişmeleri göstermektedir. İlk aşamada, diğer faktörleri sabit tutarken lipit oranlarını optimize etmeye odaklanıldı. Takip çalışmasında ek bir yardımcı lipid tipi tanıtıldı ve hem lipid oranı kompozisyonu hem de yardımcı lipid tipi göz önünde bulundurularak optimizasyon yapıldı. Sonuç olarak, yeni tanıtılan yardımcı lipit tipi, ilişkili optimize edilmiş lipit bileşimi ile kullanılmak üzere seçildi. Potensteki önemli artış, bu optimize edilmiş bileşimlerin üstün endozomal kaçış yetenekleri sergileyebileceğini düşündürmektedir²⁵.

Bu prosedür tarafından üretilen en uygun adayın beklenen kalitesini göstermek için simülasyonlar kullanılabilir. Protokolde kullanılan örnek deney çerçevesinde, simülasyonu farklı çalışma boyutları için birçok kez tekrarlayabilir ve sonuçları simüle edilmiş süreç üretme fonksiyonuna göre değerlendirebiliriz. Bu amaçla bir JMP komut dosyası Ek Dosya 4'te sağlanmıştır. Özellikle, bir boşluk doldurma tasarımı oluşturuldu ve yanıt sütunları jeneratör fonksiyonlarımızdan gelen değerlerin yanı sıra analitik ve proses varyasyonunu temsil eden gürültü ile dolduruldu. Bu simüle edilmiş yanıtları, karşılık gelen aday optimal reçeteyi üretmek için farklı analiz teknikleriyle (SVEM İleri Seçim dahil) uyguluyoruz. Her analiz yönteminden adaylar daha sonra üretim fonksiyonlarından gerçek optimumun değeri ile karşılaştırılır. Şekil 19, yatay eksende verilen boyuttaki boşluk doldurma tasarımlarını kullanan üç analiz yönteminin her biri tarafından elde edilen maksimum teorik yanıtın ortalama yüzdesini göstermektedir. Tüm aday etkileri içeren ve bu etkilerin istatistiksel anlamlılığına dayanarak modeli azaltmayan tam model, en kötüsünü gerçekleştirir. Geleneksel olarak karışım-süreç deneyleri için regresyon modellerinin uygulanmasına giden ek çalışmaların çoğu, bu tam model^9'a uymak için gerekli olan modifikasyonları (kesişmeyi kaldırmak, karışımın ana etkilerini zorlamak, saf ikinci dereceden karışım etkilerinin kullanılmasını engellemek, vb.) içerir ve bu perspektiften bakıldığında, bu prosedürler gereksizdir¹². Ayrıca, tasarım boyutu modeldeki efekt sayısına ulaşana kadar bu model sığdırılamaz. Daha küçük deney boyutlarında, her sabit deney boyutu için en uygun aday formülasyonun ortalama performansına göre tam modelden daha iyi performans gösteren geleneksel ileri seçim yöntemini uygulayabiliriz. Benzer şekilde, SVEM'in bu ileri seçim yaklaşımında yaptığı değişiklik, optimum adayların performansını daha da artırmaktadır. Bu grafik, 24 çalıştırmalı bir alan doldurma denemesini analiz etmek için SVEM-İleri Seçim^12,13'ün kullanılmasının^, geleneksel bir ileri seçim (minimum AICc'yi hedefleme) modeliyle analiz edildiğinde tipik olarak 50 çalıştırma gerektiren aynı ortalama kaliteye ulaştığını ortaya koymaktadır. Gerçek performans süreçten prosese değişmekle birlikte, bu simülasyon - SVEM^{12,13,16,17,26'da} yayınlanan sonuçlarla birlikte - formülasyon optimizasyonu için bu modelleme prosedürünün potansiyelini göstermektedir.

Şekil 18: İki deney turunu takiben karaciğer lusiferaz ekspresyonunda iyileşme. Yuvarlak 0, kıyaslama formülasyonu için karaciğer lusiferaz okumasını gösterir; 1. Tur, LNP bileşeni lipid molar oranlarını optimize eden ilk deneyden sonra karaciğer lusiferaz okumasını gösterir; 2. Tur, ikinci deneyden sonra karaciğer lusiferaz okumasını gösterir ve bu da kurucu molar oranları daha da optimize ederken, aynı zamanda ek bir yardımcı lipit tipini de göz önünde bulundurur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 19: Deneysel boyut ve istatistiksel modelin bir fonksiyonu olarak optimal formülasyonun kalitesi. Dikey eksen, teorik maksimum arzu edilebilirlik yüzdesini temsil eder ve yatay eksen, boşluk doldurma tasarımının boyutunu temsil eder. Her nokta 150'den fazla simülasyonun ortalamasını gösterir. Mavi çizgi (üçgenler) tam modeli temsil eder (istatistiksel olarak önemsiz etkilerin herhangi bir şekilde ortadan kaldırılması olmadan), amber (daireler) çizgi geleneksel AICc tabanlı ileri seçim modelini (bir kesişme ile ve karışım ana etkilerini zorlamadan) ve yeşil çizgi (baş aşağı üçgenler) SVEM tabanlı ileri seçim modelini temsil eder (bir kesişme ile ve karışım ana etkilerini zorlamadan). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Yuvarlak	Partikül Kimliği	Karaciğerde Luciferaz ekspresyonu (foton/sn)
0	Kontrol Kıyaslaması	8.E+06
1	Lipid Oranları üzerinden optimize edilmiştir	2.E+09
2	Lipid Oranları ve Yardımcı Lipid Tipi üzerinde optimize edilmiştir	8.E+10

Tablo 1: Deney Tasarımı (DOE) optimizasyonu yoluyla lusiferaz ekspresyonunda sistematik iyileştirme. Bu tablo, lusiferaz ekspresyonundaki önemli gelişmeyi, foton / saniye ölçeğinde, ilk kıyaslamadan son "optimal adaya" kadar 10.000 kata kadar iyileşme ile göstermektedir.

Ek Dosya 1: 04APR2023 Özet.docx - Bu belge, amacı, değerlendirilen yanıtlar, dikkate alınan faktörler ve yürütülen toplam çalışma sayısı dahil olmak üzere çalışmanın bir kaydını sağlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: 23_run_simulated_experiment.jmp - Simüle edilmiş denemeyi ve sonuçlarını içeren bir JMP dosyası. Bu dosya ayrıca JMP 17 Pro ile uyumlu ekli analiz komut dosyalarını da içerir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: 23_run_simulated_experiment.xlsx - Sanal denemeyi ve sonuçlarını içeren, JMP'ye erişimi olmayabilecek okuyucular için uygun bir Excel dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: karışım simülasyonu 20DEC22.jsl - Bu, LNP formülasyon deneylerini simüle etmek ve farklı analiz yöntemlerinin performansını değerlendirmek için kullanılan bir JMP 17 Pro komut dosyasıdır. Komut dosyası, bu iş akışında kullanılan anahtar analiz yöntemi olan SVEM-İleri Seçim (müdahale yok) yaklaşımını kullanır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Karışım-süreç deneylerinin tasarımı ve analizi için modern yazılım, bilim adamlarının lipit nanopartikül formülasyonlarını verimsiz OFAT deneylerinden kaçınan yapılandırılmış bir iş akışında geliştirmelerini mümkün kılar. Son zamanlarda geliştirilen SVEM modelleme yaklaşımı, daha önce bilim insanlarının dikkatini yabancı istatistiksel düşüncelerle dağıtmış olabilecek gizemli regresyon modifikasyonlarının ve model azaltma stratejilerinin çoğunu ortadan kaldırmaktadır. Sonuçlar toplandıktan sonra, SVEM analiz çerçevesi hem uygulanması daha kolay hem de geleneksel modelleme yaklaşımlarından daha iyi modeller üretme eğiliminde olan bir yaklaşım sunar¹³. Ayrıca, her bir yanıt için tahmin formüllerine dayanan grafiksel analizler, bilim adamları tarafından kolayca yorumlanabilir ve yanıtın bireysel faktörler ve küçük faktör grupları üzerindeki marjinal davranışının, bir regresyon modelinden yüksek oranda korelasyonlu parametre tahminlerinin yorumlanmasını gerektirmeden net bir özetini verir. Bu, bilim adamlarının, SVEM istatistiksel olarak önemsiz etkileri otomatik olarak ortadan kaldırdıktan sonra çalışma faktörleri arasında pratik önemi değerlendirmeye odaklanmalarını sağlar.

İş akışı, optimizasyon için lipit bileşimini ve N/P oranı, akış hızı ve karıştırma oranı gibi formülasyon parametrelerini sistematik olarak değiştirmek ve en iyi yardımcı lipit tiplerini, iyonize edilebilir lipit tiplerini ve tampon tiplerini seçmek için pratikte kullanılmıştır. Bu örneklerdeki hedefler genellikle in vivo veya in vitro potensi en üst düzeye çıkarmayı ve karaciğer hücreleri gibi ilgili in vivo hedefler için mRNA veya DNA gibi değişen yükleri kapsüllemeyi veya bazen in vitro uygulamalar durumunda birden fazla hücre tipinde kapsüllemeyi içerir. Belirli uygulamalar için, in vivo potensi incelerken boyut, PDI, zeta potansiyeli ve yüzde kapsülleme gibi biyofiziksel özellikleri dengelememiz gerekebilir. Ek olarak, amaç güçlü, ancak iyi tolere edilen bir formülasyon bulmaktır ve bu nedenle vücut ağırlığındaki değişiklik, sitokin yanıtı veya AST / ALT gibi karaciğer enzimlerinin uyarılması gibi yanıtları analize dahil edebiliriz. Desenler çok sayıda LNP deneyinden ortaya çıkmıştır. Özellikle, iyonize edilebilir lipitin molar oranındaki ve N / P oranındaki değişiklikler, RNA kapsüllemesini önemli ölçüde etkilemektedir. Ayrıca, PEG molar oranındaki değişikliklerin, boyut ve PDI üzerindeki etkilerle gösterildiği gibi, parçacık stabilitesini etkilediği görülmektedir. Genel olarak, LNP çekirdeğindeki aşırı miktarda PEG, farelerde potens üzerinde zararlı bir etkiye sahip olma eğilimindedir.

Performans iyileştirmeleri özellikle birden fazla yanıt hedeflendiğinde fark edilir: kıyaslama birincil yanıta (örneğin, potansiyel) göre zaten iyi performans gösterse bile, eklem optimizasyonu tipik olarak birincil yanıta göre davranışı korur veya geliştirirken, aynı zamanda diğer yanıtlara göre davranışı iyileştirir (PDI, boyut veya vücut ağırlığı kaybını en aza indirir). Bu iyileştirmelerin gerçekliğini, kıyaslama formülasyonunu (muhtemelen bir kopya ile) ve yeni aday formülasyonları hazırladığımız ve doğrudan karşılaştırdığımız doğrulama çalışmalarıyla doğrularız.

Bu iş akışının tasarım aşamasının birkaç kritik adımı vardır. İlk olarak, faktörlerin ve aralıklarının boşluk doldurma tasarım platformuna doğru girildiğinden emin olun. İkincisi, deneyi başlatmadan önce ortaya çıkan her formülasyonun fizibilitesini doğrulamak için grafikleri ve konu bilgilerini kullanın. Son olarak, denemeyi tasarım tablosu tarafından belirtilen rastgele sırayı izleyerek yürütün. Bu sıraya bağlı kalmak, formülasyon üretiminin sırası veya ortam sıcaklığı gibi ölçülmemiş eşdeğişkenlerin incelenen faktörleri karıştırmasını önlemeye yardımcı olur. Alan doldurma tasarımlarının oluşturulması daha kolaydır - optimum karışım prosesi tasarımlarından daha az kullanıcı hatası potansiyeli vardır, bu da kurulum sırasında deneyimsiz kullanıcıları hayal kırıklığına uğratabilecek ve tasarlanmış deneyleri kullanmalarını engelleyebilecek ekstra kararlar gerektirir. Bununla birlikte, bu protokol üzerinde çalıştıktan sonra, bilim adamları, Goos and Jones (2011) ^27'nin 6. Bölümünde açıklandığı gibi, optimal tasarımların protokoldeki alan doldurma tasarımlarının yerini nasıl alabileceği konusunda ek okumalardan yararlanabilirler. Özellikle karışım sınırları boyunca arızalar hakkında daha az endişenin olduğu optimal bir bölgeye "yakınlaştıran" takip çalışmaları için D-optimal tasarımlar, alan doldurma tasarımlarından daha verimli olabilir.

Benzer şekilde, bu iş akışının analiz aşamasının birkaç kritik adımı vardır. İlk olarak, modelin, faktörlerin yalnızca ana (birinci dereceden) etkileri yerine, etkileşimler de dahil olmak üzere uygun bir aday efektler kümesi belirttiğinden emin olun. İkincisi, modelleme çerçevesi olarak SVEM İleri Seçimini kullanın. Üçüncü olarak, varsayılan No Intercept seçeneğini devre dışı bırakın ve karışımın ana etkilerini zorlamaktan kaçının. Son olarak, optimizasyonu başlatmadan önce yanıtlar için istenebilirlik işlevlerini doğru şekilde ayarlayın. SVEM'e erişimi olmayan kullanıcılar için en iyi yaklaşım, regresyon problemi¹² için geleneksel ileri seçimi (minimum AICc'yi hedeflemek) kullanmaktır. Protokol, SVEM Lasso'yu kullanmanın da mümkün olduğundan bahseder: ortalama olarak, bu yaklaşım SVEM İleri Seçimine benzer sonuçlar verir, ancak belirli veri kümeleri için iki yaklaşım, doğrulama çalışmaları¹² ile karşılaştırılabilecek biraz farklı optimal formülasyonlar üretebilir. Bununla birlikte, SVEM Lasso, kullanıcı varsayılan No Intercept seçeneği^12'yi devre dışı bırakmayı unutmanın kolay hatasını yaparsa, daha düşük modelleme sonuçları verecektir: bu nedenle, SVEM İleri Seçimi'ni varsayılan yöntem olarak kullandık, çünkü bu seçeneğe daha sağlamdır.

Bu yöntemin birincil sınırlaması, tasarım ve analiz için bir istatistikçinin yardımından yararlanacak daha karmaşık olan ara sıra çalışmaların olacağıdır. Çalışma bütçesinin normalden daha sınırlı olduğu (minimum sezgisel yöntemin altında), yanıtların ikili olduğu, çok sayıda kategorik faktörün veya tek bir kategorik faktörün seviyelerinin bulunduğu, bir araştırma hedefinin reçeteden bir veya daha fazla karışım faktörünü ortadan kaldırmayı düşünmek olduğu veya faktör alanı üzerinde ek kısıtlamaların olduğu durumlarda, bir istatistikçi tarafından farklı şekilde ele alınabilir, optimal veya hibrit^12,28 tasarımları kullanarak veya tasarıma ek yapı ekleyerek olduğu gibi. Spesifik olarak, hibrit bir tasarım, bütçelenen çalışmaların çoğuyla alan dolduran bir tasarım oluşturarak ve daha sonra bir D-optimal kriteri kullanarak tasarımı kalan çalışmalarla (genellikle 2-4) "artırarak" oluşturulabilir. Başka bir hibrit yaklaşım, karışım (lipit) ve sürekli (proses) faktörleri üzerinde boşluk doldurma tasarımı oluşturmak ve daha sonra faktör seviyelerinin "optimal" bir tahsisini kullanarak herhangi bir kategorik faktör eklemektir. Bununla birlikte, protokolde alınan basitleştirilmiş alan doldurma tasarım yaklaşımı, son birkaç yılda düzinelerce LNP formülasyon optimizasyon deneyi yürütme sürecinde geliştirilmiştir ve çoğu durumda başarılı bir şekilde çalışacak sağlam bir yaklaşım sunduğuna inanıyoruz.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
JMP Pro 17.1	JMP Statistical Discovery LLC