Artigo de método

Um Protocolo Eficiente para Análise CUT&RUN de Células Satélites de Camundongos Isoladas por FACS

DOI:

10.3791/65215

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7 de julho de 2023

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1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Apresenta-se aqui um eficiente protocolo para o isolamento de células satélites de músculo de membros de camundongos (FACS) adaptado ao estudo da regulação da transcrição em fibras musculares por clivagem sob alvos e liberação utilizando nuclease (CUT&RUN).

Resumo

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Análises genômicas amplas com populações de pequenas células são uma grande restrição para estudos, particularmente no campo de células-tronco. Este trabalho descreve um protocolo eficiente para o isolamento de células satélites do músculo do membro ativado por fluorescência (FACS), um tecido com alto conteúdo de proteínas estruturais. Os músculos dos membros dissecados de camundongos adultos foram mecanicamente interrompidos pela picagem em meio suplementado com dispase e colagenase tipo I. Após a digestão, o homogeneizado foi filtrado através de filtros celulares, e as células foram suspensas em tampão FACS. A viabilidade foi determinada pela coloração de viabilidade fixável, e as células satélites imunomarcadas foram isoladas por FACS. As células foram lisadas com Triton X-100 e os núcleos liberados foram ligados a esferas magnéticas de concanavalina A. Complexos núcleo/grânulo foram incubados com anticorpos contra o fator de transcrição ou modificações de histonas de interesse. Após as lavagens, os complexos núcleo/grânulo foram incubados com a proteína A-micrococcal nuclease, e a clivagem da cromatina foi iniciada com CaCl2. Após a extração do DNA, bibliotecas foram geradas e sequenciadas, e os perfis para ligação do genoma amplo ao fator de transcrição e modificações covalentes de histonas foram obtidos por análise bioinformática. Os picos obtidos para as várias marcas de histonas mostraram que os eventos de ligação foram específicos para células satélites. Além disso, a análise de motivos conhecidos revelou que o fator de transcrição estava ligado à cromatina através de seu elemento de resposta cognato. Este protocolo é, portanto, adaptado para estudar a regulação gênica em células satélites musculares de membros de camundongos adultos.

Introdução

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Os músculos estriados esqueléticos representam, em média, 40% do peso total do corpo humano1. As fibras musculares exibem notável capacidade de regeneração após a lesão, que é descrita pela fusão de miócitos neoformados e pela geração de novas miofibras que substituem aslesadas2. Em 1961, Alexander Mauro relatou uma população de células mononucleares que denominou como células satélites3. Essas células-tronco expressam o fator de transcrição pareado caixa 7 (PAX7) e estão localizadas entre a lâmina basal e o sarcolema das fibrasmusculares4. Foi relatado que eles expressam o....

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Protocolo

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Os camundongos foram mantidos em biotério credenciado, de acordo com as Diretrizes Nacionais de Cuidados com Animais (Diretiva 86/609/CEE da Comissão Europeia; Decreto francês no.87-848) sobre o uso de animais de laboratório para pesquisa. As manipulações pretendidas foram submetidas ao Comitê de Ética (Com'Eth, Estrasburgo, França) e ao Ministério da Pesquisa francês (MESR) para avaliação ética e autorização de acordo com a diretiva 2010/63/EU sob o número APAFIS #22281.

1. Preparação da suspensão celular para isolamento de células satélites por fluorescência (FACS) (Figura 1)

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Resultados

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Células satélites de músculos esqueléticos de camundongos foram isoladas pela combinação dos protocolos de Gunther et al.12 e Liu et al.23 (doravante Protocolo 2). Como as fibras musculares não digeridas foram observadas após a digestão quando se utilizou a concentração de colagenase e dispase proposta no Protocolo 1, a quantidade de enzimas foi aumentada para melhorar a dissociação das fibras musculares, conforme descrito nas etapas 1.2.1 e 1.2.3. Conforme indicado no Prot.......

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Discussão

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O presente estudo relata um método padronizado, confiável e de fácil execução para o isolamento e cultivo de células satélites de camundongos, bem como a avaliação da regulação transcricional pelo método CUT&RUN.

Este protocolo envolve várias etapas críticas. O primeiro é a ruptura muscular e digestão de fibras para garantir um alto número de células coletadas. Apesar do aumento da concentração enzimática, mais células vivas foram obtidas do que usando o Protocolo 1. As células satélites expre.......

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Divulgações

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Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Agradecemos a Anastasia Bannwarth por fornecer excelente assistência técnica. Agradecemos ao biotério do IGBMC, à cultura de células, ao Instituto Clínico de Camundongos (ICS, Illkirch, França), à imagem, à microscopia eletrônica, à citometria de fluxo e à plataforma GenomEast, membro do consórcio 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009).

Este trabalho do Instituto Temático Interdisciplinar IMCBio, como parte do programa ITI 2021-2028 da Universidade de Estrasburgo, CNRS e Inserm, foi apoiado pela IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) e pelo projeto SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) e EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) no âmbito do Programa Francês de Inv....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microtubo de 1,5 mLEppendorf2080422
Microtubo de 2 mLStar LabS1620-2700
Tubos de 5 mLCORNING-FALCON352063
Tubos de 50 mLFalcon352098
anti-ARabcamab108341
anti-CD11beBioscience25-0112-82
anti-CD31eBioscience12-0311-82
anti-CD34eBioscience48-0341-82
anti-CD45eBioscience12-0451-83
anti-CXCR4eBioscience17-9991-82
anti-DMDabcamab15277
anti-H3K27acActive Motif39133
Motivo Ativo anti-H3K4me239141
anti-ITGA7MBLk0046-4
anti-PAX7DSHBAB_528428
anti-TER119BD Pharmingen TM553673
BeadsPolysciences86057-3BioMag® Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µ mCorning®  
Filtro de Células 40 µ mCorning®  431750
Filtro de Células 70 µ mCorning®  
Centrífuga 1Eppendorf521-0011Centrífuga 5415 R
Centrífuga 2Eppendorf5805000010Centrífuga 5804 R
Sistema de Deslizamento de Câmara Sistema ThermoFischer171080 me Nunc™ Lab-Tek™ Agente de limpeza de corrediças de câmara
Sigma   SLBQ7780VRNaseZAPTM
Colagenase, tipo I Thermo Fisher1710001710 mg/mL
Dispase STEMCELL technologies79135 U/mL
DynaMag™-2 AimantInvitrogen12321D
Mancha de Viabilidade FixávelBD Biosciences565388
Citômetro de FluxoBD FACSAria™ Citômetro de Fluxo de Fusão23-14816-01
Fluoromount G com DAPIInvitrogen00-4959-52
Navegador de genoma IGVhttp://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glicerol Sigma-AldrichG9012
HidrogelCorning®  354277Matriz qualificada Matrigel hESC
Software de processamento de imagemImage J®V 1.8.0
Filme de laboratórioSigma-AldrichP7793-1EAPARAFILM® M
Liberase LTRoche5401020001
Galato de propilSequenciador Sigma-Aldrich2370
 Illumina Hiseq 4000SY-401-4001
Banho de água agitadoBioblock Polytest científico 2018724
431752431751;

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal ....

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