In vivo Imagem do cérebro inteiro de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional

O peixe-zebra (Danio rerio) tem sido amplamente adotado como animal vertebrado modelo em neurociências, devido à sua transparência óptica na fase larval, seu rápido desenvolvimento, seu baixo custo de manutenção e a disponibilidade de diversas ferramentas genéticas 1,2,3,4. Em particular, a transparência óptica das larvas combinada com repórteres fluorescentes codificados geneticamente de eventos biológicos 5,6,7,8,9 fornece uma oportunidade única para obter imagens tanto da atividade neuronal quanto da estrutura em nível de todo o cérebro 10,11,12,13,14 . No entanto, mesmo com um microscópio que suporta a resolução celular, as imagens adquiridas não necessariamente retêm a informação em nível de célula única; A qualidade da imagem óptica pode ser degradada devido à aberração introduzida pelo gel de agarose usado para a montagem da amostra, os peixes podem ser montados em um ângulo, assim, as regiões de interesse não estão totalmente contidas no campo de visão do microscópio, e os peixes podem se mover durante a gravação, causando artefatos de movimento nas imagens ou impedindo a extração precisa do sinal das imagens.

Assim, um protocolo eficaz e reprodutível é necessário para obter dados de imagem de alta qualidade com o mínimo de ruído e movimento. Infelizmente, protocolos publicamente disponíveis para obtenção de imagens de todo o cérebro de larvas de peixe-zebra in vivo 15,16,17,18,19 descrevem apenas brevemente o procedimento, deixando partes substanciais dos detalhes, como solidificação de agarose, técnicas precisas de montagem e posicionamento da amostra usando pinças^, para cada experimentalista. Além disso, inconsistências na concentração de agarose e nos métodos de imobilização 10,11,14,15,16,17,18,19 podem levar a desafios decorrentes da movimentação dos peixes durante o processo de imagem.

Aqui, um protocolo detalhado para imagens de todo o cérebro de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional é fornecido. A Figura 1 fornece uma visão gráfica do protocolo: preparo e imobilização da amostra, incorporação da amostra, aquisição da imagem e visualização após a aquisição de imagens. A imagem estrutural e funcional do cérebro de larvas de peixe-zebra in vivo é demonstrada usando um microscópio confocal comercial e um microscópio de fluorescência personalizado. Este protocolo pode ser adaptado por profissionais para imagens cerebrais com certos estímulos sensoriais ou contextos comportamentais, dependendo das necessidades experimentais e do design.

Todos os experimentos com zebrafish foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do KAIST (KA2021-125). Um total de 12 zebrafish adultos com expressão pan-neuronal do indicador de cálcio GCaMP7a [Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)] em um fundo de casper [mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9)] foram usados para a reprodução. Esse grupo foi composto por oito mulheres e quatro homens, com idades variando de 3 a 12 meses. Experimentos de imagem foram realizados em larvas de peixe-zebra aos 3-4 dias após a fertilização (d.p.f.), uma fase durante a qual seu sexo não pode ser determinado.

1. Preparação da amostra de peixe-zebra

1. Coletar embriões após a reprodução de peixes adultos de uma linhagem transgênica desejada, como Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)^20,21,22, em uma placa de Petri preenchida com água de ovo (ver Tabela de Materiais). Colocar os embriões em estufa a 28 °C e elevá-los a 3-4 d.p.f.^{larvas 23,24,25}.
   1. Se o fundo do peixe-zebra não for albino, para inibir a formação de pigmentação, transfira os embriões 24 h após a fertilização (h.p.f.) para a placa de Petri preenchida com água de ovo contendo 200 μM de 1-fenil2-tiouréia (PTU; ver Tabela de Materiais)^25,26. A cada 24 h, transferir o peixe para um novo prato com água fresca contendo 200 μM de PTU.
      NOTA: Os peixes-zebra são mantidos em condições normais a 28 °C e um ciclo claro:escuro de 14:10 h. Sabe-se que o tratamento com PTU afeta o comportamento e a função tireoidiana de larvas de zebrafish^27,28. Portanto, é importante usar o PTU com cautela e controlar cuidadosamente possíveis fatores de confusão em quaisquer experimentos.
2. Para encontrar a amostra que expressa proteínas fluorescentes de interesse (por exemplo, GCaMP7a pan-neuronal), faça uma triagem da amostra em um microscópio de epifluorescência e selecione uma amostra com uma expressão brilhante.
3. Preparar a amostra selecionada de 3-4 d.p.f. de zebrafish na placa de Petri preenchida com água de ovo (Figura 2A).
   NOTA: Para registrar a atividade neuronal espontânea, recomenda-se o uso de amostras com idade entre 80-100 h.p.f., pois o nível de atividade espontânea é baixo antes de 80 h.p.f. e o desenvolvimento da pigmentação, mesmo com um fundo de cásper, pode degradar a qualidade da imagem após 100 h.p.f.
4. Preparar uma solução de brometo de pancurónio 0,25 mg/ml 14,19,29,30,31 adicionando 1 ml de uma solução-mãe de ^2,5 mg/ml (ver Tabela de Materiais) a ¹⁰ ml de água de ovo. Aliciar a solução de brometo de pancurónio em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
5. Transfira a amostra pré-selecionada para a placa de Petri usando uma pipeta de transferência.
   NOTA: Tente transportar um volume mínimo de água de ovo com a amostra.
6. Transferir 0,1 mL da solução de brometo de pancurônio para a placa de Petri para paralisação.
   NOTA: O brometo de pancurônio tem um potencial efeito de amortecimento sobre a atividade neural em larvas de peixe-zebra³². É essencial considerar cuidadosamente a concentração e a duração da exposição ao brometo de pancurónio.

2. 2% (wt/vol) preparação de gel de agarose

1. Ligue um bloco de calor e ajuste a temperatura alvo para 37 °C. Aguarde o aparelho aquecer e equilibrar-se à temperatura definida.
2. Dissolver 0,2 g de pó de agarose de baixo ponto de fusão (ver Tabela de Materiais) em 10 mL de água de ovo.
3. Aqueça a solução de agarose no micro-ondas e misture-a agitando e agitando até que a agarose esteja completamente dissolvida.
4. Aliquotar o gel de agarose em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e armazenar os tubos de microcentrífuga no bloco de calor (Figura 2B).
   NOTA: Verifique se as bolhas no gel de agarose desapareceram.

3. Montagem e posicionamento da amostra

1. Verificar a amostra sob um estereomicroscópio para verificar se o movimento das larvas parou e avaliar visualmente a saúde da amostra verificando seus batimentos cardíacos (Figura 2C). Se o batimento cardíaco estiver muito lento, descarte a amostra.
   NOTA: Se o batimento cardíaco do peixe que está sendo fotografado for muito lento (por exemplo, abaixo de 60 batimentos por minuto), talvez não seja possível realizar imagens de longo prazo. Para avaliar o bem-estar dos peixes, a frequência cardíaca pode ser verificada visualmente comparando-a com outros peixes na mesma placa de Petri. Isso ajudará a garantir que os peixes que estão sendo fotografados estejam saudáveis e estáveis o suficiente para o procedimento de imagem.
2. Usando a pipeta de transferência, coloque uma única larva de peixe-zebra no gel de agarose no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (Figura 2D).
   NOTA: Certifique-se de descartar a pipeta após a transferência da amostra.
3. Despeje o gel de agarose na placa de Petri para fazer uma camada de 1-2 mm. Transfira a amostra nos tubos de microcentrífuga para a placa de Petri usando a pipeta de transferência, de modo que a larva seja colocada no centro da placa.
   NOTA: Se houver poeira e bolhas no gel de agarose, remova-as usando a pipeta de transferência.
4. Utilizar pinça para posicionar a amostra na orientação desejada de forma que a cabeça e a cauda fiquem planas (Figura 2E).
5. Girar a amostra utilizando pinça de modo que ambos os olhos fiquem nivelados (Figura 2F).
   NOTA: Os procedimentos de alinhamento (posição e rotação) devem ser concluídos antes que o gel de agarose comece a solidificar.
6. Após o alinhamento, aguardar até que o gel de agarose se solidifique (Figura 2G,H).
   NOTA: O tempo de espera para o gel de agarose solidificar pode variar de 5-10 min, dependendo do volume e tamanho do gel.
7. Após a solidificação do gel de agarose, preencher a placa de Petri com água de ovo e colocar a placa de Petri com a amostra embebida no palco do microscópio (Figura 2I).

4. Aquisição de imagens

1. Ligue o sistema de microscópio (por exemplo, lasers, controladores confocais, microscópio e computador; consulte Tabela de Materiais) e verifique se todo o sistema está funcionando.
2. Selecione uma lente objetiva de baixa ampliação e localize a amostra no centro do campo de visão.
3. Selecione uma lente objetiva de imersão em água ou imersão em água com ampliação adequada (por exemplo, lente de imersão de água de abertura numérica (NA) de 16x 0,8; consulte Tabela de Materiais). Faça ajustes finos no campo de visão.
4. Defina os parâmetros de imagem (por exemplo, tamanho da imagem, potência do laser, tempo de exposição, número de quadros) usando um software de aquisição de imagem.
   NOTA: Defina os parâmetros de imagem para obter os melhores resultados possíveis para necessidades específicas (consulte a configuração para aquisição de imagens na seção de resultados representativos). Se a imagem estiver saturada, reduza a potência do laser.
5. Encontre o cérebro da amostra movendo o palco e determine sua espessura usando o modo de visualização ao vivo no software, alterando os planos focais manualmente para cima e para baixo. Defina os limites inferior e superior do volume.
   NOTA: Certifique-se de que todo o cérebro está contido no campo de visão ao longo das direções lateral e axial.
6. Defina um tamanho de passo z considerando a resolução axial do microscópio.
   NOTA: O tamanho ideal do passo z para obter imagens do cérebro da larva do peixe-zebra depende da modalidade de imagem e da resolução do microscópio. Como exemplo, utilizou-se um tamanho de passo z de 5 μm, considerando-se a espessura da folha de luz e o diâmetro médio dos corpos celulares¹⁰.
7. Prossiga com a aquisição da imagem para o campo de visão definido.
   1. Para imagens estruturais volumétricas, adquira uma imagem 3D (x,y,z) de todo o cérebro alterando os planos focais e obtendo imagens 2D de cada plano z sequencialmente.
   2. Para imagens funcionais de um único plano z, adquira imagens de séries temporais (x,y,t) da atividade neuronal do cérebro a uma determinada profundidade.
   3. Para imagens funcionais volumétricas, adquira uma imagem 4D (x,y,z,t) da atividade neuronal em todo o cérebro obtendo imagens 3D sequencialmente.
      Observação : defina o número de quadros considerando o tamanho de memória disponível do computador. Recomenda-se um tempo de aquisição inferior a 1 h devido à duração do efeito do brometo de pancurônio.
8. Depois de adquirir as imagens, salve os resultados e registre os parâmetros de imagem (por exemplo, tamanho do pixel, tamanho do passo z, taxa de quadros, potência do laser) para análise da imagem.
9. Exporte as imagens em um formato apropriado para renderização e análise de imagens.
   Observação : exportar imagens no formato de arquivo de imagem marcada (TIF) é recomendado. O TIF suporta compressão de imagem sem perdas e é compatível com a maioria dos softwares de processamento de imagens e linguagens de programação. Além disso, o formato TIF suporta a inclusão de metadados, como parâmetros de aquisição, resolução da imagem e outras informações relevantes que podem auxiliar na interpretação e reprodutibilidade dos dados.

5. Configuração para visualizações usando napari

NOTA: napari é um visualizador de imagens multidimensional de código aberto em um ambiente Python com renderização baseada em GPU (unidade de processamento gráfico)³³. O plugin napari-animation fornece uma criação programática de filmes. O uso de Fiji, um programa de processamento de imagem de código aberto, é recomendado para processamento de imagens de uso geral, como filtragem e transformação geométrica (consulte Tabela de Materiais). O código-fonte usado para a visualização usando napari está disponível no GitHub (https://github.com/NICALab/Zebrafish-brain-visualization).

1. Instale napari e napari-animation usando pip ou conda. Após a instalação, crie um novo arquivo de bloco de anotações jupyter.
   NOTA: A execução com o bloco de anotações jupyter, que é uma ferramenta interativa para Python, é recomendada sobre o script Python.
2. Importar napari e napari-animation.

6. Visualizando estruturas usando napari

1. Para visualizar imagens e criar filmes do cérebro do peixe-zebra renderizado, carregue a imagem 3D (x,y,z) e abra a janela do napari. Conecte o plug-in napari-animation (Figura 3A).
2. Defina parâmetros como tamanho do voxel, mapa de cores e limites de contraste nos controles de camada.
3. Ajuste as configurações do visualizador (por exemplo, perspectiva, ângulos) na tela.
4. Para capturar a imagem renderizada, pressione o botão de captura no assistente de animação.
5. Para gerar filmes do volume renderizado, modifique as configurações do visualizador e adicione quadros-chave (Figura 3B).
6. Depois de adicionar quadros-chave, defina o número de quadros (etapas) entre quadros-chave no assistente de animação. Salve a animação renderizada.

7. Processamento de imagens e visualização da atividade neuronal utilizando napari

NOTA: Para visualizar as imagens de séries temporais da atividade neuronal como imagens sobrepostas de um fundo estático e atividade, um algoritmo de decomposição deve ser aplicado às imagens brutas. Use uma implementação MATLAB de um algoritmo de decomposição chamado BEAR²⁴. A versão MATLAB do BEAR está disponível no GitHub (https://github.com/NICALab/BEAR).

1. Para decompor o fundo estático e a atividade neuronal, aplique BEAR às imagens brutas de séries temporais (x,y,t ou x,y,z,t). Após a decomposição, salve as imagens de fundo e da atividade neuronal como arquivos TIF (Figura 3C).
2. Carregue as imagens de fundo e de atividade neuronal e abra a janela do napari. Conecte o plugin napari-animation.
3. Use um mapa colorido cinza para imagens de plano de fundo e um mapa colorido quente para imagens de atividade neuronal (Figura 3C).
4. Defina parâmetros como limites de opacidade e contraste nos controles de camada.
5. Para gerar filmes de atividade neuronal, modifique as configurações do visualizador e adicione quadros-chave para renderizar a animação.
6. Depois de adicionar quadros-chave, defina o número de quadros (etapas) entre quadros-chave no assistente de animação. Salve a animação renderizada.

A estrutura e a atividade neuronal do cérebro de larvas de peixe-zebra expressando cálcio indicador pan-neuronal GCaMP7a (Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a))20,21,22 com um fundo casper (mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9))34 foi fotografado em 3-4 d.p.f. seguindo o protocolo descrito.

Para aquisição volumétrica de imagens estruturais, o espécime foi obtido usando um sistema comercial de microscopia confocal point-scanning equipado com uma lente objetiva mergulhadora de água 16x 0,8 NA. Um laser de excitação de 488 nm foi usado para imagens estruturais e funcionais. A taxa de quadros, a resolução da imagem, o tamanho do pixel e o tamanho do passo axial foram 0,25 Hz, 2048 x 2048, 0,34 μm e 1,225 μm, respectivamente. A aquisição das imagens durou aproximadamente 1 h e 20 min. O campo de visão volumétrico da imagem adquirida cobriu as regiões cerebrais do prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo (Figura 4A). Os corpos celulares neuronais do bulbo, placa cerebelar, tecto óptico, habênula e telencéfalo dorsal em todo o encéfalo de 4 d.p.f. foram claramente visíveis nas imagens de microscopia confocal (Figura 4B). A renderização 3D das imagens de microscopia confocal foi realizada utilizando napari27 seguindo o protocolo supracitado (Figura 4C e Vídeo 1).

Para a obtenção de imagens funcionais em 2D, o espécime foi obtido usando o mesmo sistema de microscopia confocal, equipado com uma lente objetiva mergulhadora de água 16x 0,8 NA. A taxa de quadros, a resolução da imagem e o tamanho dos pixels foram de 2 Hz, 512 x 256 e 1,5 μm, respectivamente. Os corpos celulares neuronais eram claramente visíveis tanto no fundo quanto na atividade neuronal sobreposta (Figura 5A,B).

Para a aquisição de imagens funcionais em 3D, foi utilizado um sistema de microscopia 3D personalizado18 , capaz de obter imagens in vivo da atividade neuronal de todo o cérebro de uma larva de peixe-zebra com campo de visão de 1.040 μm × 400 μm × 235 μm e resoluções lateral e axial de 1,7 μm e 5,4 μm, respectivamente. A taxa de imagem foi de até 4,2 volumes por segundo. Semelhante à renderização dos dados de imagem estrutural, o napari foi usado para renderização 3D dos dados de imagem de cálcio de todo o cérebro (Figura 5C e Vídeo 2).

Figura 1: Visão geral do procedimento experimental. Preparação e paralisação de amostras de peixe-zebra (etapa 1). A preparação de gel de agarose a 2% (m/vol) (passo 2). Montagem e posicionamento da amostra (passo 3). Aquisição das imagens (passo 4). Processamento de imagens e visualização da estrutura e atividade neuronal (passo 5-7). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Procedimento experimental para a preparação de imagens do cérebro inteiro . (A) Amostra de zebrafish triada expressando GCaMP7a pan-neuronal em uma placa de Petri preenchida com água de ovo. (B) Equipamento e material necessários para a montagem e posicionamento da amostra. (1) Bloco térmico a 37 °C; (2) gel de agarose a 2% (wt/vol); (3) tubo de microcentrífuga de 1,5 mL; (4) água de ovo; (5) 0,25 mg/mL de solução de brometo de pancurônio; (6) Placa de Petri; (7) fórceps; (8) pipeta de transferência. (C) Imagem em estereomicroscópio da amostra paralisada. A seta preta aponta para o coração da amostra. (D) A amostra no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL é transferida por pipeta. A inserção mostra uma visão ampliada da área encaixotada. (E) A amostra (seta preta) é colocada no centro da placa de Petri com pinças. (F) A amostra é alinhada com pinças. (G) Um exemplo de uma amostra incorporada desalinhada. (H) Um exemplo de uma amostra incorporada alinhada. (I) O espécime é colocado em um palco de microscópio sob a lente objetiva para aquisição da imagem. Barra de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Visualização de imagens cerebrais de larvas de zebrafish . (A) A renderização 3D de uma imagem de microscopia confocal de um cérebro de larva de peixe-zebra (4 d.p.f) expressando GCaMP7a pan-neuronal. napari, um visualizador de imagens multidimensional de código aberto em um ambiente Python, foi usado para a renderização. A janela napari inclui controles de camada (caixa vermelha), uma lista de camadas (caixa amarela), uma tela (caixa azul) e um assistente de animação (caixa verde). (B) Quadros-chave com várias configurações de visualizador são adicionados para renderizar uma animação. (C) Imagem de microscopia confocal de imagens de lapso de tempo 2-D da atividade neuronal no cérebro de larvas de peixe-zebra. A imagem é decomposta para o fundo (esquerda) e atividade neuronal (meio), depois sobreposta (direita). Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Estrutura de imagem de um cérebro de larva de peixe-zebra. (A) Projeção de intensidade máxima (MIP) de uma imagem de microscopia confocal de um cérebro de larvas de peixe-zebra (4 d.p.f.) expressando GCaMP7a pan-neuronal. Parte superior: PIM lateral. Parte inferior: MIP axial. Cada limite contém o prosencéfalo (vermelho), mesencéfalo (amarelo) e rombencéfalo (azul). (B) Um total de 10 cortes axiais em múltiplas profundidades a partir de uma imagem volumétrica do cérebro (a z = 25 μm, 50 μm, 75 μm, 100 μm, 125 μm, 150 μm, 175 μm, 200 μm, 225 μm, 250 μm, contados para cima de cima para baixo; z = 0 μm indica a superfície superior do cérebro). Cada caixa branca representa a região do cérebro (medula oblonga, placa cerebelar, tecto óptico, habênula e telencéfalo dorsal). (C) Todo o cérebro renderizado usando napari. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagem da atividade neuronal de um cérebro de larva de peixe-zebra. (A) Imagem de microscopia confocal da atividade neuronal em um cérebro de larvas de peixe-zebra (4 d.p.f.) expressando GCaMP7a pan-neuronal. Barra de escala: 100 μm. (B) Visão ampliada da área encaixotada em A mostrando a atividade neuronal no tecto óptico em vários pontos de tempo. Barra de escala: 20 μm. (C) A renderização 3D da atividade neuronal de todo o cérebro no cérebro de larvas de peixe-zebra adquirida usando um microscópio personalizado (esquerda: t = 133 s; direita: t = 901 s). A atividade neuronal é sobreposta ao fundo estático. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Imagem em time-lapse com e sem deriva de amostra. (A) Imagem em time-lapse do cérebro de larvas de peixe-zebra expressando GCaMP7a pan-neuronal com deriva de amostra. Água de ovo foi adicionada à amostra antes da solidificação do gel de agarose (passo 3.6-3.7). Os peixes se movimentaram nas direções lateral e axial. (B) Imagem em time-lapse de um cérebro de larvas de peixe-zebra sem deriva de amostra. Água de ovo foi adicionada à amostra após solidificação do gel de agarose (passo 3.6-3.7). Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Renderização 3D da estrutura do cérebro inteiro de uma larva de peixe-zebra (4 d.p.f.) cérebro expressando GCaMP7a pan-neuronal. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Renderização 3D da atividade neuronal do cérebro inteiro em um larva de peixe-zebra (4 d.p.f.) cérebro expressando GCaMP7a pan-neuronal. Clique aqui para baixar este vídeo.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.