Summary
In dit artikel wordt een protocol beschreven voor handmatige tyramide signaalversterking (TSA) multiplex immunofluorescentie (mIF) in combinatie met beeldanalyse en ruimtelijke analyse. Dit protocol kan worden gebruikt met formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) secties voor de kleuring van twee tot zes antigenen per dia, afhankelijk van de diascanner die beschikbaar is in het laboratorium.
Abstract
De tumormicro-omgeving (TME) bestaat uit een overvloed aan verschillende celtypen, zoals cytotoxische immuuncellen en immunomodulerende cellen. Afhankelijk van de samenstelling en de interacties tussen kankercellen en peritumorale cellen, kan de TME de progressie van kanker beïnvloeden. De karakterisering van tumoren en hun complexe micro-omgeving kan het begrip van kankerziekten verbeteren en kan wetenschappers en clinici helpen nieuwe biomarkers te ontdekken.
We hebben onlangs verschillende multiplex immunofluorescentie (mIF) panelen ontwikkeld op basis van tyramide signaalversterking (TSA) voor de karakterisering van de TME bij colorectale kanker, hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom, melanoom en longkanker. Zodra het kleuren en scannen van de bijbehorende panelen is voltooid, worden de monsters geanalyseerd op een beeldanalysesoftware. De ruimtelijke positie en de kleuring van elke cel worden vervolgens vanuit deze kwantificeringssoftware geëxporteerd naar R. We ontwikkelden R-scripts waarmee we niet alleen de dichtheid van elk celtype in verschillende tumorcompartimenten (bijvoorbeeld het centrum van de tumor, de marge van de tumor en het stroma) kunnen analyseren, maar ook op afstand gebaseerde analyses tussen verschillende celtypen kunnen uitvoeren.
Deze specifieke workflow voegt een ruimtelijke dimensie toe aan de klassieke dichtheidsanalyse die al routinematig wordt uitgevoerd voor verschillende markers. mIF-analyse zou wetenschappers in staat kunnen stellen een beter begrip te krijgen van de complexe interactie tussen kankercellen en de TME en om nieuwe voorspellende biomarkers van respons op behandelingen te ontdekken, zoals immuuncheckpointremmers en gerichte therapieën.
Introduction
Met de ontwikkeling van gerichte therapieën en immuuncheckpointremmers is het van het grootste belang geworden om de interacties tussen kankercellen en hun tumormicro-omgeving beter te karakteriseren, en dit is momenteel een belangrijk gebied van translationeel onderzoek. De TME is samengesteld uit een overvloed aan verschillende celtypen, met een balans van immuuncytotoxische cellen gericht op de kankercellen en immunomodulerende cellen die tumorgroei en invasiviteit kunnen bevorderen 1,2,3,4. De karakterisering van deze complexe omgeving kan het begrip van kankerziekten verbeteren en kan wetenschappers en clinici helpen nieuwe voorspellende en prognostische biomarkers te ontdekken om patiënten beter te selecteren voor toekomstige behandeling 5,6. Galon en zijn team ontwikkelden bijvoorbeeld de Immunoscore, een reproduceerbare scoringsmethode die kan worden gebruikt als een voorspellende biomarker. De Immunoscore wordt berekend met behulp van de dichtheid van CD3+ en CD8+ T cellen in de invasieve marge en in het midden van de tumor 7,8.
In de afgelopen decennia zijn commerciële oplossingen voor mIF ontwikkeld, maar deze zijn vaak duur en ontworpen voor specifieke panelen van antigenen. Om de behoefte aan specifieke panels van antigenen in academisch en translationeel onderzoek te overwinnen, hebben we een kosteneffectieve methode ontwikkeld om mIF uit te voeren op FFPE-tumorsecties, waardoor de kleuring van twee tot zes antigenen die aan de celkernen worden toegevoegd tegenkleuring op menselijke en muismonsters.
Zodra de hele weefselsecties zijn gekleurd en gescand met een fluorescentiediascanner, kunnen de monsters worden geanalyseerd door verschillende beeldanalysesoftware die grote piramidale datasets ondersteunt. Ten slotte kunnen de ruwe gegevens worden gebruikt in een omgeving voor statistische berekeningen en afbeeldingen zoals de R-software (v.4.0.2) om dichtheids- en ruimtelijke analyses uit te voeren.
Een protocol dat is geoptimaliseerd voor vijf-markerkleuring, evenals trucs en tips om nieuwe panelen te optimaliseren, wordt in dit manuscript gepresenteerd. Bovendien worden gedetailleerde stappen van de beeldanalyse en de R-functies die worden gebruikt voor de statistische en ruimtelijke analyse uitgelegd.
Protocol
Alle monsters die in dit protocol worden gebruikt, zijn afkomstig van een studie die is goedgekeurd door de lokale ethische commissies en is goedgekeurd door de bevoegde autoriteit. Alle deelnemers aan het onderzoek gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming. De studie is geregistreerd bij ClinicalTrials.gov (NCT03608046).
1. Multiplex immunofluorescentie
- FFPE-sectie
- Fixeer het weefsel in 4% paraformaldehyde en sluit het vaste weefsel in paraffine in.
- Snijd secties van 5 μm en plaats ze op zelfklevende microscoopglaasjes.
- Droog de dia's een nacht op kamertemperatuur (RT).
- Deparaffinisatie en endogene peroxidasen remming
- Dewax de weefsels door de glaasjes onder te dompelen in tolueen (3x gedurende 5 min elk) en methanol (3x gedurende 5 min elk) onder een zuurkast.
- Rem de endogene peroxidasen door de glaasjes gedurende 20 minuten onder te dompelen in 3% waterstofperoxide verdund in methanol onder een zuurkast.
- Spoel de glaasjes af in gedestilleerd (d) H2O (1x gedurende 3 min).
- Multiplex immunofluorescentie kleuring
- Dompel de dia's onder in een 300 ml kleurpot met 10 mM citraat (pH 6) of EDTA (pH 9) buffer aangevuld met 0,1% TritonX-100.
OPMERKING: De gebruikte buffer (pH 6 of pH 9) is afhankelijk van het gekleurde antigeen (zie tabel 1). - Plaats de vlekpot met gesloten deksel gedurende 3-5 minuten in een magnetron op maximaal vermogen (bijv. 900 W) totdat de buffer begint te koken.
OPMERKING: De optimale tijd voor koken hangt af van de magnetron en het volume van de buffer. Aanpassingen kunnen nodig zijn om de perfecte timing te vinden. Voor sommige fragiele antigenen of fragiele en minder hechtende exemplaren (bijv. organoïden en sferoïden) kan het koken in de magnetron te hard zijn. In dit geval kan in plaats daarvan een snelkookpan worden gebruikt. - Houd de buffer op bijna kooktemperatuur door de gesloten kleuringspot gedurende 15 minuten in de magnetron op een laag vermogen (bijv. 90 W) te zetten.
- Voer de laatste stap van de verwarming uit door de magnetron gedurende 90 s op maximaal vermogen te zetten.
- Haal de pot uit de magnetron en laat de buffer 15 min afkoelen bij RT.
- Spoel de glaasjes 3x gedurende 5 min elk in dH2O en 1x gedurende 5 min in tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (TBS-T).
- Verwijder de TBS-T door de dia's op een papieren handdoek te deppen
- Plaats de dia's (plat) op een vlekkamerlade of microscoopglaasje (zie Materiaaltabel).
- Omring het weefsel met een hydrofobe pen.
- Blokkeer de niet-specifieke bindingsplaatsen door het weefsel gedurende 30 minuten te bedekken met 5% runderserumalbumine (BSA) opgelost in TBS-T.
- Verwijder de blokkeringsbuffer door de dia's op een papieren handdoek te deppen.
OPMERKING: Spoel de dia's niet af na de blokkeringsstap. - Incubeer het weefsel gedurende 60 minuten met het primaire antilichaam (zie tabel 1) verdund in 1% BSA TBS-T door het weefsel te bedekken met ongeveer 300 μL van de oplossing.
- Spoel de dia's 3x 3 minuten elk af met TBS-T.
- Incubeer het weefsel gedurende 40 minuten met poly-HRP secundair antilichaam (zie tabel 1) door het weefsel te bedekken met ongeveer 300 μL van de oplossing.
- Spoel de dia's 3x 3 min af met TBS-T.
- Incubeer het weefsel gedurende 10 minuten met fluorochroom-tyramidereagens (zie tabel 1) 200-voudig verdund in boraatbuffer (0,1 M boraat, pH 7,8, 3 M NaCl) extemporeus aangevuld met 0,003% H 2 O2 door het weefsel tebedekken met ongeveer 300 μL van de oplossing.
- Spoel de dia's 3x 3 min af met TBS-T.
- Herhaal stap 1.3.1-1.3.16 totdat alle TSA-kleuring is uitgevoerd.
- Incubeer het weefsel 's nachts bij 4 °C met het laatste primaire antilichaam (zie tabel 1) verdund in 1% BSA TBS-T.
OPMERKING: Aangezien de incubatie 's nachts plaatsvindt, is het belangrijk om de vlekkamerlade of de microscoopschuifdoos te bedekken en dH2O toe te voegen op een papieren handdoek in de bodem van de doos (onder de dia's) om ervoor te zorgen dat de weefsels niet drogen tijdens de incubatie. - Spoel het weefsel 3x gedurende 5 min elk met TBS-T.
- Incubeer het weefsel gedurende 120 minuten met het secundaire antilichaam (direct gekoppeld aan fluorochroom) 200-voudig verdund in 1% BSA TBS-T.
- Spoel het weefsel 3x gedurende 5 min elk met TBS-T.
- Kleur de kernen door het weefsel gedurende 5 minuten te incuberen in bisbenzimide (20 mM) 1.000-voudig verdund in 10% BSA TBS-T.
OPMERKING: Bisbenzimide kan worden vervangen door DAPI, maar de laatste is giftiger en moet voorzichtig worden behandeld onder een zuurkast. - Spoel het weefsel 3x gedurende 3 min elk in dH2O.
- Monteer de dia's met behulp van een fluorescentiebevestigingsmedium en een borosilicaatafdekbril.
- Dompel de dia's onder in een 300 ml kleurpot met 10 mM citraat (pH 6) of EDTA (pH 9) buffer aangevuld met 0,1% TritonX-100.
2. Dia scannen
- Digitaliseer de dia's door ze te scannen op een fluorescentiediascanner met een vergroting van 20x (details van de diascanner zijn te vinden in de materiaalopgave).
OPMERKING: Een representatieve scan van een optimale multiplex wordt weergegeven in figuur 1.
3. Beeldanalyse
- Importeer de scans in een beeldanalysesoftware (File > Open Image).
- Ga naar het tabblad Classifiers en selecteer de DenseNet AI V2-plug-in .
- Train de DenseNet AI V2-plug-in om kernen te herkennen door ongeveer 500 kernen in één afbeelding te omringen.
- Train de AI op verschillende andere dia's uit dezelfde batch en verschillende batches mIF-kleuring door verschillende kernen (50) op verschillende dia's (ongeveer 10) te omringen.
OPMERKING: Gedetailleerde instructies voor het gebruik van de AI-plug-in zijn te vinden in de softwarehandleiding. Het gebruik van AI voor kerndetectie is optioneel. Andere methoden om kernen te detecteren zijn beschikbaar, afhankelijk van de gebruikte beeldanalysesoftware. - Sla de getrainde AI op (Classifier Actions > Save).
- Ga naar het tabblad Annotaties en maak een annotatie voor elke interesseregio (ROI), zoals het midden van de tumor en de marge van de tumor, met behulp van het gereedschap Penannotatie.
- Verwijder indien nodig de gebieden met vouwen en de gebieden die wazig worden weergegeven met het gereedschap Uitsluitingsannotatie.
OPMERKING: Hematoxyline-eosinekleuring van een sectie naast die welke wordt gebruikt voor mIF kan worden uitgevoerd vóór de mIF-kleuring om ervoor te zorgen dat tumorcellen aanwezig zijn in het monster en om anatomopathologen te helpen de ROIs te bepalen. - Ga naar het tabblad Analyse en selecteer het HighPlex FL-algoritme (Acties voor instellingen > > HighPlex FL laden).
- Selecteer het tabblad Kleurstofselectie en selecteer de gewenste kleurstof.
- Ga op het tabblad Nucleaire detectie naar Nucleair segmentatietype en selecteer AI aangepast.
- Selecteer in Nuclear Segmentation Classifier de AI die is opgeslagen bij stap 3.5.
- Kies in het tabblad Membraan- en cytoplasmadetectie de maximale cytoplasmastraal (in deze studie werd 1,5 gebruikt) en het aantal membraankleurstoffen.
- Selecteer voor elke kleurstof de nucleuspositieve drempel, de cytoplasmapositieve drempel en de membraanpositieve drempel.
OPMERKING: De drempel is verschillend voor elke kleuring en moet worden aangepast voor elke batch dia's en elk gekleurd antigeen. Het gebruik van het hulpprogramma Weergave-instellingen (Weergave- > weergave-instellingen) kan helpen bij het selecteren van een geschikte drempel door de intensiteitswaarde aan het einde van de intensiteitspiek (aan de rechterkant) te gebruiken. - Selecteer voor elke kleurstof het kern-, membraan- en cytoplasmapercentage van volledigheidswaarden.
OPMERKING: Deze parameter is belangrijk om vals-positieve detectie te voorkomen wanneer twee cellen met verschillende kleuring dicht bij elkaar staan (figuur 2). - Sla het algoritme op (Instellingen, Acties, > Opslaan).
- Analyseer de ROI's (analyseer > annotatielaag).
- Ga naar het tabblad Resultaten en selecteer alle gegevens in Objectgegevens (ctrl + A).
- Exporteer de gegevens in .csv indeling (klik met de rechtermuisknop > Exporteer > objectgegevens . Csv).
OPMERKING: Deze tabel bevat de positie (Xmin, Xmax; Ymin, Ymax) en de positiviteit van elke marker van elke geanalyseerde cel.
4. Bioinformatica met behulp van R
OPMERKING: Een R-script met meer details over de volgende stappen is beschikbaar op GitHub (benidovskaya/Ring: Pipeline for the analysis of multiplex immunofluorescence stainings. [github.com])
- Definieer met behulp van de geëxporteerde tabel eerst de verschillende celtypen op basis van de colokalisatiekleuringen. Definieer bijvoorbeeld cytotoxische T-cellen door dubbelpositieve CD3+/CD8+-cellen.
- Reconstrueer vervolgens een vereenvoudigde afbeelding van de dia op een dot plot met behulp van de coördinaten geëxporteerd uit de beeldanalysesoftware en ggplot2 (Figuur 3). Met behulp van deze gegevens kunnen verschillende soorten analyses worden uitgevoerd:
- Dichtheidsanalyse
OPMERKING: De eenvoudigste analyse is een dichtheidsanalyse.- Voer een dichtheidsanalyse uit voor alle celtypen met behulp van de hele dia voor biopsieën of een specifiek gebied van het weefsel. Bereken bijvoorbeeld de dichtheid van CD3+ en CD8+ T-cellen in het midden van de tumor en de marge van de tumor (figuur 4A-C).
- Om die dichtheden te berekenen, gebruikt u beeldanalysesoftware om per monster een specifiek gegevensframe te produceren met het fenotype en de coördinaten van elke cel. Maak via een clusterfunctie (k-nearest neighbor) op R een polygoonobject met behulp van de randen van de bestudeerde biopsie en bereken de dichtheid van de celtypen die erin van belang zijn.
OPMERKING: Dit maakt het mogelijk om de dichtheden van verschillende celtypen te vergelijken tussen verschillende aandoeningen (zoals verschillende tijdstippen, behandelingstypen, weefseltypen en respons op de behandeling) en lokalisaties (centrum van de tumor, marge van de tumor, stromafibrose en necrosegebied), afhankelijk van de biologische hypothese. Vanwege de hoge nabijheid tussen kankercellen, peri-tumorale cellen en tumor-infiltrerende cellen, kan de beeldanalysesoftware tegelijkertijd dubbelpositieve cellen als immuun- en kankercellen detecteren. In dat geval moet men dit probleem bioinformatisch corrigeren door te vermelden wat deze dubbelpositieve cellen zijn. In dit geval werden CD3+CD8+cytokeratine+ cellen gelabeld als cytotoxische cellen omdat de cytokeratine positiviteit te wijten was aan de tumorcellen rond de infiltrerende lymfocyten.
- Heatmaps
- Gebruik de dichtheid van elk celtype van verschillende panelen en door een normalisatie toe te passen (bijvoorbeeld scaling centering), teken heatmaps (figuur 5) die de celrijkdom in de populatie van monsters vertegenwoordigen.
- Met behulp van hiërarchische onbewaakte clustering op basis van celdichtheid, clusteren patiënten met vergelijkbare TME-samenstellingen en correleren deze clusters met klinische parameters zoals behandelingsrespons en overleving.
OPMERKING: Heatmaps en clusterisatie kunnen eenvoudig worden uitgevoerd met het R ComplexHeatmap-pakket9.
- Ruimtelijke celverdeling
- Bereken bioinformatisch de afstanden tussen de cellen (bijv. Immuun- en tumorcellen; Figuur 6A, B) op basis van de celcoördinaten van de beeldanalyse. Gebruik de mediane en gemiddelde afstanden tussen de celtypen van belang om de celnabijheid van alle monsters van een cohort te vergelijken.
- Ruimtelijke beschrijvende functies
- Gebruik de cross-type dichtstbijzijnde buur G-kruisfunctie, beschikbaar via het R spatstat-pakket10, om de waarschijnlijkheid te bepalen voor een cel van belang, X (bijvoorbeeld een tumorcel), die de dichtstbijzijnde cel, Y (bijvoorbeeld een T-cel), binnen een bepaalde straal rond cel X ontmoet.
- Bereken het gebied onder de empirische curve om een numerieke waarde te verkrijgen die de tumorinfiltratie van CD3+ T-cellen rond de tumorcellen11 vertegenwoordigt (figuur 6C). Gebruik andere ruimtelijke beschrijvende functies zoals de F-functie of J-functie12.
- Immunoscore analyse
- Bereken de Immunoscore (I), ontwikkeld door het team van Galon7,8, door gebruik te maken van de dichtheid van CD3+ en CD8+ T-cellen in het midden van de tumor en de invasieve marge van de tumor.
OPMERKING: De score varieert van I0 tot I4. Een lage dichtheid van zowel CD3+ als CD8+ T-cellen in het midden en de marge van de tumor is geassocieerd met een score van I0, terwijl een hoge dichtheid van CD3+ en CD8+ T-cellen in beide regio's geassocieerd is met een score van I4. Onlangs werd de prognostische impact van de Immunocore gevalideerd in een studie met monsters van 2.681 stadium I-III darmkankerpatiënten uit 14 centra in 13 landen7. Om te worden berekend, vereist Immunoscore echter een chirurgisch gereseceerd monster dat zowel het centrum als de marge van de tumor bevat. Voor biopsieën, die meestal geen marge hebben, is onlangs een aan biopsie aangepaste Immunoscore ontwikkeld13. - Om de aan de biopsie aangepaste immunoscore te berekenen, converteert u de waarde van de CD3 + en CD8 + T-celdichtheid in een percentiel en gebruikt u vervolgens het gemiddelde percentiel van CD3 + - en CD8 + T-cellen voor het scoren in een van de drie categorieën (d.w.z. laag, gemiddeld en hoog)13.
- Bereken de Immunoscore (I), ontwikkeld door het team van Galon7,8, door gebruik te maken van de dichtheid van CD3+ en CD8+ T-cellen in het midden van de tumor en de invasieve marge van de tumor.
- Hotspot analyse
- Gebruik hotspotanalyse, met behulp van de quadratcount-functie (spatstat)10, om de dichtheden van verschillende celtypen in het meest geïnfiltreerde gebied van het weefsel te vergelijken. Het is bijvoorbeeld mogelijk om een "Immunoscore-achtige" score te berekenen met behulp van de waarde van de CD3- en CD8 T-celdichtheid van de meest geïnfiltreerde vierkanten van het weefsel (figuur 7). Pas deze methode toe voor de analyse van elk celtype met een niet-homogene verdeling over het weefsel.
- Dichtheidsanalyse
Representative Results
Volgens dit protocol moeten verschillende parameters worden onderzocht om ervoor te zorgen dat het weefsel correct wordt gekleurd. Ten eerste moet de TSA-kleuring een goed dynamisch bereik weergeven bij gebruik van lage belichtingstijden (meestal 2-100 ms) tijdens het scanproces. Een lage belichtingstijd impliceert dat de versterking correct is uitgevoerd tijdens de reactie met HRP. Voor antigenen gekleurd met het secundaire antilichaam direct gekoppeld aan het fluorochroom, kan de belichtingstijd veel langer zijn, wat kan leiden tot fotobleaching (een afname van de signaalintensiteit als gevolg van een lange blootstellingstijd). Ten tweede is het belangrijk om te controleren of elke kleuring een hoge SNR vertoont. Een hoog achtergrondsignaal met een laag antigeensignaal kan een aanwijzing zijn dat het primaire antilichaam niet specifiek genoeg is, dat de endogene peroxidasen niet correct zijn geïnactiveerd of dat één stap van het protocol niet adequaat is uitgevoerd. Ten derde is het, afhankelijk van de diascanner en de filtersets die voor de scan worden gebruikt, mogelijk om overlappingen tussen twee kleuren te zien (bijv. AF555, AF594 en AF647). Het kiezen van de juiste filtersets op de scanner en de juiste primaire antilichaamverdunning zijn cruciaal om mogelijke kruisdetecties te voorkomen. Kwaliteitscontrole bestaat uit de detectie van enkele gekleurde cellen voor elke marker op het gescande bestand. Ten slotte is het ook belangrijk om een positieve en negatieve controle toe te voegen voor elke batch kleuring. Voor immuuncellen is de amandel een goede positieve controle. Een representatief resultaat van optimale kleuring is weergegeven in figuur 1.
Figuur 1: Lokaal gevorderde endeldarmkanker gekleurd door multiplex immunofluorescentie. Afkortingen: PD-1 = geprogrammeerd celdood eiwit 1; PD-L1 = Geprogrammeerde dood-ligand 1; ROR-γ = RAR-gerelateerde weesreceptor gamma; CD3 = cluster van differentiatie 3; hPanCK = humaan pan-cytokeratine. Elke antigeenkleuring wordt gescand in grijstinten en de kleuren in de figuur zijn pseudokleuren. Schaal balk lage vergroting: 200 μm; schaalbalk hoge vergroting: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kern- en kleuringsdetectie van een lokaal gevorderde endeldarmkanker met behulp van beeldanalysesoftware. Zonder de parameter percentage volledigheid correct in te stellen, detecteert de software twee CD8 + -cellen (groene cirkel) omdat ze dicht bij elkaar liggen, maar slechts één cel is gekleurd. Het gebruik van 70% volledigheid helpt om deze vals-positieve detectie te voorkomen. Groen = hPanCK; Geel = CD3; Oranje = CD8. Schaalbalk: 100 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Beeldanalyse en R dot-plot reconstitutie van een lever colorectale kanker metastase. Op de multiplexkleuring (links) is menselijke pancytokeratine geel, CD3 is groen, CD8 is lichtblauw en IDO is oranje. Op de dot-plot (rechts) zijn menselijke pan-cytokeratine + -cellen geel, CD3 + CD8-cellen zijn groen, CD3 + CD8 + -cellen zijn blauw en IDO + -cellen zijn oranje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Analyse van een chirurgische sectie van een HNSCC. (A) Een chirurgische sectie van een HNSCC. Kankercellen zijn zichtbaar in het groen. Peri-tumorale cellen worden gevisualiseerd rond de tumoreilandjes (CD3 in geel en CD8 in paars). (B) Het centrum van de tumor (in geel met een zwarte rand) wordt bioinformatisch berekend door het k-nabijste-buuralgoritme op basis van de afstand tussen de tumoreilanden van een enkel gebied. Rond dit gebied wordt een invasieve marge (lichtgeel met een grijze rand) berekend op een willekeurige basis van 500 μm. (C) Invasieve T-cellen worden gemarkeerd met zwarte stippen in het midden van de tumor en grijze stippen in de invasieve marge. Andere T-cellen worden gemarkeerd in lichtgroene stippen. Schaalbalk: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Heatmap van de dichtheid van verschillende celtypen van lokaal gevorderde rectale kankerbiopten. De heatmap is getekend met behulp van unsupervised clustering van de dichtheden van verschillende celtypen van verschillende multiplexpanelen met het ComplexHeatmap-pakket. Schalen en centreren werden gebruikt voor normalisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Afstanden van de CD4+ en CD8+ cellen tot elke IDO+ of tumorcel. Menselijke pan-cytokeratine+ cellen zijn geel, CD3+CD8− cellen zijn groen, CD3+CD8+ cellen zijn blauw, en IDO+ cellen zijn oranje. (A) De dichtstbijzijnde afstand tussen tumorcellen en elke CD8+ T-cel. (B) Barplots van de afstanden tussen IDO+-cellen en elke CD8+ T-cel (blauw) of CD4+ T-cel (groen). (C) Voorbeeld van een monster geanalyseerd met de G-kruisfunctie. De y-as toont de waarschijnlijkheid dat een tumorcel een CD3+ lymfocyt tegenkomt in een straal variërend van 0-200 μm rond de tumorcel. Er worden drie curven getoond; de theoretische kromme is in gestippeld groen (Poissonverdeling), de gecorrigeerde empirische kromme met km-correctie is in zwart en de gecorrigeerde empirische curve met randcorrectie is in gestippeld rood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Illustratie van een Quadratcount. Grensberekening en quadratcount werden uitgevoerd met behulp van het spatstats-pakket. De meest geïnfiltreerde pleinen (hotspots) kunnen worden gebruikt voor downstream-statistieken. CD4 is in groen, CD8 is in rood en tumorcellen zijn in geel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Antilichaamverdunning en antigeen retrieval optimalisatie. Chromogene detectie van PD-1 met behulp van drie verschillende verdunningen en twee verschillende antigeen retrieval oplossingen van het primaire antilichaam (Citraat pH 6 en EDTA pH 9). Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Primair antilichaam | Verdunning | Antigeen ophalen | Secundair antilichaam | Fluorochroom | Positie |
| PD-1 | 1/100 | EDTA (pH 9) | Anti-konijn | Af647 | 1 |
| PD-L1 | 1/1000 | EDTA (pH 9) | Anti-konijn | Af488 | 2 |
| ROR-γ | 1/200 | EDTA (pH 9) | Anti-muis | At0-425 | 3 |
| CD3 | 1/100 | Citraat (pH 6) | Anti-konijn | AF555 | 4 |
| hPanCK | 1/50 | Citraat (pH 6) | Anti-muis gekoppeld met AF750 | 5 | |
Tabel 1: Voorbeeld van een geoptimaliseerd multiplexpaneel. Afkortingen: PD-1 = geprogrammeerd celdood eiwit 1; PD-L1 = Geprogrammeerde dood-ligand 1; ROR-γ = RAR-gerelateerde weesreceptor gamma; CD3 = cluster van differentiatie 3; hPanCK = humaan pan-cytokeratine; AF = AlexaFluor; EDTA = ethyleendiaminetetra-azijnzuur. CD3 wordt gebruikt om T-lymfocyten te detecteren; PD-1 wordt gebruikt om uitgeputte lymfocyten te detecteren; ROR-γ wordt gebruikt om Th-17 te detecteren; en hPanCK wordt gebruikt om tumorcellen te detecteren. De positiekolom geeft de volgorde aan waarin de sequentiële multiplex moet worden uitgevoerd.
Discussion
De belangrijkste parameters waarmee rekening moet worden gehouden om multiplexkleuring te optimaliseren, zijn de verdunning, de specificiteit en het ophalen van antigeen dat voor elk primair antilichaam wordt gebruikt. Voordat een multiplexprotocol wordt gestart, moet de optimale verdunning en optimale epitoopoppunctie van elk primair antilichaam (pH 6 of pH 9) worden getest met behulp van chromogene kleuring (DAB). We adviseren om drie verdunningen te testen voor elke antigeenophaalbuffer: de verdunning die meestal wordt gespecificeerd door het merk dat het antilichaam commercialiseert, dezelfde verdunning tweevoudig gedeeld en dezelfde verdunning tweevoudig vermenigvuldigd (figuur 8). Het kiezen van de juiste verdunning is een zeer belangrijke stap voor het verifiëren van de antilichaamspecificiteit en het optimaliseren van de signaal-ruisverhouding (SNR) van de kleuring. Na het kiezen van de juiste verdunning in de DAB, moet dezelfde verdunning worden getest voor elk primair antilichaam met behulp van uniplex TSA. Zodra de verdunning en epitoopopbuffer voor elke antigeenkleuring zijn geselecteerd, is het ook belangrijk om de volgorde van de multiplex correct in te stellen; In het bijzonder zijn sommige antigenen beter gekleurd op de eerste positie en andere op de laatste positie. We raden aan om de multiplex-etikettering te testen met behulp van alle mogelijke ordepermutaties om te kiezen welke antigeenkleuring het eerst, tweede, enz. Moet komen. Dit is ook een zeer belangrijke stap omdat sommige fragiele antigenen kunnen worden afgebroken na verschillende rondes van epitoop retrieval, en sommige antigenen zijn beter gekleurd na verschillende rondes van epitoop retrieval. De SNR is bijvoorbeeld altijd hoger in de laatste positie voor CD3 en in de eerste positie voor PD-1 kleuring. Bovendien kan de kleuring van verschillende co-gelokaliseerde antigenen worden belemmerd door een paraplu-effect (de verzadiging van tyramide-reactieve plaatsen). Dit kan worden afgezwakt door de tyramideconcentratie te verlagen. Wanneer de expressie van het ene antigeen wordt geconditioneerd door de expressie van een ander (CD8 alleen aanwezig op CD3-tot expressie brengende T-cellen), adviseren wij om het antigeen met de breedste expressie (CD3 in dit geval) na het andere te kleuren. Ten slotte is het kiezen van het juiste fluorochroom voor elke antigeenkleuring op basis van de specifieke kenmerken van de scanner ook een belangrijke stap om kruisdetectie te voorkomen.
De grote voordelen van deze techniek zijn de versterking en de verkregen signaal-ruisverhouding. Deze techniek heeft echter een beperking, namelijk dat de kleuring sequentieel is en de fluorochromen covalent aan het weefsel zijn gebonden. Niettemin is het na het uitvoeren van alle tyramidesignaalversterkingsrondes ook mogelijk om een laatste kleuring toe te voegen met een secundair antilichaam dat direct gekoppeld is aan een fluorochroom (geen TSA). In sommige panelen hebben we deze methode gebruikt om kleuring toe te voegen in het 750-kanaal. Dit was nodig omdat er op dat moment geen tyramide-AF750 in de handel verkrijgbaar was. Van belang is dat de tijd van blootstelling (tijdens de scan) van het antigeen gekleurd met AF750 veel langer zal zijn dan voor de andere antigenen gekleurd met TSA. In dat geval adviseren wij om een sterk tot expressie gebracht eiwit zoals cytokeratine te kleuren of de concentratie van het primaire antilichaam te verhogen. Door dat te doen, is het mogelijk om maximaal vijf tot zes antigenen per dia in één batch te kleuren, afhankelijk van de fluorescentiescanner.
In tegenstelling hiermee gebruiken verschillende commercieel beschikbare technieken seriële kleuring met verschillende rondes van kleuren, scannen en strippen of fotobleken om het aantal antigenen te verbeteren dat op één enkele weefselsectie kan worden gekleurd. Deze technieken zijn echter vaak tijdrovend, duur, hebben geen signaalversterking, vereisen geavanceerde computationele stappen om de seriële scans correct samen te voegen en kunnen, in onze ervaring, onomkeerbare weefselschade veroorzaken als gevolg van de vele procedurestappen. Niettemin is gemeld dat tot 30 antigenen op één enkel weefsel kunnen worden gekleurd met behulp van deze methode14.
Kortom, onze methode is een robuuste, reproduceerbare, gebruiksvriendelijke en kosteneffectieve immunohistofluorescentietechniek die kan worden gebruikt in elk laboratorium met een fluorescentiediascanner. Elk gecommercialiseerd primair antilichaam dat geschikt is voor IHC kan worden gebruikt en de panelen zijn niet specifiek voor commerciële kits. De beeldanalyse kan worden uitgevoerd op verschillende programma's, waaronder open-source programma's zoals QuPath en R. We denken echter dat deze methode in de toekomst zelfs kan worden verbeterd voor grote antigeenpanelen, waardoor seriële kleuring / scannen van dezelfde dia met verschillende panelen antigenen en met het voordeel van signaalversterking mogelijk is.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
De auteurs willen Dr. Derouane F bedanken voor haar hulp en steun. Nicolas Huyghe is research fellow en wordt ondersteund door een beurs van het Nationaal Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (Télévie/FNRS 7460918F).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD3 primary antibody | Abcam | ab16669 | rabbit monocolonal |
| anti-CD8 primary antibody | DAKO | M710301 | mouse monoclonal |
| anti-hPanCK primary antibody | DAKO | M3515 | mouse monoclonal |
| anti-PD-1 primary antibody | Cell Signalling | D4W2J | rabbit monocolonal |
| anti-PD-L1 primary antibody | Cell Signalling | 13684 | rabbit monocolonal |
| anti-RORC primary antibody | Sigma | MABF81 | mouse monoclonal |
| ATTO-425 | ATTOtec | ||
| Axioscan Z1 | Zeiss | Light source: Colibri 7 (385, 430, 475, 555, 590, 630, 735 nm) Filtersets: Excitation 379/34 – beam splitter 409 – emission 440/40; Excitation 438/24 – beam splitter 458 – emission 483/32; Excitation 490/20 – beam splitter 505 – emission 525/20; Excitation 546/10 – beam splitter 556 – emission 572/23; Excitation 592/21 – beam splitter 610 – emission 630/30; Excitation 635/18 – beam splitter 652 – emission 680/42; Excitation 735/40 – beam splitter QBS 405 + 493 + 611 + 762 - emission QBP 425/30 + 524/51 + 634/38 + 785/38; Objective: Plan-Apochromat 20x/0.8; Camera : Orca Flash 4.0 V3 | |
| Borosilicate Cover Glass | VWR | 631-0146 | |
| Envision+ anti-mouse | DAKO | K4001 | |
| Envision+ anti-rabbit | DAKO | K4003 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 750 | ThermoFischer | A-21037 | |
| HALO software | Indicalabs | ||
| Hoescht | Sigma | 14533 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisherscientific/Epredia | 10149870 | |
| Tyramide-AF488 | ThermoFischer | B40953 | |
| Tyramide-AF555 | ThermoFischer | B04955 | |
| Tyramide-AF647 | ThermoFischer | B04958 |
References
- Ge, P., et al. Profiles of immune cell infiltration and immune-related genes in the tumor microenvironment of colorectal cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109228 (2019).
- Fridman, W. H. The immune microenvironment as a guide for cancer therapies. Oncoimmunology. 1 (3), 261-262 (2012).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: Impact on clinical outcome. in Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Calu, V., et al. Key biomarkers within the colorectal cancer related inflammatory microenvironment. Scientific Reports. 11 (1), 7940 (2021).
- Havel, J. J., Chowell, D., Chan, T. A. The evolving landscape of biomarkers for checkpoint inhibitor immunotherapy. Nature Reviews. Cancer. 19 (3), 133-150 (2019).
- Pages, F., et al. International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study. Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).
- Mlecnik, B., et al. Integrative analyses of colorectal cancer show immunoscore is a stronger predictor of patient survival than microsatellite instability. Immunity. 44 (3), 698-711 (2016).
- Gu, Z., Eils, R., Schlesner, M. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data. Bioinformatics. 32 (18), 2847-2849 (2016).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial Point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2022).
- Barua, S., et al. Spatial interaction of tumor cells and regulatory T cells correlates with survival in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 117, 73-79 (2018).
- Parra, E. R. Methods to determine and analyze the cellular spatial distribution extracted from multiplex immunofluorescence data to understand the tumor microenvironment. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 668340 (2021).
- El Sissy, C., et al. A diagnostic biopsy-adapted immunoscore predicts response to neoadjuvant treatment and selects patients with rectal cancer eligible for a watch-and-wait strategy. Clinical Cancer Research. 26 (19), 5198-5207 (2020).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
