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Cancer Research

ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के नैदानिक और जैविक मूल्यांकन के लिए स्थानिक छवि विश्लेषण के साथ संयुक्त मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65220
Automatic Translation
1, 1, 1, 4, 1, 2,3, 4, 1,5
1Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC), Pôle MIRO, Université Catholique de Louvain (UCLouvain), 2Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC), Pôle de Pneumologie, ORL et Dermatologie (PNEU), Université Catholique de Louvain (UCLouvain), 3Division of Pneumology, Cliniques Universitaires St-Luc, Université Catholique de Louvain (UCLouvain), 4IREC Imaging Platform, Université Catholique de Louvain (UCLouvain), 5Institut Roi Albert II, Department of Medical Oncology and Gastroenterology, Cliniques Universitaires St-Luc

Summary

इस लेख में, छवि विश्लेषण और स्थानिक विश्लेषण के साथ संयुक्त मैनुअल टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए) मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस (एमआईएफ) के लिए एक प्रोटोकॉल वर्णित है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगशाला में उपलब्ध स्लाइड स्कैनर के आधार पर प्रति स्लाइड दो से छह एंटीजन के धुंधला होने के लिए फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) वर्गों के साथ किया जा सकता है।

Abstract

ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) विभिन्न सेल प्रकारों से बना है, जैसे साइटोटोक्सिक प्रतिरक्षा कोशिकाएं और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कोशिकाएं। इसकी संरचना और कैंसर कोशिकाओं और पेरी-ट्यूमरल कोशिकाओं के बीच बातचीत के आधार पर, टीएमई कैंसर की प्रगति को प्रभावित कर सकता है। ट्यूमर और उनके जटिल माइक्रोएन्वायरमेंट के लक्षण वर्णन कैंसर रोगों की समझ में सुधार कर सकते हैं और वैज्ञानिकों और चिकित्सकों को नए बायोमाकर्स की खोज करने में मदद कर सकते हैं।

हमने हाल ही में कोलोरेक्टल कैंसर, सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा, मेलेनोमा और फेफड़ों के कैंसर में टीएमई के लक्षण वर्णन के लिए टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए) पर आधारित कई मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस (एमआईएफ) पैनल विकसित किए हैं। एक बार संबंधित पैनलों का धुंधला पन और स्कैनिंग पूरी हो जाने के बाद, नमूनों का विश्लेषण एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर किया जाता है। प्रत्येक सेल की स्थानिक स्थिति और धुंधलापन तब इस परिमाणीकरण सॉफ्टवेयर से आर में निर्यात किया जाता है। हमने आर स्क्रिप्ट विकसित की जो हमें न केवल कई ट्यूमर डिब्बों (जैसे ट्यूमर का केंद्र, ट्यूमर का मार्जिन और स्ट्रोमा) में प्रत्येक सेल प्रकार के घनत्व का विश्लेषण करने की अनुमति देती है, बल्कि विभिन्न सेल प्रकारों के बीच दूरी-आधारित विश्लेषण भी करती है।

यह विशेष वर्कफ़्लो शास्त्रीय घनत्व विश्लेषण में एक स्थानिक आयाम जोड़ता है जो पहले से ही कई मार्करों के लिए नियमित रूप से किया जाता है। एमआईएफ विश्लेषण वैज्ञानिकों को कैंसर कोशिकाओं और टीएमई के बीच जटिल बातचीत की बेहतर समझ रखने और उपचार के लिए प्रतिक्रिया के नए पूर्वानुमानित बायोमाकर्स की खोज करने की अनुमति दे सकता है, जैसे कि प्रतिरक्षा चेकपॉइंट इनहिबिटर, और लक्षित उपचार।

Introduction

लक्षित चिकित्सा और प्रतिरक्षा चेकपॉइंट इनहिबिटर के विकास के साथ, कैंसर कोशिकाओं और उनके ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के बीच बातचीत को बेहतर ढंग से चिह्नित करना अत्यंत महत्वपूर्ण हो गया है, और यह वर्तमान में ट्रांसलेशनल अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है। टीएमई विभिन्न सेल प्रकारों के ढेरों से बना है, जिसमें कैंसर कोशिकाओं और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कोशिकाओं को लक्षित करने वाली प्रतिरक्षा साइटोटोक्सिक कोशिकाओं का संतुलन होता है जो ट्यूमर के विकास और आक्रामकता 1,2,3,4 का पक्ष ले सकते हैं। इस जटिल वातावरण के लक्षण वर्णन से कैंसर रोगों की समझ में सुधार हो सकता है और वैज्ञानिकों और चिकित्सकों को भविष्यके उपचार के लिए रोगियों का बेहतर चयन करने के लिए नए पूर्वानुमान और रोगसूचक बायोमार्कर की खोज करने में मदद मिल सकती है। उदाहरण के लिए, गैलोन और उनकी टीम ने इम्यूनोस्कोर विकसित किया, जो एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्कोरिंग विधि है जिसका उपयोग भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर के रूप में किया जा सकता है। इम्यूनोस्कोर की गणना आक्रामक मार्जिन में सीडी 3 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं के घनत्व का उपयोग करके और ट्यूमर 7,8 के केंद्र में की जाती है।

पिछले दशकों में, एमआईएफ के लिए वाणिज्यिक समाधान विकसित किए गए हैं, लेकिन ये अक्सर महंगे होते हैं और एंटीजन के विशिष्ट पैनलों के लिए डिज़ाइन किए जाते हैं। अकादमिक और ट्रांसलेशनल अनुसंधान में एंटीजन के विशिष्ट पैनलों की आवश्यकता को दूर करने के लिए, हमने एफएफपीई ट्यूमर वर्गों पर एमआईएफ करने के लिए एक लागत प्रभावी विधि विकसित की, जिससे मानव और माउस के नमूनों पर सेल नाभिक में जोड़े गए दो से छह एंटीजन के धुंधलापन की अनुमति मिली।

एक बार जब पूरे ऊतक वर्गों को प्रतिदीप्ति स्लाइड स्कैनर के साथ दाग दिया जाता है और स्कैन किया जाता है, तो नमूनों का विश्लेषण बड़े पिरामिड डेटासेट का समर्थन करने वाले कई छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा किया जा सकता है। अंत में, कच्चे डेटा का उपयोग सांख्यिकीय कंप्यूटिंग और आर सॉफ्टवेयर (v.4.0.2) जैसे ग्राफिक्स के लिए एक वातावरण में किया जा सकता है ताकि घनत्व और स्थानिक-आधारित विश्लेषण किया जा सके।

पांच-मार्कर धुंधला होने के लिए अनुकूलित एक प्रोटोकॉल, साथ ही नए पैनलों को अनुकूलित करने के लिए ट्रिक्स और युक्तियां, इस पांडुलिपि में प्रस्तुत की गई हैं। इसके अलावा, सांख्यिकीय और स्थानिक विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले छवि विश्लेषण और आर कार्यों के विस्तृत चरणों को समझाया गया है।

Protocol

वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए सभी नमूने स्थानीय आचार समितियों द्वारा अनुमोदित और सक्षम प्राधिकारी द्वारा अधिकृत अध्ययन से आए थे। अध्ययन में सभी प्रतिभागियों ने लिखित सूचित सहमति प्रदान की। परीक्षण ClinicalTrials.gov (एनसीटी03608046) के साथ पंजीकृत है।

1. मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. एफएफपीई सेक्शनिंग;
    1. ऊतक को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ठीक करें, और पैराफिन में निश्चित ऊतक को एम्बेड करें।
    2. 5 μm अनुभाग ों को काटें, और उन्हें चिपकने वाला माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें।
    3. कमरे के तापमान (आरटी) पर रात भर स्लाइड सुखाएं।
  2. डिपैराफिनाइजेशन और अंतर्जात पेरोक्सीडेज निषेध।
    1. टोल्यूनि (प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x) और मेथनॉल (प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x) में स्लाइड को डुबोकर ऊतकों को फ्यूम हुड के नीचे डुबोकर ऊतकों को डीवैक्स करें।
    2. फ्यूम हुड के तहत 20 मिनट के लिए मेथनॉल में पतला 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में स्लाइड को डुबोकर अंतर्जात पेरोक्सीडेज को रोकें।
    3. आसुत (डी) एच2ओ (3 मिनट के लिए 1x) में स्लाइड को कुल्ला करें।
  3. मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
    1. स्लाइड्स को 300 एमएल धुंधला जार में डुबोएं जिसमें 10 एमएम साइट्रेट (पीएच 6) या ईडीटीए (पीएच 9) बफर होता है जो 0.1% ट्राइटनएक्स -100 के साथ पूरक होता है।
      नोट: उपयोग किया गया बफर (पीएच 6 या पीएच 9) एंटीजन दाग पर निर्भर करता है ( तालिका 1 देखें)।
    2. ढक्कन के साथ धुंधला जार को माइक्रोवेव में अधिकतम शक्ति (जैसे, 900 डब्ल्यू) पर 3-5 मिनट के लिए रखें जब तक कि बफर उबलना शुरू न हो जाए।
      नोट: उबलने के लिए इष्टतम समय माइक्रोवेव और बफर की मात्रा पर निर्भर करता है। सही समय खोजने के लिए समायोजन आवश्यक हो सकता है। कुछ नाजुक एंटीजन या नाजुक और कम अनुयायी नमूनों (जैसे, ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड) के लिए, माइक्रोवेव उबलना बहुत कठोर हो सकता है। इस मामले में, इसके बजाय एक प्रेशर कुकर का उपयोग किया जा सकता है।
    3. 15 मिनट के लिए कम शक्ति (जैसे, 90 डब्ल्यू) पर माइक्रोवेव में बंद धुंधला जार डालकर बफर को उबलते तापमान पर रखें।
    4. माइक्रोवेव को 90 सेकंड के लिए अधिकतम शक्ति पर रखकर हीटिंग के अंतिम चरण का पालन करें।
    5. जार को माइक्रोवेव से निकालें, और आरटी पर 15 मिनट के लिए बफर को ठंडा होने दें।
    6. स्लाइड को 3x को 5 मिनट के लिए dH2O में और 1x को 5 मिनट के लिए ट्राइस-बफर्ड सेलाइन में 0.1% ट्वीन 20 (TBS-T) से युक्त कुल्ला करें।
    7. एक पेपर टॉवल पर स्लाइड ्स को ब्लॉट करके टीबीएस-टी को हटा दें।
    8. स्लाइड्स (फ्लैट) को धुंधला कक्ष ट्रे या माइक्रोस्कोप स्लाइड बॉक्स पर रखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    9. एक हाइड्रोफोबिक पेन के साथ ऊतक को घेरें।
    10. 30 मिनट के लिए टीबीएस-टी में घुलने वाले 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ ऊतक को कवर करके गैर-विशिष्ट बाध्यकारी साइटों को अवरुद्ध करें।
    11. एक पेपर टॉवल पर स्लाइड ्स को ब्लॉट करके ब्लॉकिंग बफर को हटा दें।
      नोट: ब्लॉकिंग चरण के बाद स्लाइड ्स को कुल्ला न करें।
    12. ऊतक को प्राथमिक एंटीबॉडी (तालिका 1 देखें) के साथ 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जो ऊतक को लगभग 300 μL घोल के साथ कवर करके 1% बीएसए टीबीएस-टी में पतला होता है।
    13. प्रत्येक स्लाइड को 3 x के लिए TBS-T के साथ 3 मिनट के लिए धो लें।
    14. ऊतक को लगभग 300 μL घोल के साथ कवर करके पॉली-एचआरपी द्वितीयक एंटीबॉडी ( तालिका 1 देखें) के साथ 40 मिनट के लिए ऊतक को इनक्यूबेट करें।
    15. टीबीएस-टी के साथ 3 मिनट के लिए स्लाइड को 3x से धो लें।
    16. ऊतक को फ्लोरोक्रोम-टायरामाइड अभिकर्मक (तालिका 1 देखें) के साथ 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जो बोरेट बफर (0.1 एम बोरेट, पीएच 7.8, 3 एम एनएसीएल) में 200 गुना पतला होता है, जो ऊतक को लगभग 300 μL घोल के साथ कवरकरके 0.003% एच 2 ओ2 के साथ पूरक होता है।
    17. टीबीएस-टी के साथ 3 मिनट के लिए स्लाइड को 3x से धो लें।
    18. चरण 1.3.1-1.3.16 को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी टीएसए धुंधला न हो जाए।
    19. अंतिम प्राथमिक एंटीबॉडी (तालिका 1 देखें) के साथ ऊतक को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जो 1% बीएसए टीबीएस-टी में पतला होता है।
      नोट: चूंकि इनक्यूबेशन रात भर है, इसलिए धुंधला कक्ष ट्रे या माइक्रोस्कोप स्लाइड बॉक्स को कवर करना और बॉक्स के नीचे (स्लाइड के नीचे) एक पेपर तौलिया पर डीएच2ओ जोड़ना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इनक्यूबेशन के दौरान ऊतक सूख न जाएं।
    20. टीबीएस-टी के साथ प्रत्येक ऊतक को 5 मिनट के लिए 3 गुना कुल्ला करें।
    21. द्वितीयक एंटीबॉडी (सीधे फ्लोरोक्रोम के साथ युग्मित) के साथ 120 मिनट के लिए ऊतक को 1% बीएसए टीबीएस-टी में 200 गुना पतला किया जाता है।
    22. टीबीएस-टी के साथ प्रत्येक ऊतक को 5 मिनट के लिए 3 गुना कुल्ला करें।
    23. 10% बीएसए टीबीएस-टी में 1,000 गुना पतला बिसबेंज़िमाइड (20 एमएम) में 5 मिनट के लिए ऊतक को इंजेक्ट करके नाभिक को दाग दें।
      नोट: बिस्बेंज़िमाइड को डीएपीआई द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, लेकिन बाद वाला अधिक विषाक्त है और इसे फ्यूम हुड के तहत सावधानी पूर्वक संभाला जाना चाहिए।
    24. डीएच2ओ में प्रत्येक 3 मिनट के लिए ऊतक 3 x कुल्ला करें।
    25. फ्लोरेसेंस माउंटिंग मीडियम और बोरोसिलिकेट कवर ग्लास का उपयोग करके स्लाइड्स को माउंट करें।

2. स्लाइड स्कैनिंग

  1. स्लाइड्स को 20x आवर्धन पर प्रतिदीप्ति स्लाइड स्कैनर पर स्कैन करके डिजिटल करें (स्लाइड स्कैनर विवरण सामग्री की तालिका में प्रदान किए गए हैं)।
    नोट: एक इष्टतम मल्टीप्लेक्स का एक प्रतिनिधि स्कैन चित्रा 1 में दिखाया गया है।

3. छवि विश्लेषण

  1. स्कैन को एक छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (फ़ाइल > ओपन इमेज) में आयात करें।
  2. क्लासिफायर टैब पर जाएं, और डेंसनेट एआई वी 2 प्लगइन का चयन करें।
  3. एक छवि में लगभग 500 नाभिक को घेरकर नाभिक को पहचानने के लिए डेंसनेट एआई वी 2 प्लगइन को प्रशिक्षित करें।
  4. एआई को एक ही बैच से कई अन्य स्लाइडों पर प्रशिक्षित करें और कई स्लाइडों (लगभग 10) पर कई नाभिकों (50) को घेरकर एमआईएफ धुंधला करने के विभिन्न बैचों को प्रशिक्षित करें।
    नोट: एआई प्लगइन का उपयोग करने के तरीके पर विस्तृत निर्देश सॉफ्टवेयर मैनुअल में पाया जा सकता है। नाभिक का पता लगाने के लिए एआई का उपयोग करना वैकल्पिक है। उपयोग किए गए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के आधार पर नाभिक का पता लगाने के अन्य तरीके उपलब्ध हैं।
  5. प्रशिक्षित AI (क्लासिफायर क्रियाएँ > सहेजें) सहेजें.
  6. एनोटेशन टैब पर जाएं, और पेन एनोटेशन टूल का उपयोग करके रुचि के प्रत्येक क्षेत्र (आरओआई), जैसे ट्यूमर के केंद्र और ट्यूमर के मार्जिन के लिए एक एनोटेशन बनाएं।
  7. यदि आवश्यक हो, तो बहिष्करण एनोटेशन टूल के साथ सिलवटों वाले क्षेत्रों और धुंधले दिखाई देने वाले क्षेत्रों को हटा दें।
    नोट: एमआईएफ के लिए उपयोग किए जाने वाले एक खंड से सटे एक खंड का हेमटोक्सिलिन-ईओसिन धुंधला होना एमआईएफ धुंधला होने से पहले किया जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नमूने में ट्यूमर कोशिकाएं मौजूद हैं और आरओआई निर्धारित करने के लिए एनाटोमोपैथोलॉजिस्ट की मदद करें।
  8. विश्लेषण टैब पर जाएँ, और हाईप्लेक्स एफएल एल्गोरिदम (हाईप्लेक्स एफएल > सेटिंग्स एक्शन > लोड) का चयन करें।
  9. डाई चयन टैब का चयन करें, और रुचि की डाई का चयन करें।
  10. परमाणु पहचान टैब में, परमाणु विभाजन प्रकार पर जाएँ, और AI कस्टम का चयन करें।
  11. परमाणु विभाजन क्लासिफायर में, चरण 3.5 पर सहेजे गए AI का चयन करें।
  12. मेम्ब्रेन और साइटोप्लाज्म डिटेक्शन टैब में, अधिकतम साइटोप्लाज्म त्रिज्या (इस अध्ययन में, 1.5 का उपयोग किया गया था) और झिल्ली रंगों की संख्या को चुना।
  13. प्रत्येक डाई के लिए, नाभिक सकारात्मक सीमा, साइटोप्लाज्म सकारात्मक दहलीज और झिल्ली सकारात्मक सीमा का चयन करें।
    नोट: प्रत्येक धुंधलापन के लिए सीमा अलग है और स्लाइड के प्रत्येक बैच और प्रत्येक एंटीजन दाग के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। दृश्य सेटिंग्स उपकरण (दृश्य > दृश्य सेटिंग्स) का उपयोग करके तीव्रता शिखर (दाईं ओर) के अंत में तीव्रता मान का उपयोग करके पर्याप्त सीमा का चयन करने में मदद मिल सकती है।
  14. प्रत्येक डाई के लिए, पूर्णता मूल्यों के नाभिक, झिल्ली और साइटोप्लाज्म प्रतिशत का चयन करें।
    नोट: यह पैरामीटर गलत सकारात्मक पहचान से बचने के लिए महत्वपूर्ण है जब अलग-अलग धुंधला होने वाली दो कोशिकाएं एक दूसरे के करीब होती हैं (चित्रा 2)।
  15. एल्गोरिथ्म सहेजें (सेटिंग्स क्रियाएँ > सहेजें).
  16. आरओआई का विश्लेषण करें (एनोटेशन परत > विश्लेषण करें)।
  17. परिणाम टैब पर जाएँ, और ऑब्जेक्ट डेटा (ctrl + A) में सभी डेटा का चयन करें।
  18. डेटा को .csv स्वरूप में निर्यात करें (ऑब्जेक्ट डेटा निर्यात > राइट क्लिक > करें. सीएसवी)।
    नोट: इस तालिका में स्थिति (Xmin, Xmax; Xmin, Xmax; Ymin, Ymax) और प्रत्येक विश्लेषण किए गए सेल के प्रत्येक मार्कर की सकारात्मकता।

4. आर का उपयोग कर जैव सूचना विज्ञान

नोट: निम्नलिखित चरणों के बारे में अधिक विवरण प्रदान करने वाली एक आर स्क्रिप्ट GitHub (benidovskaya / Ring: मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के विश्लेषण के लिए पाइपलाइन) पर उपलब्ध है। [github.com])

  1. निर्यात की गई तालिका का उपयोग करके, पहले कोलोकलाइजेशन स्टेनिंग के आधार पर विभिन्न सेल प्रकारों को परिभाषित करें। उदाहरण के लिए, डबल-पॉजिटिव सीडी 3 + / सीडी 8 + कोशिकाओं द्वारा साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं को परिभाषित करें।
  2. फिर, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर और ggplot2 (चित्र 3). इन आंकड़ों का उपयोग करके, कई प्रकार के विश्लेषण किए जा सकते हैं:
    1. घनत्व विश्लेषण
      नोट: सबसे सरल विश्लेषण एक घनत्व विश्लेषण है।
      1. बायोप्सी या ऊतक के कुछ विशिष्ट क्षेत्र के लिए पूरी स्लाइड का उपयोग करके सभी सेल प्रकारों के लिए घनत्व विश्लेषण करें। उदाहरण के लिए, ट्यूमर के केंद्र में सीडी 3 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं के घनत्व और ट्यूमर के मार्जिन की गणना करें (चित्रा 4 ए-सी)।
      2. उन घनत्वों की गणना करने के लिए, प्रत्येक सेल के फेनोटाइप और निर्देशांक के साथ प्रति नमूना एक विशिष्ट डेटा फ्रेम का उत्पादन करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। आर पर एक क्लस्टरिंग फ़ंक्शन (के-निकटतम पड़ोसी) के माध्यम से, अध्ययन बायोप्सी की सीमाओं का उपयोग करके एक बहुभुज वस्तु बनाएं, और इसके अंदर सेल प्रकार के ब्याज के घनत्व की गणना करें।
        नोट: यह जैविक परिकल्पना के आधार पर विभिन्न स्थितियों (जैसे विभिन्न समय बिंदु, उपचार प्रकार, ऊतक प्रकार और उपचार की प्रतिक्रिया) और स्थानीयकरण (ट्यूमर का केंद्र, ट्यूमर का मार्जिन, स्ट्रोमा फाइब्रोसिस और नेक्रोसिस क्षेत्र) के बीच विभिन्न सेल प्रकारों के घनत्व की तुलना करने की अनुमति देता है। कैंसर कोशिकाओं, पेरी-ट्यूमरल कोशिकाओं और ट्यूमर-घुसपैठ करने वाली कोशिकाओं के बीच उच्च निकटता के कारण, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक ही समय में प्रतिरक्षा और कैंसर कोशिकाओं के रूप में डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं का पता लगा सकता है। उस स्थिति में, किसी को इन डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं का उल्लेख करके इस मुद्दे को जैव सूचना त्मक रूप से सही करने की आवश्यकता है। इस मामले में, सीडी 3 + सीडी 8 + साइटोकेराटिन + कोशिकाओं को साइटोटोक्सिक कोशिकाओं के रूप में टैग किया गया था क्योंकि साइटोकेराटिन सकारात्मकता घुसपैठ करने वाले लिम्फोसाइटों के आसपास ट्यूमर कोशिकाओं के कारण थी।
    2. हीटमैप्स
      1. विभिन्न पैनलों से प्रत्येक सेल प्रकार के घनत्व का उपयोग करके और एक सामान्यीकरण (जैसे, स्केलिंग सेंटरिंग) लागू करके, नमूनों की आबादी में सेल बहुतायत का प्रतिनिधित्व करने वाले हीटमैप (चित्रा 5) खींचें।
      2. सेल घनत्व के आधार पर पदानुक्रमित असुरक्षित क्लस्टरिंग का उपयोग करते हुए, समान टीएमई रचनाओं वाले क्लस्टर रोगी, और उपचार प्रतिक्रिया और अस्तित्व जैसे नैदानिक मापदंडों के साथ इन समूहों को सहसंबंधित करते हैं।
        नोट: हीटमैप और क्लस्टराइजेशन आसानी से आर कॉम्प्लेक्स हीटमैप पैकेज9 के साथ किया जा सकता है।
    3. स्थानिक कोशिका वितरण।
      1. कोशिकाओं (जैसे, प्रतिरक्षा और ट्यूमर कोशिकाओं) के बीच की दूरी की जैव सूचना त्मक गणना करें; चित्र 6 ए, बी) छवि विश्लेषण द्वारा प्रदान किए गए सेल निर्देशांक पर आधारित है। एक समूह के सभी नमूनों में सेल निकटता की तुलना करने के लिए रुचि के सेल प्रकारों के बीच औसत और औसत दूरी का उपयोग करें।
    4. स्थानिक वर्णनात्मक कार्य।
      1. सेल एक्स के चारों ओर एक निश्चित त्रिज्या के भीतर निकटतम सेल, एक्स (जैसे, एक ट्यूमर सेल), निकटतम सेल, वाई (जैसे, टी सेल) से मिलने की संभावना निर्धारित करने के लिए, आर स्पैटस्टेट पैकेज10 के माध्यम से उपलब्ध क्रॉस-टाइप निकटतम पड़ोसी जी-क्रॉस फ़ंक्शन का उपयोग करें।
      2. ट्यूमर कोशिकाओं11 (चित्रा 6 सी) के आसपास सीडी 3 + टी कोशिकाओं की ट्यूमर घुसपैठ का प्रतिनिधित्व करने वाले संख्यात्मक मान प्राप्त करने के लिए अनुभवजन्य वक्र के तहत क्षेत्र की गणना करें। अन्य स्थानिक वर्णनात्मक कार्यों जैसे एफ-फ़ंक्शन या जे-फ़ंक्शन12 का उपयोग करें।
    5. इम्यूनोस्कोर विश्लेषण
      1. ट्यूमर के केंद्र में सीडी 3 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं के घनत्व और ट्यूमर के आक्रामक मार्जिन का उपयोग करके गैलोन 7,8 की टीम द्वारा विकसित इम्यूनोस्कोर (आई) की गणना करें।
        नोट: स्कोर I0 से I4 तक होता है। केंद्र में सीडी 3 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं का कम घनत्व और ट्यूमर का मार्जिन आई0 के स्कोर से जुड़ा हुआ है, जबकि दोनों क्षेत्रों में सीडी 3 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं का उच्च घनत्व आई 4 के स्कोर से जुड़ा हुआ है। हाल ही में, इम्यूनोकोर के रोगसूचक प्रभाव को 13देशों में 14 केंद्रों से 2,681 चरण I-III कोलन कैंसर रोगियों के नमूनों के साथ एक अध्ययन में मान्य किया गया था। हालांकि, गणना करने के लिए, इम्यूनोस्कोर को ट्यूमर के केंद्र और मार्जिन दोनों से युक्त शल्य चिकित्सा से निकाले गए नमूने की आवश्यकता होती है। बायोप्सी के लिए, जिसमें आमतौर पर मार्जिन की कमी होती है, एक बायोप्सी-अनुकूलित इम्यूनोस्कोर हाल हीमें विकसित किया गया है।
      2. बायोप्सी-अनुकूलित इम्यूनोस्कोर की गणना करने के लिए, सीडी 3 + और सीडी 8 + टी सेल घनत्व के मूल्य को एक प्रतिशत में परिवर्तित करें, और फिर सीडी 3 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं के औसत प्रतिशत का उपयोग तीन श्रेणियों (यानी, कम, मध्यवर्ती और उच्च) में से एक में स्कोरिंग के लिए करें।
    6. हॉटस्पॉट विश्लेषण
      1. ऊतक के सबसे घुसपैठ वाले क्षेत्र में विभिन्न सेल प्रकारों के घनत्व की तुलना करने के लिए, क्वाडरैटकाउंट फ़ंक्शन (स्पैटस्टेट) 10 का उपयोग करके हॉटस्पॉट विश्लेषण का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, ऊतक के सबसे घुसपैठ वर्गों के सीडी 3 और सीडी 8 टी सेल घनत्व के मूल्य का उपयोग करके "इम्यूनोस्कोर जैसे" स्कोर की गणना करना संभव है (चित्रा 7)। ऊतक में एक गैर-सजातीय वितरण के साथ किसी भी सेल प्रकार के विश्लेषण के लिए इस विधि को लागू करें।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, यह सुनिश्चित करने के लिए कई मापदंडों की जांच की जानी चाहिए कि ऊतक सही ढंग से सना हुआ है। सबसे पहले, स्कैनिंग प्रक्रिया के दौरान कम एक्सपोजर समय (आमतौर पर 2-100 एमएस) का उपयोग करते समय टीएसए स्टेनिंग को एक अच्छी गतिशील सीमा प्रदर्शित करनी चाहिए। कम एक्सपोजर समय का अर्थ है कि एचआरपी के साथ प्रतिक्रिया के दौरान प्रवर्धन सही ढंग से किया गया है। द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ सीधे फ्लोरोक्रोम के साथ युग्मित एंटीजन के लिए, एक्सपोजर का समय बहुत लंबा हो सकता है, जिससे फोटोब्लीचिंग (लंबे समय तक एक्सपोजर समय के कारण सिग्नल की तीव्रता में कमी) हो सकती है। दूसरे, यह सत्यापित करना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक धुंधला एक उच्च एसएनआर प्रदर्शित करता है। कम एंटीजन सिग्नल के साथ एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत एक संकेत हो सकता है कि प्राथमिक एंटीबॉडी पर्याप्त विशिष्ट नहीं है, कि अंतर्जात पेरोक्सीडेज सही ढंग से निष्क्रिय नहीं थे, या प्रोटोकॉल का एक चरण पर्याप्त रूप से नहीं किया गया था। तीसरा, स्लाइड स्कैनर और स्कैन के लिए उपयोग किए जाने वाले फ़िल्टर सेट के आधार पर, दो रंगों (जैसे, एएफ 555, एएफ 594 और एएफ 647) के बीच ओवरलैप देखना संभव है। स्कैनर पर सही फिल्टर सेट चुनना और सही प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ना संभावित क्रॉस-डिटेक्शन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। गुणवत्ता नियंत्रण में स्कैन की गई फ़ाइल पर प्रत्येक मार्कर के लिए एकल दाग वाली कोशिकाओं का पता लगाना शामिल है। अंत में, धुंधला होने के प्रत्येक बैच के लिए एक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण जोड़ना भी महत्वपूर्ण है। प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए, टॉन्सिल एक अच्छा सकारात्मक नियंत्रण है। इष्टतम धुंधलापन का एक प्रतिनिधि परिणाम चित्र 1 में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा सना हुआ स्थानीय रूप से उन्नत रेक्टल कैंसर। संक्षेप: पीडी -1 = प्रोग्राम्ड सेल डेथ प्रोटीन 1; पीडी-एल 1 = प्रोग्राम्ड डेथ-लिगैंड 1; आरओआर -γ = आरएआर से संबंधित अनाथ रिसेप्टर गामा; सीडी 3 = भेदभाव का समूह 3; hPanCK = मानव पैन-साइटोकेराटिन। प्रत्येक एंटीजन धुंधला ग्रेस्केल में स्कैन किया जाता है, और आंकड़े में प्रस्तुत रंग छद्म रंग होते हैं। स्केल बार कम आवर्धन: 200 μm; स्केल बार उच्च आवर्धन: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्थानीय रूप से उन्नत रेक्टल कैंसर के नाभिक और धुंधला पता लगाना। पूर्णता पैरामीटर के प्रतिशत को सही ढंग से सेट किए बिना, सॉफ्टवेयर दो सीडी 8 + कोशिकाओं (हरे सर्कल) का पता लगाता है क्योंकि वे एक दूसरे के करीब हैं, लेकिन केवल एक सेल दागदार है। 70% पूर्णता का उपयोग इस झूठी सकारात्मक पहचान से बचने में मदद करता है। हरा = hPanCK; पीला = सीडी 3; नारंगी = सीडी 8। स्केल बार: 100 μm कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: यकृत कोलोरेक्टल कैंसर मेटास्टेसिस का छवि विश्लेषण और आर डॉट-प्लॉट पुनर्गठन। मल्टीप्लेक्स धुंधला (बाएं) पर, मानव पैन-साइटोकेराटिन पीले रंग में है, सीडी 3 हरे रंग में है, सीडी 8 हल्के नीले रंग में है, और आईडीओ नारंगी रंग में है। डॉट-प्लॉट (दाएं) पर, मानव पैन-साइटोकेराटिन + कोशिकाएं पीले रंग में होती हैं, सीडी 3 + सीडी 8 - कोशिकाएं हरे रंग में होती हैं, सीडी 3 + सीडी 8 + कोशिकाएं नीले रंग में होती हैं, और आईडीओ + कोशिकाएं नारंगी रंग में होती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक एचएनएससीसी के एक सर्जिकल अनुभाग का विश्लेषण। कैंसर कोशिकाएं हरे रंग में दिखाई देती हैं। पेरी-ट्यूमरल कोशिकाओं को ट्यूमर आइलेट्स (पीले रंग में सीडी 3 और बैंगनी में सीडी 8) के आसपास देखा जाता है। (बी) ट्यूमर का केंद्र (काली सीमा के साथ पीले रंग में) की गणना एक ही क्षेत्र से ट्यूमर द्वीपों के बीच की दूरी के आधार पर के-निकटतम-पड़ोसी एल्गोरिदम द्वारा जैव सूचना त्मक रूप से की जाती है। इस क्षेत्र के आसपास, एक आक्रामक मार्जिन (ग्रे बॉर्डर के साथ हल्का पीला) की गणना मनमाने ढंग से 500 μm आधार पर की जाती है। (सी) इनवेसिव टी कोशिकाओं को ट्यूमर के केंद्र में काले बिंदुओं और इनवेसिव मार्जिन में ग्रे डॉट्स के साथ हाइलाइट किया जाता है। अन्य टी कोशिकाओं को हल्के हरे रंग के बिंदुओं में हाइलाइट किया जाता है। स्केल बार: 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: स्थानीय रूप से उन्नत रेक्टल कैंसर बायोप्सी के विभिन्न सेल प्रकारों के घनत्व का हीटमैप। हीटमैप को कॉम्प्लेक्सहीटमैप पैकेज के साथ विभिन्न मल्टीप्लेक्स पैनलों से विभिन्न सेल प्रकारों के घनत्व के असुरक्षित क्लस्टरिंग का उपयोग करके तैयार किया गया था। सामान्यीकरण के लिए स्केलिंग और सेंटरिंग का उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: प्रत्येक आईडीओ + या ट्यूमरल सेल के लिए सीडी 4 + और सीडी 8 + कोशिकाओं की दूरी। मानव पैन-साइटोकेराटिन + कोशिकाएं पीले रंग में होती हैं, सीडी 3 + सीडी 8 - कोशिकाएं हरे रंग में होती हैं, सीडी 3 + सीडी 8 + कोशिकाएं नीले रंग में होती हैं, और आईडीओ + कोशिकाएं नारंगी रंग में होती हैं। (ए) ट्यूमर कोशिकाओं और प्रत्येक सीडी 8 + टी सेल के बीच निकटतम दूरी। (बी) आईडीओ + कोशिकाओं और प्रत्येक सीडी 8 + टी सेल (नीला) या सीडी 4 + टी सेल (हरा) के बीच की दूरी का बारप्लॉट। (सी) जी-क्रॉस फ़ंक्शन द्वारा विश्लेषण किए गए नमूने का उदाहरण। वाई-अक्ष ट्यूमर सेल के चारों ओर 0-200 μm से लेकर त्रिज्या में CD3+ लिम्फोसाइट का सामना करने वाले ट्यूमर सेल की संभावना को दर्शाता है। तीन मोड़ दिखाए गए हैं; सैद्धांतिक वक्र डॉटेड ग्रीन (पॉइसन वितरण) में है, किमी सुधार के साथ सही अनुभवजन्य वक्र काले रंग में है, और सीमा सुधार के साथ सही अनुभवजन्य वक्र डॉटेड लाल रंग में है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: एक क्वाडरैटकाउंट का चित्रण। स्पैटस्टैट्स पैकेज का उपयोग करके सीमा गणना और क्वाडरैटकाउंट किया गया था। सबसे अधिक घुसपैठ वाले वर्गों (हॉटस्पॉट) का उपयोग डाउनस्ट्रीम आंकड़ों के लिए किया जा सकता है। सीडी 4 हरे रंग में है, सीडी 8 लाल रंग में है, और ट्यूमर कोशिकाएं पीले रंग में हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: एंटीबॉडी कमजोर पड़ने और एंटीजन पुनर्प्राप्ति अनुकूलन। पीडी -1 का क्रोमोजेनिक पता लगाने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी (साइट्रेट पीएच 6 और ईडीटीए पीएच 9) के तीन अलग-अलग कमजोर पड़ने और दो अलग-अलग एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान ों का उपयोग किया जाता है। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राथमिक एंटीबॉडी तनूकरण एंटीजन पुनर्प्राप्ति। द्वितीयक एंटीबॉडी फ्लोरोक्रोम पद
PD-1 1/100 EDTA (pH 9) खरगोश विरोधी AF647 1
PD-L1 1/1000 EDTA (pH 9) खरगोश विरोधी AF488 2
आरओआर-γ 1/200 EDTA (pH 9) एंटी-माउस ATT0-425 3
CD3 1/100 साइट्रेट (पीएच 6) खरगोश विरोधी AF555 4
hPanCK 1/50 साइट्रेट (पीएच 6) एएफ 750 के साथ युग्मित एंटी-माउस 5

तालिका 1: एक अनुकूलित मल्टीप्लेक्स पैनल का उदाहरण। संक्षेप: पीडी -1 = प्रोग्राम्ड सेल डेथ प्रोटीन 1; पीडी-एल 1 = प्रोग्राम्ड डेथ-लिगैंड 1; आरओआर -γ = आरएआर से संबंधित अनाथ रिसेप्टर गामा; सीडी 3 = भेदभाव का समूह 3; hPanCK = मानव पैन-साइटोकेराटिन; एएफ = एलेक्साफ्लुर; ईडीटीए = एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड। सीडी 3 का उपयोग टी लिम्फोसाइटों का पता लगाने के लिए किया जाता है; पीडी -1 का उपयोग थके हुए लिम्फोसाइटों का पता लगाने के लिए किया जाता है; आरओआर-γ का उपयोग टीएच -17 का पता लगाने के लिए किया जाता है; और hPanCK का उपयोग ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया जाता है। स्थिति स्तंभ उस क्रम को इंगित करता है जिसमें अनुक्रमिक मल्टीप्लेक्स का प्रदर्शन किया जाना है।

Discussion

मल्टीप्लेक्स धुंधलापन को अनुकूलित करने के लिए ध्यान में रखने वाले सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर कमजोर पड़ने, विशिष्टता और प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए उपयोग की जाने वाली एंटीजन पुनर्प्राप्ति हैं। मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के इष्टतम कमजोर पड़ने और इष्टतम एपिटोप पुनर्प्राप्ति (पीएच 6 या पीएच 9) को क्रोमोजेनिक स्टेनिंग (डीएबी) का उपयोग करके परीक्षण किया जाना चाहिए। हम प्रत्येक एंटीजन पुनर्प्राप्ति बफर के लिए तीन कमजोर पड़ने का परीक्षण करने की सलाह देते हैं: कमजोर पड़ने जो आमतौर पर ब्रांड द्वारा एंटीबॉडी के व्यावसायीकरण द्वारा निर्दिष्ट किया जाता है, एक ही कमजोर पड़ने को दो गुना विभाजित किया जाता है, और एक ही कमजोर पड़ने को दो गुना गुणा किया जाता है (चित्रा 8)। एंटीबॉडी विशिष्टता को सत्यापित करने और धुंधला होने के सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) को अनुकूलित करने के लिए सही कमजोर पड़ने का चयन करना एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है। डीएबी में सही कमजोर पड़ने का चयन करने के बाद, यूनिप्लेक्स टीएसए का उपयोग करके प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए एक ही कमजोर पड़ने का परीक्षण किया जाना चाहिए। एक बार जब प्रत्येक एंटीजन धुंधला होने के लिए कमजोर पड़ने और एपिटोप पुनर्प्राप्ति बफर का चयन किया जाता है, तो मल्टीप्लेक्स के अनुक्रम को सही ढंग से सेट करना भी महत्वपूर्ण है; विशेष रूप से, कुछ एंटीजन पहली स्थिति में बेहतर दाग होते हैं और अन्य अंतिम स्थिति में। हम मल्टीप्लेक्स लेबलिंग का परीक्षण करने की सलाह देते हैं जो सभी संभावित क्रम क्रमपरिवर्तनों का उपयोग करके यह चुनने के लिए है कि कौन सा एंटीजन धुंधला पहले, दूसरे आदि आना चाहिए। यह भी एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि कुछ नाजुक एंटीजन को एपिटोप पुनर्प्राप्ति के कई दौर के बाद नीचा दिखाया जा सकता है, और कुछ एंटीजन एपिटोप पुनर्प्राप्ति के कई दौर के बाद बेहतर दाग होते हैं। उदाहरण के लिए, एसएनआर हमेशा सीडी 3 के लिए अंतिम स्थिति में और पीडी -1 धुंधला होने के लिए पहली स्थिति में होता है। इसके अलावा, कई सह-स्थानीयकृत एंटीजन के धुंधलापन को एक छाता प्रभाव (टायरामाइड प्रतिक्रियाशील साइटों की संतृप्ति) द्वारा बाधित किया जा सकता है। यह टायरामाइड एकाग्रता को कम करके क्षीण किया जा सकता है। जब एक एंटीजन की अभिव्यक्ति दूसरे की अभिव्यक्ति (सीडी 8 केवल सीडी 3-व्यक्त टी कोशिकाओं पर मौजूद) द्वारा वातानुकूलित होती है, तो हम एंटीजन को दूसरे के बाद व्यापक अभिव्यक्ति (इस मामले में सीडी 3) के साथ धुंधला करने की सलाह देते हैं। अंत में, स्कैनर विशिष्टताओं के अनुसार प्रत्येक एंटीजन धुंधला के लिए सही फ्लोरोक्रोम चुनना भी क्रॉस-डिटेक्शन से बचने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।

इस तकनीक के प्रमुख लाभ प्रवर्धन और प्राप्त सिग्नल-टू-शोर अनुपात हैं। हालांकि, यह तकनीक एक सीमा के साथ आती है, जो यह है कि धुंधलापन अनुक्रमिक है, और फ्लोरोक्रोम ऊतक से सहसंयोजक रूप से बंधे होते हैं। फिर भी, सभी टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन राउंड करने के बाद, एक द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ सीधे फ्लोरोक्रोम (कोई टीएसए नहीं) के साथ मिलकर एक अंतिम धुंधलापन जोड़ना भी संभव है। कुछ पैनलों में, हमने 750 चैनल में धुंधलापन जोड़ने के लिए इस विधि का उपयोग किया। यह आवश्यक था क्योंकि उस समय कोई टायरामाइड-एएफ 750 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं था। ध्यान दें, एएफ 750 से सना एंटीजन के एक्सपोजर (स्कैन के दौरान) का समय टीएसए से सना अन्य एंटीजन की तुलना में बहुत लंबा होगा। उस स्थिति में, हम साइटोकेराटिन जैसे अत्यधिक व्यक्त प्रोटीन को धुंधला करने या प्राथमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता बढ़ाने की सलाह देते हैं। ऐसा करने से, प्रतिदीप्ति स्कैनर के आधार पर एक बैच में प्रति स्लाइड अधिकतम पांच से छह एंटीजन दागना संभव है।

विरोध में, कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तकनीकें एक एकल ऊतक खंड पर दाग लगाए जा सकने वाले एंटीजन की संख्या में सुधार करने के लिए धुंधलापन, स्कैनिंग, और स्ट्रिपिंग या फोटोब्लीचिंग के कई राउंड के साथ सीरियल स्टेनिंग का उपयोग करती हैं। हालांकि, ये तकनीकें अक्सर समय लेने वाली, महंगी होती हैं, कोई संकेत प्रवर्धन नहीं होता है, सीरियल स्कैन को सही ढंग से विलय करने के लिए उन्नत कम्प्यूटेशनल चरणों की आवश्यकता होती है, और, हमारे अनुभव में, कई प्रक्रिया चरणों के कारण अपरिवर्तनीय ऊतक क्षति को प्रेरित कर सकते हैं। बहरहाल, यह बताया गया है कि इस विधि14 का उपयोग करके एक एकल ऊतक पर 30 एंटीजन तक दाग लगाए जा सकते हैं।

निष्कर्ष में, हमारी विधि एक मजबूत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, उपयोग में आसान और लागत प्रभावी इम्यूनोहिस्टोफ्लोरेसेंस तकनीक है जिसका उपयोग प्रतिदीप्ति स्लाइड स्कैनर रखने वाली किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है। आईएचसी के लिए उपयुक्त किसी भी व्यावसायिक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है, और पैनल किसी भी वाणिज्यिक किट के लिए विशिष्ट नहीं हैं। छवि विश्लेषण कई अलग-अलग कार्यक्रमों पर किया जा सकता है, जिसमें ओपन-सोर्स प्रोग्राम जैसे क्यूपाथ और आर शामिल हैं। हालांकि, हमें लगता है कि इस विधि को भविष्य में बड़े एंटीजन पैनलों के लिए भी बेहतर बनाया जा सकता है, जिससे एंटीजन के विभिन्न पैनलों के साथ और सिग्नल प्रवर्धन के लाभ के साथ एक ही स्लाइड के सीरियल स्टेनिंग / स्कैनिंग करने की अनुमति मिलती है।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक अपनी मदद और समर्थन के लिए डॉ डेरूएन एफ को धन्यवाद देना चाहते हैं। निकोलस ह्यूघे एक रिसर्च फेलो हैं जो बेल्जियम नेशनल फंड फॉर साइंटिफिक रिसर्च (टेलेवी / एफएनआरएस 7460918 एफ) से अनुदान द्वारा समर्थित हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-CD3 primary antibody Abcam ab16669 rabbit monocolonal
anti-CD8 primary antibody DAKO M710301 mouse monoclonal
anti-hPanCK primary antibody DAKO M3515 mouse monoclonal
anti-PD-1 primary antibody Cell Signalling D4W2J rabbit monocolonal
anti-PD-L1 primary antibody Cell Signalling 13684 rabbit monocolonal
anti-RORC primary antibody Sigma MABF81 mouse monoclonal
ATTO-425 ATTOtec
Axioscan Z1 Zeiss Light source: Colibri 7 (385, 430, 475, 555, 590, 630, 735 nm) Filtersets: Excitation 379/34 – beam splitter 409 – emission 440/40; Excitation 438/24 – beam splitter 458 – emission 483/32; Excitation 490/20 – beam splitter 505 – emission 525/20; Excitation 546/10 – beam splitter 556 – emission 572/23; Excitation 592/21 – beam splitter 610 – emission 630/30; Excitation 635/18 – beam splitter 652 – emission 680/42; Excitation 735/40 – beam splitter QBS 405 + 493 + 611 + 762 - emission QBP 425/30 + 524/51 + 634/38 + 785/38; Objective: Plan-Apochromat 20x/0.8; Camera : Orca Flash 4.0 V3
Borosilicate Cover Glass VWR 631-0146
Envision+ anti-mouse DAKO K4001
Envision+ anti-rabbit DAKO K4003
Fluorescence mounting medium DAKO S3023
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 750 ThermoFischer A-21037
HALO software Indicalabs
Hoescht  Sigma 14533
Superfrost plus microscope slides Fisherscientific/Epredia 10149870
Tyramide-AF488 ThermoFischer B40953
Tyramide-AF555 ThermoFischer B04955
Tyramide-AF647 ThermoFischer B04958

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 196
ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के नैदानिक और जैविक मूल्यांकन के लिए स्थानिक छवि विश्लेषण के साथ संयुक्त मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस
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Huyghe, N., Benidovskaya, E.,… More

Huyghe, N., Benidovskaya, E., Beyaert, S., Daumerie, A., Maestre Osorio, F., Aboubakar Nana, F., Bouzin, C., Van den Eynde, M. Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (196), e65220, doi:10.3791/65220 (2023).

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