Summary
Een procedure voor het bestuderen van de dynamiek van mitochondriaal DNA (mtDNA) metabolisme in cellen met behulp van een multi-well plaatformaat en geautomatiseerde immunofluorescentie beeldvorming om mtDNA-synthese en -distributie te detecteren en te kwantificeren, wordt beschreven. Dit kan verder worden gebruikt om de effecten van verschillende remmers, cellulaire stress en gen-uitschakeling op het mtDNA-metabolisme te onderzoeken.
Abstract
De overgrote meerderheid van cellulaire processen vereist een continue toevoer van energie, waarvan de meest voorkomende drager het ATP-molecuul is. Eukaryote cellen produceren het grootste deel van hun ATP in de mitochondriën door oxidatieve fosforylering. Mitochondriën zijn unieke organellen omdat ze hun eigen genoom hebben dat wordt gerepliceerd en doorgegeven aan de volgende generatie cellen. In tegenstelling tot het nucleaire genoom zijn er meerdere kopieën van het mitochondriale genoom in de cel. De gedetailleerde studie van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de replicatie, reparatie en onderhoud van het mitochondriale genoom is essentieel voor het begrijpen van de goede werking van mitochondriën en hele cellen onder zowel normale als ziekteomstandigheden. Hier wordt een methode gepresenteerd die de high-throughput kwantificering van de synthese en distributie van mitochondriaal DNA (mtDNA) in menselijke cellen die in vitro zijn gekweekt, mogelijk maakt. Deze aanpak is gebaseerd op de immunofluorescentiedetectie van actief gesynthetiseerde DNA-moleculen gelabeld door 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) -opname en de gelijktijdige detectie van alle mtDNA-moleculen met anti-DNA-antilichamen. Bovendien worden de mitochondriën gevisualiseerd met specifieke kleurstoffen of antilichamen. Het kweken van cellen in een multi-well formaat en het gebruik van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop maken het gemakkelijker om de dynamiek van mtDNA en de morfologie van mitochondriën onder verschillende experimentele omstandigheden in een relatief korte tijd te bestuderen.
Introduction
Voor de meeste eukaryote cellen zijn mitochondriën essentiële organellen, omdat ze een cruciale rol spelen in tal van cellulaire processen. Eerst en vooral zijn mitochondriën de belangrijkste energieleveranciers van cellen1. Mitochondriën zijn ook betrokken bij het reguleren van cellulaire homeostase (bijvoorbeeld intracellulaire redox2 en de calciumbalans3), celsignalering4,5, apoptose6, de synthese van verschillende biochemische verbindingen 7,8 en de aangeboren immuunrespons9. Mitochondriale disfunctie is geassocieerd met verschillende pathologische toestanden en menselijke ziekten10.
De werking van mitochondriën hangt af van de genetische informatie in twee afzonderlijke genomen: de nucleaire en mitochondriale genomen. Het mitochondriale genoom codeert voor een klein aantal genen in vergelijking met het nucleaire genoom, maar alle mtDNA-gecodeerde genen zijn essentieel voor het menselijk leven. De mitochondriale eiwitmachinerie die nodig is om het mtDNA in stand te houden, wordt gecodeerd door nDNA. De basiscomponenten van het mitochondriale replisoom, evenals enkele mitochondriale biogenesefactoren, zijn al geïdentificeerd (beoordeeld in eerder onderzoek11,12). Mitochondriale DNA-replicatie- en onderhoudsmechanismen zijn echter nog lang niet begrepen. In tegenstelling tot nDNA bestaat het mitochondriale genoom in meerdere kopieën, wat een extra laag biedt voor het reguleren van mitochondriale genexpressie. Er is momenteel veel minder bekend over de verdeling en segregatie van mtDNA binnen organellen, in hoeverre deze processen gereguleerd zijn, en zo ja, welke eiwitten erbij betrokken zijn13. Het segregatiepatroon is cruciaal wanneer cellen een gemengde populatie van wild-type en gemuteerd mtDNA bevatten. Hun ongelijke verdeling kan leiden tot de generatie van cellen met een schadelijke hoeveelheid gemuteerd mtDNA.
Tot nu toe zijn de eiwitfactoren die nodig zijn voor mtDNA-onderhoud voornamelijk geïdentificeerd door biochemische methoden, bioinformatische analyses of door ziektegerelateerde studies. In dit werk, om een grote kans te garanderen op het identificeren van factoren die eerder aan identificatie zijn ontsnapt, wordt een andere strategie beschreven. De methode is gebaseerd op de etikettering van mtDNA tijdens replicatie of reparatie met 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU), een nucleoside-analoog van thymidine. BrdU wordt gemakkelijk opgenomen in ontluikende DNA-strengen tijdens DNA-synthese en wordt in het algemeen gebruikt voor het monitoren van de replicatie van nucleair DNA14. De hier ontwikkelde procedure is echter geoptimaliseerd voor het detecteren van BrdU opgenomen in mtDNA met behulp van de immunofluorescentie van anti-BrdU-antilichamen.
De aanpak maakt de high-throughput kwantificering van mtDNA-synthese en -distributie mogelijk in menselijke cellen die in vitro zijn gekweekt. Een high-throughput strategie is noodzakelijk om in relatief korte tijd testen uit te voeren onder verschillende experimentele omstandigheden; Daarom wordt in het protocol voorgesteld om een multi-well-formaat te gebruiken voor celkweek en geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming. Het protocol omvat de transfectie van menselijke HeLa-cellen met een siRNA-bibliotheek en de daaropvolgende monitoring van mtDNA-replicatie of -reparatie met behulp van de metabole etikettering van nieuw gesynthetiseerd DNA met BrdU. Deze aanpak wordt gecombineerd met immunostaining van het DNA met behulp van anti-DNA-antilichamen. Beide parameters worden geanalyseerd met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie. Bovendien worden mitochondriën gevisualiseerd met een specifieke kleurstof. Om de specificiteit van het protocol aan te tonen, werd BrdU-kleuring getest op cellen zonder mtDNA (rho0-cellen), op HeLa-cellen na het uitschakelen van bekende mtDNA-onderhoudsfactoren en op HeLa-cellen na behandeling met een mtDNA-replicatieremmer. De mtDNA-niveaus werden ook gemeten met een onafhankelijke methode, namelijk qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van het siRNA-mengsel
- Een dag voor het begin van het experiment, zaadcellen (bijv. HeLa) op een schaal van 100 mm, zodat ze de volgende dag 70% -90% samenvloeiing bereiken.
OPMERKING: Alle bewerkingen moeten onder steriele omstandigheden in een laminaire stromingskamer worden uitgevoerd. - Bereid de juiste hoeveelheid siRNA verdund tot een concentratie van 140 nM in Opti-MEM-medium (zie tabel met materialen). Een 96-well plaat kan worden gebruikt als reservoir.
- Voeg 5 μL van de siRNA-oplossing (of Opti-MEM-medium voor de controlemonsters) toe aan elk putje van een zwarte 384-well celkweekmicroplaat.
OPMERKING: Afhankelijk van het aantal geteste siRNA-monsters kan een elektronische of meerkanaalspipet worden gebruikt. - Bereid de juiste hoeveelheid RNAiMAX-transfectiereagensoplossing (zie materiaaltabel) in het Opti-MEM-medium. Voeg 1 μL RNAiMAX toe voor elke 100 μL medium.
- Voeg 10 μL van de transfectiereagensoplossing toe aan elk putje van de 384-putplaat. De handigste en snelste manier om dit te doen is met een reagensdispenser.
- Incubeer het siRNA met het transfectiereagens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
2. Voorbereiding van cellen voor transfectie
- Zuig tijdens de incubatie (stap 1.6) het medium op met behulp van een zuigapparaat (zie materiaaltabel) en was de cellen met 3 ml PBS.
- Voeg 1,5 ml trypsine verdund 1:2 in PBS toe en incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 10 minuten.
- Controleer of de cellen zijn losgemaakt; voeg dan 3 ml DMEM-medium toe met 10% FBS. Suspensie de cellen grondig en breng ze over naar een buis van 15 ml. Neem ten minste 150 μL van de suspensie en tel de cellen in een celtelkamer (zie tabel met materialen).
- Bereid een celsuspensie in de juiste concentratie (35.000 / ml voor de HeLa-lijn) in DMEM-medium met 10% FBS, penicilline en streptomycine.
3. Celtransfectie
- Voeg 20 μL van de celsuspensie toe aan elk putje van de 384-putplaat met behulp van de reagensdispenser. Dit resulteert in 700 cellen die per put worden gezaaid.
- Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en plaats ze vervolgens gedurende 72 uur in de incubator (37 °C en 5% CO2).
4. BrdU oprichting
- Bereid een 90 μM oplossing van BrdU (zie Materiaaltabel) in DMEM medium met 10% FBS.
- Voeg 56 h na de siRNA-transfectie (16 uur vóór de celfixatie) 10 μL BrdU-oplossing van 90 μM toe aan elk putje van de 384-well-plaat (de uiteindelijke BrdU-concentratie is 20 μM).
OPMERKING: De actie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd; Daarom is het het beste om een reagensdispenser, elektronische pipet of pipet met meerdere dispensers te gebruiken. Vergeet niet om controleputten voor te bereiden zonder de toevoeging van BrdU. - Incubeer de cellen gedurende 16 uur (37 °C en 5% CO2).
5. Etikettering van mitochondriën
- Bereid een 20 μM-oplossing van BrdU in DMEM met 10% FBS en voeg daaraan de mitochondriale trackingkleurstofoplossing (zie materiaaltabel) toe tot een concentratie van 1,1 μM.
- Voeg 15 h na het begin van de BrdU-opname (1 uur vóór de celfixatie) 10 μL van de mitochondriale trackingkleurstofoplossing (zie materiaaltabel) toe aan elke put van de 384-wellplaat (de uiteindelijke kleurstofconcentratie is 200 nM).
OPMERKING: Gebruik een reagensdispenser, elektronische pipet of pipet met meerdere dispensers. Vergeet niet om controleputten te behouden zonder de toevoeging van BrdU, maar met de toevoeging van de mitochondriale trackingkleurstof. - Incubeer de cellen gedurende 1 uur (37 °C en 5% CO2).
6. Celfixatie
OPMERKING: Alle wassen wordt het gemakkelijkst uitgevoerd met behulp van een microplaatwasser, terwijl de toevoeging van reagentia het snelst wordt uitgevoerd met behulp van een reagensdispenser.
- Spoel met behulp van de microplaatwasser (zie materiaaltabel) elke put tweemaal af met 100 μL PBS. Laat na de tweede wasbeurt 25 μL PBS in de put staan.
OPMERKING: Het achterlaten van PBS in de put vermindert de kans op celloslating tijdens de toevoeging van vloeistof in de volgende stap. Alle wasbeurten worden voltooid met de PBS erin; daarom moet de oplossing die in de volgende stap wordt toegevoegd altijd worden bereid in een concentratie van 2x, omdat deze in een gelijk volume aan de resterende PBS zal worden toegevoegd. - Fixeer de cellen door 25 μL van een 8% formaldehyde-oplossing in PBS toe te voegen met 0,4% Triton X-100 en Hoechst 33342 in een concentratie van 4 μg/ml (de uiteindelijke concentraties van individuele reagentia zijn respectievelijk 4%, 0,2% en 2 μg/ml) (zie tabel met materialen).
- Incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
7. Blokkeren
- Spoel elk goed vier keer af met 100 μL PBS. Laat na de laatste wasbeurt 25 μL PBS in de put staan.
- Voeg 25 μL van 6% BSA in PBS (de uiteindelijke BSA-concentratie is 3%) toe aan elke put.
- Incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
8. Toevoeging van de primaire antilichamen
- Zuig de BSA op met behulp van een microplaatwasser en laat 10 μL oplossing in de put zitten.
- Voeg 10 μL van de primaire antilichaamoplossing bereid in 3% BSA in PBS toe. Gebruik anti-BrdU bij 0,8 μg/ml en anti-DNA bij 0,4 μg/ml (de uiteindelijke concentraties antilichamen zijn respectievelijk 0,4 μg/ml en 0,2 μg/ml) (zie tabel met materialen).
- Incubeer de plaat in het donker bij 4 °C gedurende een nacht.
9. Toevoeging van de secundaire antilichamen
- Spoel elk goed vier keer af met 100 μL PBS. Laat na de laatste wasbeurt 10 μL PBS in de put zitten.
- Voeg 10 μL van de 4 μg/ml secundaire antilichaamoplossing bereid in 6% BSA in PBS toe (de uiteindelijke concentratie is 2 μg/ml). Gebruik isotype-specifieke antilichamen (anti-muis IgG1 en anti-muis IgM) geconjugeerd aan fluorochromen zoals Alexa Fluor 488 en Alexa Fluor 555 (zie tabel met materialen).
- Incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Spoel elk goed vier keer af met 100 μL PBS. Laat na de laatste wasbeurt 50 μL PBS in de put staan.
- Sluit de plaat af met een zelfklevende afdichtingsfolie (zie Materiaaltabel) en bewaar deze in het donker bij 4 °C. Beeldvorming moet binnen 2 weken worden uitgevoerd.
10. Beeldvorming
OPMERKING: Beeldvorming moet worden uitgevoerd met een geautomatiseerde breedveldmicroscoop; De microscoop moet zijn uitgerust met een motortrap die is voorzien van bedieningselementen om afzonderlijke delen van de plaat automatisch in beeld te brengen.
- Controleer de autofocusinstellingen in de hoekgebieden van de plaat (putjes A1, A24, P24, P1) en in het midden.
OPMERKING: Voor beeldvorming wordt aanbevolen om een objectief van 20x korte werkafstand te gebruiken (zie materiaaltabel) met een zo hoog mogelijk numeriek diafragma. - Selecteer op basis van de intensiteitshistogrammen die door de beeldvormingssoftware in de live view-modus worden gegenereerd, een voldoende lange belichtingstijd voor de afzonderlijke fluorescentiekanalen, zodat het resulterende beeld niet oververzadigd is.
- Stel het juiste aantal vlakken in voor beeldvorming op de z-as.
OPMERKING: Het gezichtsveld bij een vergroting van 20x is groot genoeg dat niet alle cellen zich in hetzelfde focusvlak bevinden, dus z-sectie moet worden uitgevoerd om alle cellen in hun juiste focusvlak te bekijken. Meestal zijn vijf vliegtuigen voldoende. Afhankelijk van de beschikbaarheid van schijfruimte kunnen individuele z-stacks of alleen maximale intensiteitsprojecties worden opgeslagen. De beeldanalyse in de sectie representatieve resultaten is gebaseerd op maximale intensiteitsprojecties. - Selecteer het juiste aantal gezichtsvelden dat u per put wilt weergeven.
OPMERKING: Afhankelijk van de samenloop kunnen ongeveer 60-300 cellen in één gezichtsveld worden afgebeeld. Typisch, voor HeLa-cellen met een samenvloeiing van 60% -90%, zal het afbeelden van vijf gezichtsvelden iemand in staat stellen om van 500 cellen tot meer dan 1.000 cellen te analyseren. - Selecteer de putten die u wilt afbeelden en begin met beeldvorming.
11. Kwantitatieve beeldanalyse
OPMERKING: De kwantitatieve analyse van verkregen afbeeldingen kan worden uitgevoerd met behulp van een open-source software zoals Cell Profiler15. Voor deze studie werd de analyse uitgevoerd met behulp van de ScanR 3.0.0-software (zie materiaaltabel).
- Start de analyse door achtergrondcorrectie uit te voeren voor alle afbeeldingen van alle fluorescentiekanalen. Afhankelijk van de grootte van de geanalyseerde objecten, selecteert u de juiste filtergrootte: 80 pixels voor celkernen en 4 pixels voor BrdU- en mtDNA-vlekken.
- Begin met het segmenteren van het beeld door een masker van het hoofdobject te maken op basis van de verhouding van de intensiteit van het fluorescentiesignaal tot de achtergrond voor het kanaal dat overeenkomt met de celkernen.
- Maak maskers voor de subobjecten die respectievelijk de BrdU- en mtDNA-vlekken vertegenwoordigen, met behulp van de fluorescentiekanalen die geschikt zijn voor de gegeven structuren.
OPMERKING: Elk subobject wordt toegewezen aan het dichtstbijzijnde hoofdobject (celkern). - Stel de parameters in die tijdens de analyse moeten worden gemeten en meet de intensiteit van de afzonderlijke pixels in elk masker voor alle fluorescentiekanalen.
OPMERKING: Het is ook noodzakelijk om het aantal subobjecten te berekenen dat aan een bepaalde celkern is toegewezen en de oppervlakte van elk subobject. - Definieer de afgeleide parameters die moeten worden berekend op basis van de verkregen gegevens. Om de totale fluorescentie-intensiteiten voor het BrdU- of mtDNA-kanaal te verkrijgen, somt u de intensiteiten op van alle subobjecten die aan een bepaalde celkern zijn toegewezen. Om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit te verkrijgen, deelt u de totale fluorescentie-intensiteit door de som van de oppervlakte van de subobjecten die aan een bepaalde celkern zijn toegewezen.
OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat het gecreëerde subobject (BrdU of mtDNA-vlek) zich daadwerkelijk in de mitochondriën bevindt, is het noodzakelijk om ze te gaten op basis van de fluorescentie-intensiteit van de mitochondriale trackingkleurstof. - Voer verdere analyse uit van de gegevens die zijn verkregen met de ScanR-software met behulp van de R 4.2.2 statistische software16 samen met de volgende pakketten: dplyr 17, data.table 18, ggplot219 en ggpubr20. Deze stap is optioneel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schema van de procedure voor de high-throughput studie van de dynamica van mtDNA synthese en distributie is weergegeven in figuur 1. Het gebruik van een multi-well plaatformaat maakt de gelijktijdige analyse van veel verschillende experimentele omstandigheden mogelijk, zoals het uitschakelen van verschillende genen met behulp van een siRNA-bibliotheek. De omstandigheden die worden gebruikt voor het labelen van nieuw gesynthetiseerde DNA-moleculen met BrdU maken de detectie van BrdU-gelabeld DNA in de mitochondriën van HeLa-cellen mogelijk (figuur 2A), maar kunnen ook worden gebruikt als beginvoorwaarden voor het opzetten van de test voor andere celtypen. De incubatietijd met BrdU moet voor individuele cellijnen worden geselecteerd op basis van een tijdsloopexperiment (aanvullende figuur 1). In de huidige studie werden HeLa-cellen gebruikt, omdat de screening van siRNA's cellen vereist die met hoge efficiëntie kunnen worden getransfecteerd. Belangrijk is dat het signaal dat wordt verkregen met anti-BrdU-antilichamen specifiek is, omdat het alleen kan worden waargenomen in cellen die zijn behandeld met BrdU (figuur 2). De specifieke kenmerken van anti-BrdU- en anti-DNA-etikettering werden verder bevestigd met behulp van rho0-cellen zonder mitochondriaal DNA21 (aanvullende figuur 2). Zoals verwacht werd in deze cellen, ongeacht de BrdU-behandeling, geen signaal gedetecteerd in de mitochondriën voor zowel de anti-BrdU- als voor anti-DNA-antilichamen (figuur 2B). Het kwantificeren van het fluorescerende signaal van de anti-BrdU-antilichamen gaf aan dat rho0-cellen behandeld met BrdU hetzelfde lage niveau van fluorescentie vertoonden als de BrdU-onbehandelde cellen, terwijl het signaal voor de ouderlijnen A549 en HeLa gemiddeld 50-voudig hoger was (figuur 2C).
Om het nut aan te tonen van de methode die hier wordt gepresenteerd in de studie van mitochondriale DNA-synthese en -distributie, werd een experiment uitgevoerd waarin HeLa-cellen werden behandeld met 2′,3′-dideoxycytidine (ddC), een remmer van mtDNA-synthese22, en de expressie van genen waarvan bekend is dat ze essentieel zijn voor mtDNA-replicatie werd tot zwijgen gebracht met siRNA (figuur 3). De behandeling van cellen met ddC leidde tot de volledige remming van BrdU-incorporatie, terwijl de gebruikte siRNA's verschillende effecten hadden. De downregulatie van de Twinkle helicase (TWNK)23 leidde tot de krachtigste remming van BrdU-incorporatie; een zwakker effect werd waargenomen voor het TFAM-eiwit24, terwijl de uitschakeling van het mitochondriale DNA-polymerase-gamma (POLG)25 leidde tot een matige afname van de BrdU-opname in vergelijking met cellen behandeld met negatief controlesiRNA (figuur 3A,B). Het gebruik van anti-DNA-antilichamen in de procedure maakt het mogelijk om de mtDNA-verdeling in de cel onder de gegeven experimentele omstandigheden te monitoren. De downregulatie van TFAM leidde tot drastische veranderingen in de mtDNA-distributie; er werden minder mtDNA-vlekken gedetecteerd in vergelijking met controlecellen, maar de cellen die overbleven hadden een zeer hoge fluorescentie-intensiteit (figuur 3A). Het kwantificeren van het gemiddelde fluorescentiesignaal van het anti-DNA-antilichaam toonde een meervoudige toename bij TFAM-uitschakeling in vergelijking met de andere geteste omstandigheden (figuur 3C).
De specificiteit van de beeldvormingsresultaten werd geverifieerd door de mtDNA- en genexpressieniveaus te meten met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) (figuur 4). De methode is elders in detail beschreven26. Behandeling met ddC resulteerde in een zeer sterke afname van de mtDNA-spiegels; een zwakker effect werd waargenomen in het geval van TFAM- en TWNK-uitschakeling, terwijl de transfectie van cellen met POLG-siRNA een zeer bescheiden effect had op het mtDNA-kopienummer (figuur 4A). Het kwantificeren van de TFAM- en TWNK-expressie bevestigde een efficiënte vermindering van hun expressie tot ~ 15% -20% van de controleniveaus, in tegenstelling tot POLG, waarvan de expressie op mRNA-niveau werd teruggebracht tot 30% (figuur 4B).
Figuur 1: Schematische weergave van de protocolstappen. De schaalbalken voor de microscopische beelden zijn 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Specifieke detectie van BrdU-opname in mtDNA door anti-BrdU-antilichamen. Voorbeeldbeelden van (A) HeLa en (B) A549 en A549 rho0 cellen onderworpen aan immunofluorescentiekleuring met anti-BrdU (groen) en anti-DNA (rood) antilichamen. De cellen werden al dan niet behandeld met de BrdU-oplossing. Nucleair DNA (blauw) werd gelabeld met Hoechst en de mitochondriën (cyaan) werden gevisualiseerd met een mitochondriale volgkleurstof. Er wordt een samengevoegde afbeelding van alle vier de fluorescentiekanalen weergegeven. De schaalbalk vertegenwoordigt 10 μm. (C) Het resultaat van de kwantificering van het signaal van de anti-BrdU-antilichamen. De analyse werd uitgevoerd voor vier onafhankelijke biologische replicaties; elke keer werden 100 willekeurig geselecteerde cellen geanalyseerd voor elke experimentele conditie (N = 400 cellen). Gemiddeld werden 18 BrdU-foci per cel gedetecteerd. De vakken vertegenwoordigen het eerste en derde kwartiel van het interkwartielbereik (IQR), de mediaan wordt weergegeven door een horizontale lijn, de snorharen definiëren het minimum en maximum en de uitschieters worden gedefinieerd als 1,5 x IQR. Er werd een statistische test van Kruskal-Wallis uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Resultaten van de remming van mtDNA-synthese, inclusief het verminderen van de efficiëntie van BrdU-opname en het beïnvloeden van de distributie van nucleoïden. (A) Voorbeeld fluorescentiebeelden van HeLa-cellen behandeld gedurende 72 uur met ddC of siRNA, die de eiwitten die betrokken zijn bij mtDNA-replicatie downreguleren. De cellen werden behandeld met BrdU gedurende 16 uur vóór fixatie. Het nucleaire DNA (blauw) werd gekleurd met Hoechst, anti-BrdU (groen) en anti-DNA (rood) antilichamen werden gebruikt en de mitochondriën werden gelabeld met een mitochondriale trackingkleurstof. Er wordt een samengevoegde afbeelding van alle vier de fluorescentiekanalen weergegeven. De schaalbalk vertegenwoordigt 10 μm. (B,C) Kwantificering van de fluorescentiesignalen van (B) anti-BrdU en (C) anti-DNA antilichamen. De analyse werd uitgevoerd voor vier onafhankelijke biologische replicaties; elke keer werden 650 willekeurig geselecteerde cellen geanalyseerd voor elke experimentele conditie (N = 2.600 cellen). Gemiddeld werden per cel 18 BrdU-foci en 46 mtDNA-foci gedetecteerd. De vakken vertegenwoordigen het eerste en derde kwartiel van het interkwartielbereik (IQR), de mediaan wordt weergegeven door een horizontale lijn, de snorharen definiëren het minimum en maximum en de uitschieters worden gedefinieerd als 1,5 x IQR. Er werd een statistische test van Kruskal-Wallis uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Validatie van de efficiëntie van de remming van mtDNA-synthese en van de effectiviteit van de geteste siRNA's. HeLa-cellen werden gedurende 72 uur behandeld met ddC of de aangegeven siRNA's en vervolgens onderworpen aan DNA- en RNA-isolatie. (A) Resultaten van de mtDNA-niveauanalyse met behulp van qPCR. B) qPCR-analyse van genexpressieveranderingen onder de aangegeven omstandigheden. De staven vertegenwoordigen de gemiddelde waarden van vier onafhankelijke biologische replicaties; de foutbalken vertegenwoordigen de SEM; er is een ANOVA statistische test uitgevoerd; een t-test werd uitgevoerd voor paarsgewijze vergelijking met Untr (onbehandelde) monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Dynamica van BrdU-opname in het mtDNA van HeLa-cellen. De resultaten van een tijdsloopexperiment waarbij de cellen gedurende een bepaalde tijd werden geïncubeerd met 20 μM BrdU worden getoond. De middelen van vier onafhankelijke replicaties voor elk tijdstip worden weergegeven; 900 willekeurig geselecteerde cellen werden geanalyseerd in elke replicatie. De staven vertegenwoordigen het middel van vier replicaties; er werd een ANOVA statistische test uitgevoerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Validatie van de A549 rho0-cellen. (A) Elektroforetische analyse van de qPCR-producten uit amplificerende DNA-fragmenten van de mtDNA-gecodeerde ND1 - en nucleaire DNA-gecodeerde B2M-genen . Totaal DNA van A549 of A549 rho0 cellen werd gebruikt als templates in de reactie. (B) Resultaten van de mtDNA-niveauanalyse met behulp van qPCR. De staven vertegenwoordigen de gemiddelde waarden van vier onafhankelijke biologische replicaties; de foutbalken vertegenwoordigen de SEM; Er werd een T-test uitgevoerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historisch gezien is DNA-etikettering door BrdU-opname en antilichaamdetectie gebruikt in nucleaire DNA-replicatie en celcyclusonderzoek 14,27,28. Tot nu toe hebben alle protocollen voor het detecteren van BrdU-gelabeld DNA een DNA-denaturatiestap (zuur of thermisch) of enzymvertering (DNase of proteïnase) opgenomen om blootstelling aan epitoop mogelijk te maken en de penetratie van antilichamen te vergemakkelijken. Deze protocollen zijn ontwikkeld voor dicht opeengepakt nucleair DNA. De verschillende organisatie van mtDNA maakte echter de ontwikkeling van een procedure mogelijk zonder de denaturatiestap; Dit heeft de procedure vereenvoudigd en geschikter gemaakt voor toepassingen met een hoge doorvoer. Deze aanpak heeft uitstekende resultaten opgeleverd omdat het weglaten van de denaturatiestap resulteert in de detectie van BrdU-gelabeld DNA alleen buiten de kern (figuur 2 en figuur 3). Bijgevolg kan het sterke signaal van nucleair DNA, dat altijd aanwezig is wanneer een denaturatiestap wordt opgenomen en dat een ernstig probleem kan veroorzaken door het signaal van BrdU-gelabeld mtDNA29 te maskeren, met dit protocol worden vermeden. Bovendien zorgt het ontbreken van harde denaturatie voor een beter behoud van de cellulaire structuren en heeft het geen invloed op de efficiëntie van kleuring door fluorescerende vlekken zoals Hoechst of mitochondriale trackingkleurstof (figuur 2 en figuur 3).
De dynamiek van BrdU-opname in mtDNA is cellijnafhankelijk. Het uitvoeren van een tijdsloopexperiment op BrdU-integratie wordt aanbevolen wanneer u een nieuwe cellijn gebruikt. Deze studie heeft 16 uur vastgesteld als een optimale BrdU-incubatietijd voor HeLa-cellijnen. Vanwege de biologische variatie in HeLa-lijnen van verschillende laboratoria30, wordt echter voorgesteld om een BrdU-tijdcursusexperiment uit te voeren op de specifieke HeLa-variant waarmee men van plan is te werken.
De combinatie van anti-BrdU en anti-DNA-labeling in dit protocol maakt het mogelijk om mtDNA-synthese te monitoren en de gelijktijdige studie van de mtDNA-verdeling in de cel te volgen. Dit is heel goed te zien in TFAM-gedempte cellen (figuur 3). Het verlagen van het niveau van TFAM leidt tot een vermindering van de mtDNA-synthese (een verminderd totaal anti-BrdU-signaal) en tot de clustering van mitochondriale nucleoïden, wat zich manifesteert door een aanzienlijke toename van het gemiddelde mtDNA-fluorescentiesignaal (figuur 3). Opgemerkt moet worden dat, in dit geval, de toename van de gemiddelde mtDNA-fluorescentie-intensiteit wordt veroorzaakt door de veranderde verdeling van de mitochondriale nucleoïden en niet de upregulatie van mtDNA-niveaus weerspiegelt; in feite zijn de mtDNA-niveaus verlaagd, zoals blijkt uit kwantitatieve PCR-analyse (figuur 4A). Verrassende resultaten werden verkregen voor de cellen getransfecteerd met POLG-siRNA (figuur 3). Men zou kunnen verwachten dat de transfectie van cellen met siRNA-gerichte POLG, het replicatieve DNA-polymerase in mitochondriën, de BrdU-opname in het mtDNA aanzienlijk zou verminderen. In deze studie was het effect op BrdU-opname echter verwaarloosbaar (figuur 3), zoals verder bevestigd door het meten van de mtDNA-niveaus met behulp van qPCR (figuur 4A). De slechte downregulatie van POLG-expressie kan dit schijnbaar tegenstrijdige resultaat verklaren bij de transfectie van cellen met het toegepaste siRNA (figuur 4B). Dit benadrukt een potentieel nadeel van het gebruik van siRNA voor functionele studies en suggereert dat er behoefte is aan gen-uitschakelingsvalidatie.
Over het algemeen is een test ontwikkeld voor het bestuderen van de dynamiek van mtDNA-metabolisme in gekweekte cellen die een multi-well plaatformaat en immunofluorescentiebeeldvorming gebruikt om mtDNA-replicatie, reparatie en distributie te detecteren en te kwantificeren. De methode maakt het mogelijk om gelijktijdig veel verschillende experimentele omstandigheden te bestuderen. Het kan worden gebruikt om de effecten van verschillende remmers, cellulaire stress en gen-uitschakeling op het mtDNA-metabolisme te onderzoeken. Hoewel de test een groot potentieel heeft voor gebruik bij het bestuderen van mtDNA-metabolisme in verschillende fysiologische en pathologische contexten, moet worden opgemerkt dat de test het niet mogelijk maakt replicatie en reparatie-gekoppelde mtDNA-synthese te onderscheiden. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het interpreteren van de resultaten en het plannen van daaropvolgende functionele experimenten. Met name de test heeft verder potentieel voor ontwikkeling. Replicatie-inactieve (of reparatie-inactieve) mitochondriale nucleoïden worden bijvoorbeeld niet gedetecteerd met anti-BrdU-antilichamen. Daarom maakt de toepassing van anti-DNA-antilichamen de kwantificering van de mtDNA-toestandsniveaus, het aantal replicatiestille nucleoïden en de verdeling van nucleoïden in de cel mogelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Science Centre, Polen (Grant/Award Number: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
- Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
- Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
