Summary
מתואר הליך לחקר הדינמיקה של מטבוליזם של דנ"א מיטוכונדריאלי (mtDNA) בתאים באמצעות פורמט צלחת מרובת בארות והדמיה אימונופלואורסצנטית אוטומטית כדי לזהות ולכמת סינתזה והפצה של mtDNA. זה יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של מעכבים שונים, לחצים תאיים והשתקת גנים על חילוף החומרים mtDNA.
Abstract
הרוב המכריע של תהליכים תאיים דורשים אספקה רציפה של אנרגיה, המוביל הנפוץ ביותר של אשר הוא מולקולת ATP. תאים אאוקריוטים מייצרים את רוב ה-ATP שלהם במיטוכונדריה על ידי זרחן חמצוני. מיטוכונדריה הם אברונים ייחודיים מכיוון שיש להם גנום משלהם המשוכפל ומועבר לדור הבא של התאים. בניגוד לגנום הגרעיני, ישנם עותקים רבים של הגנום המיטוכונדריאלי בתא. המחקר המפורט של המנגנונים האחראים לשכפול, תיקון ותחזוקה של הגנום המיטוכונדריאלי חיוני להבנת תפקודם התקין של מיטוכונדריה ותאים שלמים בתנאי נורמליות ומחלות כאחד. כאן מוצגת שיטה המאפשרת כימות בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) בתאים אנושיים בתרבית חוץ גופית . גישה זו מבוססת על זיהוי אימונופלואורסצנטי של מולקולות DNA מסונתזות באופן פעיל המסומנות על ידי שילוב 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) וזיהוי בו זמנית של כל מולקולות mtDNA עם נוגדנים נגד DNA. נוסף על כך, מדמיינים את המיטוכונדריה בעזרת צבעים או נוגדנים ספציפיים. גידול תאים בפורמט רב-באר ושימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי מקלים על חקר הדינמיקה של mtDNA והמורפולוגיה של המיטוכונדריה במגוון תנאי ניסוי בזמן קצר יחסית.
Introduction
עבור רוב התאים האיקריוטים, מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים, שכן הם ממלאים תפקיד מכריע בתהליכים תאיים רבים. בראש ובראשונה, מיטוכונדריה הם ספקי האנרגיה העיקריים של תאים1. מיטוכונדריה מעורבים גם בוויסות הומאוסטזיס תאי (לדוגמה, חמצון-חיזור תוך-תאי2 ומאזן הסידן3), איתות תאי 4,5, אפופטוזיס6, סינתזה של תרכובות ביוכימיות שונות7,8, והתגובה החיסונית המולדת9. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור למצבים פתולוגיים שונים ולמחלות אנושיות10.
תפקוד המיטוכונדריה תלוי במידע הגנטי הנמצא בשני גנומים נפרדים: הגנום הגרעיני והמיטוכונדריאלי. הגנום המיטוכונדריאלי מקודד מספר קטן של גנים בהשוואה לגנום הגרעיני, אך כל הגנים המקודדים ב-mtDNA חיוניים לחיי האדם. מנגנון החלבונים המיטוכונדריאליים הדרוש לשמירה על mtDNA מקודד על ידי nDNA. המרכיבים הבסיסיים של הרפליזום המיטוכונדריאלי, כמו גם כמה גורמים ביוגנזה מיטוכונדריאלית, כבר זוהו (נסקרו במחקר קודם11,12). עם זאת, מנגנוני השכפול והתחזוקה של הדנ"א המיטוכונדריאלי עדיין רחוקים מלהיות מובנים. בניגוד ל-nDNA, הגנום המיטוכונדריאלי קיים במספר עותקים, מה שמספק שכבה נוספת לוויסות ביטוי גנים מיטוכונדריאליים. הרבה פחות ידוע כיום על התפלגות והפרדה של mtDNA בתוך אברונים, באיזו מידה תהליכים אלה מוסדרים, ואם כן, אילו חלבונים מעורבים13. דפוס ההפרדה הוא חיוני כאשר תאים מכילים אוכלוסייה מעורבת של mtDNA מסוג בר ומוטציה. התפלגות לא שוויונית שלהם עלולה להוביל ליצירת תאים עם כמות מזיקה של mtDNA מוטציה.
עד כה, הגורמים החלבוניים הדרושים לתחזוקת mtDNA זוהו בעיקר בשיטות ביוכימיות, ניתוחים ביואינפורמטיים או באמצעות מחקרים הקשורים למחלות. בעבודה זו, על מנת להבטיח סיכוי גבוה לזיהוי גורמים שחמקו בעבר מזיהוי, מתוארת אסטרטגיה שונה. השיטה מבוססת על תיוג של mtDNA במהלך שכפול או תיקון עם 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU), אנלוג נוקלאוזיד של תימידין. BrdU משולב בקלות בגדילי דנ"א מתהווים במהלך סינתזת דנ"א, ובאופן כללי, משמש לניטור שכפול דנ"א גרעיני14. עם זאת, ההליך שפותח כאן הותאם לאיתור BrdU המשולב ב- mtDNA באמצעות אימונופלואורסנציה של נוגדנים נגד BrdU.
הגישה מאפשרת כימות בתפוקה גבוהה של סינתזת mtDNA והפצה בתאים אנושיים בתרבית חוץ גופית. יש צורך באסטרטגיית תפוקה גבוהה כדי לבצע בדיקות בתנאי ניסוי שונים בזמן קצר יחסית; לכן, מוצע בפרוטוקול להשתמש בפורמט רב בארות לתרבית תאים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי להדמיה. הפרוטוקול כולל העברה של תאי HeLa אנושיים עם ספריית siRNA וניטור עוקב של שכפול או תיקון mtDNA באמצעות תיוג מטבולי של DNA מסונתז חדש עם BrdU. גישה זו משולבת עם immunostaining של ה- DNA בעזרת נוגדנים anti DNA. שני הפרמטרים מנותחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי. נוסף על כך, מדמיינים מיטוכונדריה באמצעות צבע מסוים. כדי להדגים את הספציפיות של הפרוטוקול, צביעת BrdU נבדקה על תאים נטולי mtDNA (תאי rho0), על תאי HeLa על השתקה של גורמי תחזוקה ידועים של mtDNA, ועל תאי HeLa לאחר טיפול במעכב שכפול mtDNA. רמות mtDNA נמדדו גם בשיטה עצמאית, כלומר qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תערובת siRNA
- יום לפני תחילת הניסוי, תאי זרע (למשל, HeLa) על צלחת של 100 מ"מ, כך שהם מגיעים למפגש של 70%-90% למחרת.
הערה: כל הפעולות חייבות להתבצע בתנאים סטריליים בתא זרימה למינרי. - הכינו את הכמות המתאימה של siRNA מדולל לריכוז של 140 ננומטר בתווך Opti-MEM (ראו טבלת חומרים). צלחת 96 בארות יכולה לשמש כמאגר.
- הוסף 5 μL של תמיסת siRNA (או מדיום Opti-MEM עבור דגימות הבקרה) לכל באר של מיקרו-צלחת שחורה של תרבית תאים בת 384 בארות.
הערה: בהתאם למספר דגימות ה-siRNA שנבדקו, ניתן להשתמש בפיפט אלקטרוני או רב-ערוצי. - הכן את הכמות המתאימה של תמיסת מגיב טרנספקציה RNAiMAX (ראה טבלת חומרים) בתווך Opti-MEM. הוסף 1 μL של RNAiMAX עבור כל 100 μL של בינוני.
- הוסף 10 μL של תמיסת מגיב transfection לכל באר של צלחת 384 באר. הדרך הנוחה והמהירה ביותר לעשות זאת היא עם מתקן מגיב.
- לדגור את siRNA עם מגיב transfection במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
2. הכנת תאים לטרנספקציה
- במהלך הדגירה (שלב 1.6), שאפו את המדיום באמצעות מכשיר יניקה (ראו טבלת חומרים), ושטפו את התאים עם 3 מ"ל PBS.
- הוסף 1.5 מ"ל של טריפסין מדולל 1: 2 ב PBS, ולדגור את התאים ב 37 ° C במשך 10 דקות.
- בדוק אם התאים התנתקו; אם כן, הוסף 3 מ"ל של מדיום DMEM עם 10% FBS. להשעות את התאים ביסודיות, ולהעביר אותם צינור 15 מ"ל. קח לפחות 150 μL של התרחיף, וספור את התאים בתא ספירת תאים (ראה טבלה של חומרים).
- הכינו תרחיף תאים בריכוז המתאים (35,000/מ"ל לקו HeLa) בתווך DMEM עם 10% FBS, פניצילין וסטרפטומיצין.
3. טרנספקציה של תאים
- הוסף 20 μL של תרחיף התא לכל באר של צלחת 384 באר באמצעות מתקן מגיב. התוצאה תהיה 700 תאים שנזרעו לכל באר.
- לדגור על התאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להניח אותם באינקובטור במשך 72 שעות (37 ° C ו 5% CO2).
4. התאגדות BrdU
- הכינו תמיסה של 90 מיקרומטר של BrdU (ראו טבלת חומרים) בתווך DMEM עם 10% FBS.
- 56 שעות לאחר התמרת siRNA (16 שעות לפני קיבוע התא), הוסף 10 μL של 90 מיקרומטר תמיסת BrdU לכל באר של צלחת 384 בארות (ריכוז BrdU הסופי הוא 20 μM).
הערה: יש לבצע את הפעולה מהר ככל האפשר; לכן, עדיף להשתמש מתקן מגיב, פיפטה אלקטרונית, או פיפטה רב מתקן. זכור להכין בארות בקרה ללא תוספת של BrdU. - לדגור על התאים במשך 16 שעות (37 ° C ו 5% CO2).
5. תיוג מיטוכונדריה
- הכינו תמיסה של 20 מיקרומטר של BrdU ב-DMEM עם 10% FBS, והוסיפו לה את תמיסת הצבע למעקב מיטוכונדריה (ראו טבלת חומרים) לריכוז של 1.1 מיקרומטר.
- 15 שעות לאחר תחילת שילוב BrdU (שעה אחת לפני קיבוע התא), הוסף 10 μL של תמיסת צבע מעקב מיטוכונדריה (ראה טבלת חומרים) לכל באר של צלחת 384 בארות (ריכוז הצבע הסופי הוא 200 ננומטר).
הערה: השתמש במתקן מגיבים, פיפטה אלקטרונית או פיפטה מרובת מתקנים. זכור לשמור על בארות שליטה ללא תוספת של BrdU אלא עם תוספת של צבע מעקב מיטוכונדריה. - לדגור על התאים במשך 1 שעות (37 ° C ו 5% CO2).
6. קיבוע תאים
הערה: כל הכביסה מתבצעת בצורה הנוחה ביותר באמצעות מכונת כביסה microplate, בעוד תוספת של ריאגנטים מתבצעת במהירות הגבוהה ביותר באמצעות מתקן מגיב.
- באמצעות מכונת הכביסה microplate (ראה טבלה של חומרים), לשטוף כל באר פעמיים עם 100 μL של PBS. לאחר הכביסה השנייה, להשאיר 25 μL של PBS בבאר.
הערה: השארת PBS בבאר מפחיתה את הסבירות לניתוק תאים במהלך הוספת נוזל בשלב הבא. כל השטיפות הושלמו עם PBS נשאר בפנים; לכן, התמיסה שנוספה בשלב הבא צריכה תמיד להיות מוכנה בריכוז של פי 2 מכיוון שהיא תתווסף בנפח שווה ל- PBS הנותר. - תקן את התאים על ידי הוספת 25 μL של תמיסת פורמלדהיד 8% ב- PBS עם 0.4% Triton X-100 ו- Hoechst 33342 בריכוז של 4 מיקרוגרם / מ"ל (הריכוזים הסופיים של ריאגנטים בודדים הם 4%, 0.2% ו- 2 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה) (ראה טבלת חומרים).
- דוגרים על הצלחת בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
7. חסימה
- יש לשטוף כל באר ארבע פעמים עם 100 מיקרוליטר של PBS. לאחר השטיפה האחרונה, להשאיר 25 μL של PBS בבאר.
- הוסף 25 μL של 6% BSA ב- PBS (ריכוז BSA הסופי הוא 3%) לכל באר.
- דוגרים על הצלחת בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
8. הוספת הנוגדנים הראשוניים
- שואפים את BSA באמצעות מכונת כביסה microplate, ולהשאיר 10 μL של פתרון בבאר.
- הוסף 10 μL של תמיסת הנוגדנים הראשונית שהוכנה ב -3% BSA ב- PBS. השתמשו באנטי-BrdU ב-0.8 מיקרוגרם/מ"ל ובאנטי-דנ"א ב-0.4 מיקרוגרם/מ"ל (הריכוזים הסופיים של נוגדנים הם 0.4 מיקרוגרם/מ"ל ו-0.2 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה) (ראו טבלת חומרים).
- לדגור את הצלחת בחושך ב 4 ° C במשך הלילה.
9. הוספת נוגדנים משניים
- יש לשטוף כל באר ארבע פעמים עם 100 מיקרוליטר של PBS. לאחר השטיפה האחרונה, להשאיר 10 μL של PBS בבאר.
- הוסף 10 μL של תמיסת נוגדנים משנית 4 מיקרוגרם/מ"ל שהוכנה ב-6% BSA ב-PBS (הריכוז הסופי הוא 2 מק"ג/מ"ל). השתמש בנוגדנים ספציפיים לאיזוטיפ (IgG1 נגד עכבר ונגד עכבר IgM) מצומדים לפלואורוכרום כגון Alexa Fluor 488 ו- Alexa Fluor 555 (ראה טבלת חומרים).
- דוגרים על הצלחת בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה.
- יש לשטוף כל באר ארבע פעמים עם 100 מיקרוליטר של PBS. לאחר הכביסה האחרונה, להשאיר 50 μL של PBS בבאר.
- אטמו את הצלחת בסרט איטום דביק (ראו טבלת חומרים), ואחסנו אותה בחושך בטמפרטורה של 4°C. יש לבצע הדמיה תוך שבועיים.
10. הדמיה
הערה: יש לבצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי בעל שדה רחב; המיקרוסקופ חייב להיות מצויד בשלב מנוע המסופק עם פקדים כדי לצלם אזורים בודדים של הצלחת באופן אוטומטי.
- בדוק את הגדרות המיקוד האוטומטי באזורים הפינתיים של הצלחת (בארות A1, A24, P24, P1) ובמרכז.
הערה: להדמיה, מומלץ להשתמש ביעד מרחק עבודה קצר פי 20 (ראה טבלת חומרים) עם הצמצם המספרי הגבוה ביותר האפשרי. - בהתבסס על היסטוגרמות העוצמה שנוצרו על-ידי תוכנת ההדמיה במצב תצוגה חיה, בחרו זמן חשיפה ארוך מספיק לערוצי הפלואורסצנטיות הבודדים, כך שהתמונה המתקבלת לא תהיה רוויה יתר על המידה.
- הגדר את מספר המישורים המתאים להדמיה על ציר z.
הערה: שדה הראייה בהגדלה של 20x גדול מספיק כך שלא כל התאים נמצאים באותו מישור מיקוד, ולכן יש לבצע חתך z כדי להציג את כל התאים במישור המיקוד הנכון שלהם. בדרך כלל, חמישה מטוסים מספיקים. בהתאם לזמינות שטח הדיסק, ניתן לשמור ערימות z בודדות או רק הקרנות בעוצמה מרבית. ניתוח התמונה המוצג בסעיף התוצאות המייצגות מבוסס על הקרנות בעוצמה מרבית. - בחר את מספר שדות הראייה המתאים להצגה לכל באר.
הערה: בהתאם למפגש, ניתן לצלם כ- 60-300 תאים בשדה ראייה אחד. בדרך כלל, עבור תאי HeLa עם מפגש של 60%-90%, הדמיה של חמישה שדות ראייה תאפשר לנתח מ-500 תאים ליותר מ-1,000 תאים. - בחר את הבארות שברצונך לצלם והתחל בהדמיה.
11. ניתוח תמונה כמותי
הערה: ניתן לבצע ניתוח כמותי של תמונות שנרכשו באמצעות תוכנת קוד פתוח כגון Cell Profiler15. במחקר הנוכחי, הניתוח בוצע באמצעות תוכנת ScanR 3.0.0 (ראה טבלת חומרים).
- התחל את הניתוח על ידי ביצוע תיקון רקע עבור כל התמונות מכל ערוצי הפלואורסצנציה. בהתאם לגודל העצמים שנותחו, בחרו את גודל המסנן המתאים: 80 פיקסלים לגרעיני תאים ו-4 פיקסלים לכתמי BrdU ו-mtDNA.
- התחילו לפלח את התמונה על ידי יצירת מסיכה של העצם הראשי בהתבסס על היחס בין עוצמת האות הפלואורסצנטי לרקע של הערוץ המתאים לגרעיני התא.
- צרו מסיכות לתת-עצמים המייצגים את כתמי BrdU ו-mtDNA, בהתאמה, באמצעות תעלות פלואורסצנטיות המתאימות למבנים הנתונים.
הערה: כל תת-אובייקט מוקצה לאובייקט הראשי הקרוב ביותר (גרעין התא). - קבעו את הפרמטרים שיימדדו במהלך הניתוח, ומדו את עוצמת הפיקסלים הבודדים בכל מסיכה עבור כל ערוצי הפלואורסצנטיות.
הערה: כמו כן, יש לחשב את מספר תת-האובייקטים שהוקצו לגרעין תא נתון ואת השטח של כל תת-אובייקט. - הגדר את הפרמטרים הנגזרים שיחושבו בהתבסס על הנתונים המתקבלים. כדי לקבל את העוצמות הפלואורסצנטיות הכוללות עבור ערוץ BrdU או mtDNA, סכמו את העוצמות של כל תת-האובייקטים שהוקצו לגרעין תא נתון. כדי לקבל את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת, חלק את עוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת בסכום השטח של תת-העצמים שהוקצו לגרעין תא נתון.
הערה: כדי להבטיח שתת-האובייקט שנוצר (BrdU או mtDNA spot) אכן ממוקם במיטוכונדריה, יש צורך לשער אותם בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנטיות של צבע מעקב המיטוכונדריה. - בצע ניתוח נוסף של הנתונים המתקבלים באמצעות תוכנת ScanR באמצעות התוכנה הסטטיסטית R 4.2.216 יחד עם החבילות הבאות: dplyr 17, data.table18, ggplot219 ו- ggpubr20. שלב זה הוא אופציונלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סכימה של ההליך לחקר התפוקה הגבוהה של הדינמיקה של סינתזה והפצה של mtDNA מוצגת באיור 1. השימוש בפורמט של צלחת מרובת בארות מאפשר ניתוח סימולטני של תנאי ניסוי רבים ושונים, כגון השתקה של גנים שונים באמצעות ספריית siRNA. התנאים המשמשים לתיוג של מולקולות דנ"א מסונתזות חדשות עם BrdU מאפשרים זיהוי של דנ"א המסומן ב-BrdU במיטוכונדריה של תאי HeLa (איור 2A), אולם יכולים לשמש גם כתנאי התחלה להגדרת הבדיקה עבור סוגי תאים אחרים. יש לבחור את זמן הדגירה עם BrdU עבור שורות תאים בודדות על בסיס ניסוי של מסלול זמן (איור משלים 1). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בתאי HeLa, שכן סינון של siRNA דורש תאים שניתן להדביק ביעילות גבוהה. חשוב לציין שהאות המתקבל עם נוגדנים נגד BrdU הוא ספציפי, מאחר שניתן לראות אותו רק בתאים שטופלו ב-BrdU (איור 2). הספציפיות של תיוג אנטי-BrdU ואנטי-דנ"א אושרה עוד יותר באמצעות תאי rho0 חסרי דנ"א מיטוכונדריאלי21 (איור משלים 2). כצפוי, בתאים האלה, ללא קשר לטיפול ב-BrdU, לא זוהה אות במיטוכונדריה הן עבור נוגדנים נגד BrdU והן עבור נוגדנים נגד דנ"א (איור 2B). כימות האות הפלואורסצנטי מהנוגדנים נגד BrdU הצביע על כך שתאי rho0 שטופלו ב-BrdU הראו את אותה רמה נמוכה של פלואורסצנטיות כמו תאי BrdU שלא טופלו, בעוד שהאות עבור קווי ההורים A549 ו-HeLa היה, בממוצע, גבוה פי 50 (איור 2C).
כדי להראות את התועלת של השיטה שהוצגה כאן בחקר סינתזת הדנ"א המיטוכונדריאלי והפצתו, נערך ניסוי שבו תאי HeLa טופלו ב-2′,3′-dideoxycytidine (ddC), מעכב סינתזת mtDNA22, והביטוי של גנים הידועים כחיוניים לשכפול mtDNA הושתק באמצעות siRNA (איור 3)). הטיפול בתאים עם ddC הוביל לעיכוב מוחלט של שילוב BrdU, בעוד של- siRNA שנעשה בו שימוש היו השפעות מגוונות. הפחתת הרגולציה של מנחת המסוקים Twinkle (TWNK)23 הובילה לעיכוב החזק ביותר של התאגדות BrdU; השפעה חלשה יותר נצפתה עבור חלבון TFAM24, בעוד שההשתקה של הדנ"א המיטוכונדריאלי פולימראז גמא (POLG)25 הובילה לירידה מתונה בשילוב BrdU בהשוואה לתאים שטופלו ב-siRNA שלילי (איור 3A,B). השימוש בנוגדנים נגד DNA בהליך מאפשר ניטור של התפלגות mtDNA בתא בתנאי הניסוי הנתונים. הירידה ברגולציה של TFAM הובילה לשינויים דרסטיים בהתפלגות mtDNA; פחות כתמי mtDNA התגלו בהשוואה לתאי ביקורת, אולם אלה שנותרו היו בעלי עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה מאוד (איור 3A). כימות האות הפלואורסצנטי הממוצע מהנוגדן נגד דנ"א הראה עלייה של פי כמה בהשתקת TFAM בהשוואה למצבים אחרים שנבדקו (איור 3C).
הספציפיות של תוצאות ההדמיה אומתה על-ידי מדידת mtDNA ורמות ביטוי גנים בעזרת PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) (איור 4). השיטה תוארה בפירוט במקום אחר26. הטיפול ב- ddC הביא לירידה חזקה מאוד ברמות mtDNA; השפעה חלשה יותר נצפתה במקרה של השתקת TFAM ו-TWNK, בעוד שלטרנספקציה של תאים עם POLG siRNA הייתה השפעה צנועה מאוד על מספר העתק mtDNA (איור 4A). כימות הביטוי TFAM ו-TWNK אישר הפחתה יעילה בביטוי שלהם ל~15%-20% מרמות הבקרה, בניגוד ל-POLG, שהביטוי שלו ברמת ה-mRNA הופחת ל-30% (איור 4B).
איור 1: ייצוג סכמטי של שלבי הפרוטוקול. פסי קנה המידה של התמונות המיקרוסקופיות הם 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זיהוי ספציפי של שילוב BrdU ב-mtDNA על-ידי נוגדנים נגד BrdU. תמונות לדוגמה של (A) HeLa ו- (B) A549 ו- A549 rho0 תאים הנתונים לצביעת immunofluorescence עם נוגדנים anti-BrdU (ירוק) ו anti-DNA (אדום). התאים טופלו או לא טופלו בתמיסת BrdU. דנ"א גרעיני (כחול) סומן עם Hoechst, והמיטוכונדריה (ציאן) הודגמו באמצעות צבע מעקב מיטוכונדריה. מוצגת תמונה ממוזגת של כל ארבעת ערוצי הפלואורסצנטיות. סרגל קנה המידה מייצג 10 מיקרומטר. (C) התוצאה של כימות האות מהנוגדנים נגד BrdU. הניתוח בוצע עבור ארבעה עותקים ביולוגיים בלתי תלויים; בכל פעם, 100 תאים שנבחרו באופן אקראי נותחו עבור כל תנאי ניסוי (N = 400 תאים). בממוצע, 18 מוקדי BrdU זוהו בכל תא. התיבות מייצגות את הרביעון הראשון והשלישי של הטווח הבין-רבעוני (IQR), החציון מיוצג על ידי קו אופקי, השפם מגדיר את המינימום והמקסימום, והחריגים מוגדרים כ-1.5 x IQR. בוצע מבחן סטטיסטי קרוסקל-ואליס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות של עיכוב סינתזת mtDNA, כולל הפחתת היעילות של שילוב BrdU והשפעה על התפלגות הנוקלאואידים. (A) דגימה של תמונות פלואורסצנטיות של תאי HeLa שטופלו במשך 72 שעות עם ddC או siRNA, אשר מווסתים את החלבונים המעורבים בשכפול mtDNA. התאים טופלו ב-BrdU במשך 16 שעות לפני הקיבוע. הדנ"א הגרעיני (כחול) הוכתם בנוגדנים Hoechst, נעשה שימוש בנוגדנים נגד BrdU (ירוק) ונגד DNA (אדום), והמיטוכונדריה סומנו בצבע מעקב מיטוכונדריה. מוצגת תמונה ממוזגת של כל ארבעת ערוצי הפלואורסצנטיות. סרגל קנה המידה מייצג 10 מיקרומטר. (B,C) כימות אותות הפלואורסצנטיות מ-(B) נוגדנים נגד BrdU ו-(C) נוגדנים נגד DNA. הניתוח בוצע עבור ארבעה עותקים ביולוגיים בלתי תלויים; בכל פעם, 650 תאים שנבחרו באופן אקראי נותחו עבור כל תנאי ניסוי (N = 2,600 תאים). בממוצע, 18 מוקדי BrdU ו-46 מוקדי mtDNA זוהו בכל תא. התיבות מייצגות את הרביעון הראשון והשלישי של הטווח הבין-רבעוני (IQR), החציון מיוצג על ידי קו אופקי, השפם מגדיר את המינימום והמקסימום, והחריגים מוגדרים כ-1.5 x IQR. בוצע מבחן סטטיסטי קרוסקל-ואליס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אימות היעילות של עיכוב סינתזת mtDNA ושל היעילות של siRNA שנבדק. תאי HeLa טופלו במשך 72 שעות עם ddC או siRNA שצוינו ולאחר מכן היו נתונים לבידוד DNA ו- RNA. (A) תוצאות ניתוח רמת mtDNA באמצעות qPCR. (B) ניתוח qPCR של שינויים בביטוי גנים בתנאים שצוינו. העמודות מייצגות את הערכים הממוצעים של ארבעה עותקים ביולוגיים בלתי תלויים; קווי השגיאה מייצגים את ה- SEM; בוצע מבחן סטטיסטי ANOVA; בוצעה בדיקת T להשוואה זוגית מול דגימות Untr (לא מטופלות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: דינמיקה של שילוב BrdU ב-mtDNA של תאי HeLa. תוצאות ניסוי במסלול זמן שבו התאים הודגרו עם 20 מיקרומטר BrdU לזמן נתון מוצגות. מוצגים האמצעים של ארבעה עותקים משוכפלים עצמאיים עבור כל נקודת זמן; 900 תאים שנבחרו באופן אקראי נותחו בכל שכפול. הסורגים מייצגים את האמצעים של ארבעה עותקים משוכפלים; בוצע מבחן סטטיסטי ANOVA. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: אימות תאי Rho0 A549. (A) אנליזה אלקטרופורטית של תוצרי qPCR מהגברת מקטעי DNA של ND1 המקודד mtDNA וגנים B2M המקודדים לדנ"א גרעיני. סה"כ דנ"א מתאי A549 או A549 rho0 שימש כתבניות בתגובה. (B) תוצאות ניתוח רמת mtDNA באמצעות qPCR. העמודות מייצגות את הערכים הממוצעים של ארבעה עותקים ביולוגיים בלתי תלויים; קווי השגיאה מייצגים את ה- SEM; בוצע מבחן T. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מבחינה היסטורית, תיוג DNA על ידי שילוב BrdU וזיהוי נוגדנים שימש בשכפול DNA גרעיני ומחקר מחזור התא 14,27,28. עד כה, כל הפרוטוקולים לזיהוי DNA המסומן ב- BrdU כללו שלב דנטורציה של DNA (חומצי או תרמי) או עיכול אנזים (DNase או פרוטאינאז) כדי לאפשר חשיפה לאפיטופים ולהקל על חדירת נוגדנים. פרוטוקולים אלה פותחו עבור דנ"א גרעיני צפוף. עם זאת, הארגון השונה של mtDNA איפשר פיתוח של הליך ללא שלב הדנטורציה; זה פישט את ההליך והפך אותו מתאים יותר ליישומים בעלי תפוקה גבוהה. גישה זו הביאה לתוצאות מצוינות מאחר שהשמטת שלב הדנטורציה גורמת לזיהוי דנ"א המסומן ב-BrdU רק מחוץ לגרעין (איור 2 ואיור 3). כתוצאה מכך, ניתן להימנע מהאות החזק מהדנ"א הגרעיני, אשר קיים תמיד כאשר שלב דנטורציה כלול ואשר עלול לגרום לבעיה חמורה על ידי מיסוך האות מ- mtDNA29 המסומן ב- BrdU, ניתן להימנע באמצעות פרוטוקול זה. נוסף על כך, היעדר דנטורציה קשה מבטיח שימור טוב יותר של המבנים התאיים ואינו משפיע על יעילות הכתמים על-ידי כתמים פלואורסצנטיים כמו Hoechst או צבע מעקב מיטוכונדריה (איור 2 ואיור 3).
הדינמיקה של שילוב BrdU ב- mtDNA תלויה בקו התא. מומלץ לבצע ניסוי בזמן על שילוב BrdU בכל פעם שמשתמשים בקו תאים חדש. מחקר זה קבע 16 שעות כזמן דגירה אופטימלי של BrdU עבור קווי תאי HeLa. עם זאת, בשל השונות הביולוגית בקווי HeLa ממעבדות שונות30, מוצע לבצע ניסוי מסלול זמן BrdU על וריאנט HeLa מסוים שמתכננים לעבוד איתו.
השילוב של תיוג אנטי-BrdU ואנטי-DNA בפרוטוקול זה מאפשר ניטור של סינתזת mtDNA ומחקר סימולטני של התפלגות mtDNA בתא. אפשר לראות זאת היטב בתאים מושתקי TFAM (איור 3). ירידה ברמת TFAM מובילה לירידה בסינתזה של mtDNA (ירידה בסך הסיגנל האנטי-BrdU) ולקיבוץ של נוקליואידים מיטוכונדריאליים, אשר מתבטאת בעלייה משמעותית באות הפלואורסצנטי הממוצע של mtDNA (איור 3). יש לציין כי במקרה זה, העלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של mtDNA נגרמת על ידי שינוי ההתפלגות של גרעיני המיטוכונדריה ואינה משקפת את הרגולציה של רמות mtDNA; למעשה, רמות mtDNA מופחתות, כפי שנחשף על-ידי ניתוח PCR כמותי (איור 4A). תוצאות מפתיעות התקבלו עבור תאים שעברו טרנספורמציה של POLG siRNA (איור 3). ניתן היה לצפות כי טרנספקציה של תאים עם POLG ממוקד siRNA, שהוא פולימראז DNA משוכפל במיטוכונדריה, תפחית באופן משמעותי את שילוב BrdU לתוך mtDNA. אולם במחקר זה, ההשפעה על שילוב BrdU הייתה זניחה (איור 3), כפי שאושר עוד יותר על-ידי מדידת רמות mtDNA באמצעות qPCR (איור 4A). הירידה בוויסות הלקוי של ביטוי POLG יכולה להסביר את התוצאה הסותרת לכאורה הזו עם טרנספקציה של תאים עם siRNA מוחל (איור 4B). זה מדגיש את החיסרון הפוטנציאלי של שימוש ב- siRNA למחקרים פונקציונליים ומציע כי יש צורך באימות השתקת גנים.
בסך הכל, פותחה בדיקה לחקר הדינמיקה של מטבוליזם mtDNA בתאים בתרבית המשתמשת בפורמט צלחת מרובת בארות והדמיית אימונופלואורסנציה כדי לזהות ולכמת שכפול, תיקון והפצה של mtDNA. השיטה מאפשרת לימוד סימולטני של תנאי ניסוי רבים ושונים. ניתן להשתמש בו כדי לחקור את ההשפעות של מעכבים שונים, לחצים תאיים והשתקת גנים על חילוף החומרים של mtDNA. בעוד שלבדיקה יש פוטנציאל גבוה לשימוש בחקר מטבוליזם mtDNA בהקשרים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים, יש לציין כי הבדיקה אינה מאפשרת הבחנה בין סינתזת mtDNA מקושרת לשכפול ותיקון. זה צריך להיחשב בעת פירוש התוצאות ותכנון ניסויים פונקציונליים הבאים. יש לציין כי לבדיקה יש פוטנציאל נוסף לפיתוח. לדוגמה, נוקלאואידים מיטוכונדריאליים שאינם פעילים בשכפול (או שאינם פעילים לתיקון) אינם מזוהים עם נוגדנים נגד BrdU. לכן, יישום נוגדנים אנטי-דנ"א מאפשר לכמת את רמות מצב mtDNA, את מספר הנוקליואידים השקטים בשכפול ואת התפלגות הנוקליואידים בתא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למדע, פולין (מספר מענק/פרס: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
- Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
- Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
