Um Método Preciso e Quantificável para Coleta de Hemolinfa de Pequenos Artrópodes

Summary

Descrevemos um método para coletar hemolinfa quantificável eficientemente de pequenos artrópodes para posterior análise.

Abstract

Os artrópodes são conhecidos por transmitir uma variedade de vírus de importância médica e agrícola através de sua hemolinfa, que é essencial para a transmissão do vírus. A coleta de hemolinfa é a tecnologia básica para o estudo das interações vírus-vetor. Aqui, descrevemos um método novo e simples para a coleta quantitativa de hemolinfa de pequenos artrópodes usando Laodelphax striatellus (a cigarrinha marrom pequena, SBPH) como modelo de pesquisa, já que este artrópode é o principal vetor do vírus da listra de arroz (VSR). Neste protocolo, o processo começa beliscando suavemente uma perna do artrópode congelado com pinças de ponta fina e pressionando a hemolinfa para fora da ferida. Em seguida, uma micropipeta simples composta por um capilar e um bulbo de pipeta é usada para coletar a hemolinfa transudativa da ferida de acordo com o princípio das forças capilares. Finalmente, a hemolinfa coletada pode ser dissolvida em um tampão específico para estudo posterior. Este novo método de coleta de hemolinfa de pequenos artrópodes é uma ferramenta útil e eficiente para futuras pesquisas sobre arbovírus e interações vetor-vírus.

Introduction

Tanto os vírus animais quanto os vegetais podem ser transmitidos por artrópodes, e esses vírus representam uma grave ameaça à saúde humana e causam enormes perdas econômicas na agricultura ^1,2,3. É importante ressaltar que a hemolinfa dos artrópodes, que serve como sistema circulatório e um elemento vital do sistema imunológico nos artrópodes, desempenha um papel importante na regulação da transmissão das arbovirais. Os vírus adquiridos através do intestino dos artrópodes são transportados para outros tecidos somente após escaparem com sucesso do ambiente adverso da hemolinfa 4,5,6,7. O ciclo de vida dos vírus na hemolinfa dos artrópodes envolve a sobrevivência do vírus no plasma fluido, a entrada no hemócito e o transporte para outros tecidos, e vários mecanismos de interação vírus-vetor ocorrem na hemolinfa 8,9,10,11,12. Por exemplo, a transmissão vertical do VSR pelo SBPH é dependente de uma interação molecular entre a proteína vitelogenina SBPH e a proteína capsídeo do VSR (rice stripe virus)^13,14. Alguns vírus podem escapar da resposta imune da hemolinfa ligando-se a fatores vetoriais específicos15,16,17,18. Portanto, investigar as interações vetor-vírus na hemolinfa de artrópodes é importante para o melhor entendimento da transmissão de arbovírus.

A hemolinfa de alguns pequenos insetos, como cigarrinhas, cigarrinhas e alguns mosquitos, é difícil de coletar devido ao seu tamanho. Para resolver essa questão, vários métodos foram desenvolvidos para coletar hemolinfa, incluindo a inserção de uma agulha de seringa diretamente no corpo do inseto para extrair um microvolume da hemolinfa, coleta de exsudato do local da ferida com pinça de ponta fina e centrifugação direta. Esses métodos têm possibilitado a mensuração dos níveis relativos de expressão gênica e dos títulos virais dentro da hemolinfa 19,20,21. No entanto, um método eficaz para quantificar o volume da hemolinfa, necessário para contagem de hemócitos, quantificação de proteínas e análise da atividade enzimática, não está atualmente disponível para esses pequenos insetos.

O SBPH (pequena cigarrinha marrom) é um tipo de pequeno inseto vetor com um comprimento do corpo de cerca de 2-4 mm. O SBPH é capaz de transmitir uma variedade de vírus de plantas, incluindo o VSR, o vírus da anã áspera do milho e o vírus da anã estriada preta do arroz^22,23,24. A interação entre o SBPH e o VSR tem sido estudada em profundidade na última década. Para facilitar o trabalho com SBPHs, desenvolvemos um método novo e simples de coleta de hemolinfa. Este método, que se baseia no princípio das forças capilares, utiliza um capilar com uma marca de escala para adquirir a hemolinfa do inseto de forma precisa e quantificável. Isso nos permite coletar um volume específico de hemolinfa de pequenos insetos de forma eficiente e estudar o ambiente da hemolinfa de pequenos vetores com mais detalhes.

Protocol

1. Criação de insetos

1. Elevar os PBPs utilizados neste experimento em mudas de arroz (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plantar 20 mudas de arroz em estufa (65 mm x 200 mm) e crescer a 25 °C sob fotoperíodo de 16 h claro/8 h escuro.

2. Dissecção das SBPHs para coleta de hemolinfa

1. Coloque os SBPHs em um tubo de centrífuga e coloque-os em um banho de gelo por 10-30 min.
   NOTA: Não coloque os SBPHs no banho de gelo por menos de 10 min, ou os insetos podem reviver.
2. Coloque um SBPH congelado em uma lâmina de vidro (ver Tabela de Materiais) sob um estereomicroscópio (ver Tabela de Materiais) com seu abdômen voltado para cima. Ajuste o foco nas seis pernas do inseto.
3. Prepare duas pinças de alta precisão (consulte Tabela de Materiais) com pontas ultrafinas. Use uma pinça para pressionar o corpo do inseto para mantê-lo no lugar e use a outra para puxar cuidadosamente uma das pernas do inseto.
   NOTA: Para insetos com uma casca dura, um bisturi oftálmico pode ser usado para cortar uma das pernas.
4. Pressione suavemente o peito do inseto com uma pinça para fazer a hemolinfa fluir para fora através da ferida.
   NOTA: A hemolinfa apresenta-se como gotículas transparentes sem qualquer flocula branca visível. Descarte o lipídio se houver algum flocículo branco, que representa contaminação do corpo gorduroso.

3. Coleta de hemolinfa utilizando micropipetas

1. Prepare uma micropipeta. Coloque um tubo capilar (ver Tabela de Materiais) com um volume de 1 μL no bulbo da pipeta (ver Tabela de Materiais). Para medições precisas, certifique-se de que a linha da escala esteja visível.
   NOTA: É necessário um pequeno orifício na parte superior da lâmpada da pipeta.
2. Ao coletar a hemolinfa, segure o bulbo da pipeta da micropipeta e coloque o tubo capilar próximo à ferida do inseto. Coletar a hemolinfa exsudada da ferida simplesmente tocando a ponta do capilar para a hemolinfa.
3. Bloqueie ligeiramente o pequeno orifício na parte superior do bulbo da pipeta com o dedo para interromper o processo de absorção quando o líquido dentro do tubo capilar atingir a linha de escala desejada.
   NOTA: Coletar uma amostra de 1 μL de hemolinfa incessante e rapidamente para evitar contaminação lipídica e tamponamento do tubo.
4. Pressione o bulbo da pipeta para descarregar a hemolinfa coletada em 100 μL de tampão PBS (NaCl 137 mmol/L, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4).
   NOTA: O tubo capilar é inserido no tampão PBS.
5. Mudança para um novo tubo capilar ao coletar outra amostra de 1 μL de hemolinfa.

4. Coloração Coomassie Blue

1. Coletar 3 amostras de hemolinfa com o mesmo volume (1 μL) de larvas de 3º estágio de acordo com os protocolos descritos na etapa 3, e descarregar a hemolinfa coletada no tampão PBS para totalizar um volume de 100 μL.
2. Adicionar 25 μL de tampão de carga proteico 5x (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6,8], 10% P/V SDS, 0,05% P/V Azul de Bromofenol, 50% P/V glicerol, 5% P/V β-mercaptoetanol) em 100 μL das amostras diluídas de hemolinfa e aquecer para desnaturar as proteínas.
3. Carregar 20 μL das amostras fervidas num gel proteico SDS-PAGE a 10% (ver Tabela de Materiais) para separar as proteínas.
4. Manchar o gel numa solução de Coomassie Blue (misturar 1 g de Coomassie Brilliant Blue R-250 com 250 ml de isopropanol, 100 ml de ácido acético glacial e 650 ml de ddH₂O, e filtrar quaisquer partículas utilizando papel de filtro) durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, descolorir o gel durante 1 h com solução descolorante (100 ml de ácido acético, 400 mL de metanol, 500 mL de ddH₂O).

5. Determinação da concentração de proteínas

1. Diluir 10 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) para 5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1,25 mg/mL, 0,625 mg/mL e 0,3125 mg/mL com tampão PBS usando o método de diluição dupla.
2. Aspirar 5 μL de tampão PBS e cada concentração de soluções BSA na etapa 5.1, adicionar 1 mL de 1x reagente corante Bradford (ver Tabela de Materiais) e incubar por 5 min à temperatura ambiente. Use buffer PBS no reagente de corante Bradford como controle, e zero em OD = 595 nm. Meça os valores de absorbância de cada uma das concentrações de proteína restantes e faça uma curva padrão.
3. Adicionar 1 μL de hemolinfa de SBPHs larvais, fêmeas ou machos em 100 μL de tampão PBS e, em seguida, centrifugar as amostras a 1.000 x g por 10 min a 4 °C para remover os hemócitos.
4. Aspirar 90 μL de sobrenadante para um novo tubo de centrifugação e medir os valores de absorbância do sobrenadante de acordo com as instruções do passo 5.2.
5. Calcular as concentrações proteicas das amostras de hemolinfa de acordo com a equação de regressão da curva padrão. Incluir três réplicas biológicas com três réplicas técnicas nos experimentos.

6. Detecções microscópicas

1. Use micropipetas para coletar hemolinfa de 10-15 SBPHs em diferentes estágios de desenvolvimento. Adicionar a hemolinfa coletada em um tubo contendo 20 μL de solução de paraformaldeído a 4% (ver Tabela de Materiais). Incubar a mistura à temperatura ambiente por 30 min para fixar a hemolinfa.
2. Pipetar 20 μL de hemócitos fixos para o centro de uma lâmina revestida com silano (ver Tabela de Materiais).
3. Seque a gota em uma prateleira de secagem de lâmina.
   OBS: Evite secagem excessiva.
4. Cobrir a amostra com o reagente antifade de ouro 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (ver Tabela de Materiais) e inspecionar a lâmina sob um microscópio invertido (ver Tabela de Materiais).

7. Quantificação celular

1. Coletar 1 μL de hemolinfa das SBPHs com uma micropipeta e dissolvê-la em 20 μL de tampão PBS.
2. Diluir as amostras de hemolinfa cinco vezes com tampão PBS.
3. Pipetar 20 μL de solução de hemolinfa para o centro da câmara de contagem de células (ver Tabela de Materiais). Cubra a gota com uma lamínula (ver Tabela de Materiais).
4. Contar as células nos cinco quadrados da câmara de contagem de células (Figura 1 Suplementar), em microscópio invertido (ver Tabela de Materiais). Incluir três réplicas biológicas com três réplicas técnicas em cada um dos experimentos.
   Células/μL = contagem total de cinco quadrados médios × fator de diluição de 5 × × 10⁴

8. Análise estatística

1. Realizar análises estatísticas com o software correspondente (ver Tabela de Materiais). Crie um novo arquivo, selecione a coluna, importe os dados e gere um gráfico de dispersão com uma barra.
2. Calcule a média e o DP para cada grupo de dados usando estatísticas de coluna e use uma ferramenta ANOVA unidirecional para avaliar a significância das diferenças entre os grupos. Determinar a média e o DP a partir de três réplicas biológicas com três experimentos independentes.

Results

Modelo de micropipeta e coleta de hemolinfa
Desenvolvemos uma micropipeta simples cuja ação é baseada nas forças capilares do tubo capilar. A micropipeta é composta por um tubo capilar e um bulbo de pipeta (Figura 1A). Os tubos capilares estão disponíveis em diferentes tamanhos de volume, variando de 1 μL a 20 μL, e os volumes dos tubos capilares são selecionados de acordo com as necessidades. Tubos capilares com volumes menores não são sugeridos, pois as aberturas extraf...

Discussion

A hemolinfa é o meio do sistema circulatório nos artrópodes, e os arbovírus só podem invadir outros tecidos dos artrópodes se forem capazes de sobreviver ao ambiente hostil da hemolinfa. A coleta de uma amostra de hemolinfa de alta qualidade é o primeiro passo para estudar as interações vetor-vírus que ocorrem na hemolinfa. Tem sido relatado que a hemolinfa do inseto pode ser obtida de vários locais do corpo do inseto, incluindo uma ferida na perna dianteira, uma pequena incisão na área da cabeça ou uma ferida lacrimal n...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% de gel de proteína SDS-PAGE	Bio-rad	4561035	Separação e detecção
de proteínas 4% de paraformaldeído	Solarbio	P1110	Para fixação das células ou tecidos
Reagente corante Bradford	Bio-rad	5000205	Detecção da concentração de proteínas
Capilar	Hirschmann	9000101	Para recolha de hemolinfa
Câmara de contagem de células	ACMEC	AYA0810	Contagem de hemócitos
Lâmina de vidro	Gitoglas	10127105A	Para segurar insectos
Lâmina de vidro revestida com silano	Sigma	S4651-72EA	Para a realização de amostras
de microscópio Reagente antidesvanecimento de ouro com DAPI	Invitrogen	P36935	Coloração do núcleo
Vidro de cobertura do microscópio	Gitoglas	10212424C	Para observação microscópica
Bulbo de pipeta	Hirschmann	9000101	Para coleta de hemolinfa
Software Prism 8.0	Software GraphPad	/	Análises estatísticas
Estereomicroscópio	Motic	SMZ-168	dissecação de insetos
	Tianld	P5622	Para dissecação de insetos
Zeiss microscópio invertido	Zeiss	Observer Z1	Observação de hemócitos