Isolamento sem etiquetas em duas etapas de mitocôndrias para melhor descoberta e quantificação de proteínas

Resumo

Apresentamos um protocolo em duas etapas para isolamento de mitocôndrias de alta qualidade que é compatível com a descoberta e quantificação de proteínas em escala de proteoma. Nosso protocolo não requer engenharia genética e, portanto, é adequado para estudar mitocôndrias de quaisquer células e tecidos primários.

Resumo

A maioria dos processos fisiológicos e patológicos, desde o metabolismo central até a resposta imune à neurodegeneração, envolve mitocôndrias. O proteoma mitocondrial é composto por mais de 1.000 proteínas, e a abundância de cada uma delas pode variar dinamicamente em resposta a estímulos externos ou durante a progressão da doença. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar mitocôndrias de alta qualidade de células e tecidos primários. O procedimento em duas etapas compreende (1) homogeneização mecânica e centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias brutas e (2) captura imune de mitocôndrias sem tags para isolar organelas puras e eliminar contaminantes. As proteínas mitocondriais de cada estágio de purificação são analisadas por espectrometria quantitativa de massas, e os rendimentos de enriquecimento são calculados, permitindo a descoberta de novas proteínas mitocondriais por proteômica subtrativa. Nosso protocolo fornece uma abordagem sensível e abrangente para estudar o conteúdo mitocondrial em linhagens celulares, células primárias e tecidos.

Introdução

As mitocôndrias são organelas complexas e dinâmicas capazes de sentir e se adaptar às necessidades metabólicas da célula. Centrais para a complexidade do metabolismo celular, as mitocôndrias atuam como centros metabólicos onde convergem as reações de carboidratos, proteínas, lipídios, ácidos nucléicos e cofatores^{de metabolismo 1}. Servem também como organelas sinalizadoras para vias da resposta imune inata e em resposta a mudanças em íons e espécies reativas de oxigênio ^2,3. Até o momento, cerca de 1.100 proteínas foram mapeadas para mitocôndrias ^4,5,6, mas podemos supor que muitas mais ainda precisam ser descobertas^, especialmente aquelas expressas apenas em certos tipos celulares ou transitoriamente sob condições ambientais específicas. O desenvolvimento de novas abordagens para quantificar as alterações na composição mitocondrial em estados metabólicos de interesse aumentará nosso conhecimento sobre essas organelas e destacará novos caminhos terapêuticos para os distúrbios caracterizados pela disfunção mitocondrial⁷.

Atualmente, diferentes protocolos de isolamento de mitocôndrias estão disponíveis, com diferentes rendimentos e níveis de^pureza8. As abordagens baseadas em centrifugação são as mais populares, devido à sua simplicidade e baixo custo. Embora adequada para a maioria das aplicações, a centrifugação diferencial tem a desvantagem de obter menor pureza mitocondrial e exigir grandes quantidades de material de partida quando aplicações baseadas em gradiente de densidade mais complexas são usadas. Nos últimos anos, novos métodos para o isolamento de mitocôndrias têm surgido, como a captura imune baseada em tags ("MITO-IP")⁹ e a classificação de organelas ativadas por fluorescência10. Embora ambos os procedimentos possam gerar amostras com alta pureza, o primeiro requer engenharia genética para marcar mitocôndrias para purificação por afinidade, tornando os protocolos incompatíveis com material primário de organismos não modificados ou doadores humanos. Enquanto isso, este último depende do acesso à citometria de fluxo e instrumentos de triagem. A combinação de diferentes métodos de isolamento oferece a promessa de gerar protocolos mais robustos e maior pureza.

Aqui, apresentamos um novo protocolo para isolamento mitocondrial baseado na combinação de dois métodos existentes: (1) centrifugação diferencial para isolar uma fração mitocondrial bruta e (2) captura imune livre de tags de mitocôndrias com esferas superparamagnéticas ligadas covalentemente a anticorpos contra translocase da membrana mitocondrial externa 22 (Tomm22)¹¹, uma proteína mitocondrial ubíqua de membrana externa (Figura 1). O procedimento que descrevemos é compatível com espectrometria quantitativa de massa de proteínas e, por ser livre de tags e não exigir manipulação genética, pode ser aplicado a uma ampla gama de modelos de pesquisa, desde linhagens celulares até fluidos corporais e tecidos animais inteiros. Além disso, a utilização de duas etapas no protocolo possibilita o uso da proteômica subtrativa ^6,12 para a descoberta de novas proteínas mitocondriais e o estudo de sua expressão.

Protocolo

As luvas devem ser usadas em todos os momentos e as etapas de cultura celular devem ser realizadas sob uma capela de fluxo laminar. As células são mantidas em estufa a 37 °C com 5% de CO₂. A pesquisa apresentada neste protocolo foi aprovada e realizada de acordo com as diretrizes da Universidade de Lausanne e da Suíça para o uso de animais.

1. Cultura da linhagem celular de macrófagos RAW264.7

1. Cultivar as células RAW264.7 de macrófagos de camundongos em meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com glicose e glutamina elevadas suplementadas com 5% de soro fetal bovino inativado pelo calor (HI-FBS) e 100 UI/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina (P/S).
   NOTA: Para isolar mitocôndrias, uma única placa confluente de 15 cm (cerca de 70 x 10 7 células RAW264.7) é suficiente.
2. Manter as células RAW264.7 em placas de cultura de tecidos. Uma densidade de semeadura inicial de 1 x 10⁵ células/mL leva a uma placa confluente em 3 dias. Utilizar 25 mL de suspensão celular em meio para uma placa de 15 cm. As células RAW264.7 têm uma alta taxa de divisão celular e precisam ser divididas com mais frequência do que a maioria das linhagens celulares.
3. Desanexando células RAW264.7
   1. Aspirar o meio e lavar as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   2. Para uma placa de 15 cm, adicionar 8 mL de tampão de dissociação RAW quente (cloreto de potássio 270 mM, citrato de sódio di-hidratado 30 mM em H₂O, filtrado estéril) e incubar as células a 37 °C por 5 min.
   3. Adicionar um volume equivalente de meio às placas (diluição 1:1 do tampão de dissociação) e pipetar para separar e homogeneizar as células.
   4. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico e centrifugar o tubo a 300 x g por 3 min à temperatura ambiente.
   5. Aspirar o sobrenadante e voltar a suspender o pellet num volume adequado de meios (descrito no passo 1.1) para contagem celular.
      Observação : outros métodos para desanexar células RAW264.7 podem ser usados, como tripsina ou um raspador de células. No entanto, esses métodos são mais severos sobre as células e podem levar à sua polarização em macrófagos do tipo M1 nos dias seguintes ao descolamento.

2. Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs)

Observação : o protocolo descrito aqui é para um único mouse e pode ser ampliado para vários mouses. Protocolos detalhados para isolamento e cultura de BMDM foram descritos em outros trabalhos^13,14.

1. Sacrificar um rato C57BL/6 com 8-12 semanas de idade com uma dose elevada de CO₂.
   NOTA: Podem ser utilizados ratinhos machos ou fêmeas.
2. Borrife o rato com etanol a 75% para esterilizá-lo.
3. Dissecar e coletar quadris, fêmures e tíbias do camundongo¹⁵.
4. Para coletar a medula óssea dos fêmures e tíbias, remova a extremidade articular do joelho de ambos os ossos¹⁵. Recuperar a medula óssea dos quadris removendo o acetábulo.
5. Transferir os ossos para um tubo cônico de 50 mL com 4 mL de meio BMDM mantido em gelo (DMEM com glicose e glutamina elevadas suplementadas com 5% de HI-FBS, P/S e HEPES 10 mM).
   OBS: É importante manter os ossos na média para evitar o ressecamento da medula óssea durante a dissecção.
6. Adicionar 4 mL de PBS e 4 mL de meio BMDM quente em dois poços diferentes de uma placa de 6 poços.
7. Transfira os ossos e o meio do tubo cônico de 50 mL para um poço vazio da placa de 6 poços.
8. Usando um par de pinças, transfira os ossos para o PBS bem para lavá-los.
9. Transfira os ossos para o poço contendo o meio BMDM quente.
10. Faça um orifício de 1-2 mm de diâmetro no fundo de dois tubos de 0,5 mL com a pinça e coloque-os em um tubo de 1,5 mL.
    NOTA: Não é necessário adicionar mídia ao tubo para esta etapa rápida.
11. Em cada tubo de 0,5 mL, coloque um fêmur, tíbia e quadril de tal forma que a medula óssea dos ossos expostos fique voltada para o fundo dos tubos.
12. Centrifugar os tubos a 13.000 x g por 1 min à temperatura ambiente para coletar a medula óssea e o meio remanescente através do orifício do tubo de 0,5 mL e no tubo de 1,5 mL. Descarte os tubos de 0,5 mL com os ossos.
13. Ressuspender os pellets de medula óssea em meio BMDM e transferir para um tubo cônico de 15 mL.
14. Adicionar meios BMDM até 10 mL.
15. Coloque um filtro celular de 40 μm em um tubo cônico de 50 mL e filtre a suspensão da medula óssea através dele.
16. Centrifugar a suspensão filtrada a 300 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente para recuperar as células intactas e remover pequenos detritos da suspensão celular.
17. Preparar 70 mL de meio BMDM suplementado com 50 ng/mL de fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF).
18. Ressuspender o pellet em 10 mL de meio BMDM suplementado com M-CSF.
19. Adicionar 9 mL de meio BMDM suplementado com M-CSF a cada uma das sete placas de Petri de 10 cm.
20. Placa de 1 mL de células (em torno de 1 x 10⁷ células) em cada uma das sete placas de Petri de 10 cm.
21. Homogeneizar a suspensão celular em cada placa pipetando cuidadosamente para cima e para baixo na placa e transferir as placas para a incubadora.
22. Após 3 dias, adicionar 5 mL de meio BMDM aquecido suplementado com 50 ng/mL M-CSF a cada placa.
23. Após 3 dias (dia 6, após isolamento da medula óssea), verificar adesão e diferenciação da DMO por microscopia.
    NOTA: Neste ponto, é possível proceder diretamente ao isolamento mitocondrial (passo 3). Alternativamente, pode-se repor o BMDM, o que permite tratá-los com citocinas e pequenas moléculas.
24. Desdestacando os BMDMs
    1. Aspirar o meio de cada placa e adicionar 7 mL de PBS frio suplementado com 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
    2. Incubar as células a 4 °C durante 7-8 min.
    3. Separe as BMDMs pipetando cuidadosamente para cima e para baixo usando uma pipeta de 10 mL.
    4. Junte os BMDMs ressuspendidos de todas as sete placas em um único tubo cônico de 50 mL e centrífuga a 300 x g por 3 min à temperatura ambiente.
    5. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 40 mL de meio BMDM aquecido para contagem celular.
       NOTA: Entre 7-9 x 10⁷ BMDMs são obtidos por mouse. Um mínimo de 6 x 10⁷ BMDMs para isolamento mitocondrial é recomendado para proteômica.
    6. Se desejar, plaquear e tratar as BMDMs de acordo com o objetivo experimental. Caso contrário, prossiga diretamente para a etapa 3.3.

3. Preparação de uma fracção mitocondrial bruta por centrifugação diferencial

NOTA: Execute todas as etapas de centrifugação a 4 °C. Duas centrífugas são necessárias, uma com rotor oscilante e adaptadores para tubos cônicos com uma força centrífuga relativa de pelo menos 300 x g, a outra com uma força centrífuga relativa de pelo menos 21.000 x g adequada para tubos de 1,5 mL. Ao usar células aderentes, use um raspador de células.

1. Para as células aderentes, aspirar o meio e adicionar 10 mL de PBS por placa de 15 cm.
   NOTA: Raspar células no PBS permite lavá-las ao mesmo tempo. Se as células já estiverem na suspensão, avance directamente para o passo 3.3.
2. Separar as células usando um raspador de células e agrupá-las em um único tubo cônico de 50 mL. Homogeneizar a suspensão celular pipetando para cima e para baixo.
   NOTA: As células podem ser destacadas usando um raspador de células, uma vez que isso é mais rápido e elas serão lisadas logo em seguida.
3. Para cada condição experimental, transferir 5% do volume de suspensão celular para um tubo de 1,5 mL e centrifugar a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente.
   NOTA: Ao usar células de suspensão, certifique-se de lavar as células uma vez com PBS antes, para remover possíveis contaminantes da mídia, como FBS.
4. Descarte o sobrenadante e mantenha o pellet no gelo.
   NOTA: Isso representará a fração "célula total" para proteômica.
5. Centrifugar o resto das amostras dos passos 3.1 ou 3.2 a 300 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.
6. Execute todas as etapas a seguir no gelo e usando buffers gelados.
7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 5 mL de tampão mitocondrial gelado (MB) (manitol 210 mM, sacarose 70 mM, HEPES/NaOH 10 mM [pH 7,4] e EDTA 1 mM).
8. Recuperar as células por centrifugação a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
9. Ressuspender o pellet de células em 0,5 mL de MB frio e transferi-lo para um tubo de 1,5 mL.
   NOTA: Este procedimento produz uma concentração celular aproximada de 1,5 x 10 8 células BMDM/mL ou 3 x 10⁸ células RAW264,7/mL.
10. Com seringa de 1 mL acoplada a uma agulha de 25 G, homogeneizar a suspensão celular em 30 passagens pela agulha (Figura 1A).
11. Adicione 1 mL de MB frio ao tubo e misture por inversão. Centrifugar a suspensão de células homogeneizadas a 2.000 x g por 5 min a 4 °C.
12. Transfira 1 mL do sobrenadante para um tubo fresco de 1,5 mL sobre gelo sem perturbar o pellet celular. Ressuspender o pellet celular e homogeneizá-lo novamente, como no passo 3.7.
13. Agrupar o pellet de células homogeneizadas e o sobrenadante das duas etapas anteriores em um único tubo de 1,5 mL e centrifugar a 2.000 x g por 5 min a 4 °C.
    NOTA: Neste ponto, o pellet contém principalmente núcleos e células intactas e é descartado. O sobrenadante contém restos celulares, citosol e organelas, incluindo mitocôndrias (Figura 1B).
14. Divida o sobrenadante entre quatro tubos de 1,5 mL.
    NOTA: Dividir o sobrenadante entre vários tubos nesta fase melhora a remoção de contaminantes nas etapas seguintes.
15. Adicione MB para fazer um volume final de 1 mL em cada um dos quatro tubos. Misturar por inversão e centrifugar os tubos a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    NOTA: Após esta etapa, uma pastilha com duas camadas é visível. O pellet inferior, firme e marrom contém mitocôndrias e é mantido para posterior purificação (Figura 1C). A pastilha superior, solta e branca contém outras estruturas celulares e pode ser descartada.
16. Execute esta etapa cuidadosamente. Retire o sobrenadante com o máximo possível do pellet superior branco. Ao pipetar suavemente sobre ele, é possível ressuspender o pellet branco e depois descartá-lo, deixando o pellet mitocondrial marrom intacto.
17. Mantenha um dos quatro tubos com a pastilha mitocondrial sobre gelo. Isso representa a fração "mitocôndria bruta" para a proteômica.
18. Junte os outros três pellets em um tubo de 1,5 mL em um volume final de 1 mL de MB.

4. Purificação de mitocôndrias baseada em anticorpos superparamagnéticos

NOTA: Execute todas as etapas a seguir em uma câmara fria a 4 °C.

1. Transferir 1 mL da preparação mitocondrial bruta da etapa 3.18 para um tubo cônico de 15 mL e adicionar 7 mL de MB suplementado com NaCl 150 mM (MB + NaCl).
   NOTA: A adição de NaCl melhora a ligação de anticorpos e diminui a ligação inespecífica dos contaminantes às esferas e às mitocôndrias.
2. Adicionar 50 μL de contas de Tomm22 à suspensão bruta de mitocôndrias de 8 mL (Figura 1D) e incubar o tubo por 15 min a 4 °C em uma roda giratória a baixa velocidade.
   NOTA: As esferas Tomm22 estão ligadas covalentemente aos anticorpos monoclonais Tomm22 criados em camundongos, acoplados a esferas superparamagnéticas.
3. Enquanto isso, coloque uma coluna no ímã.
4. Equilibrar a coluna com 8 mL de MB + NaCl e descartar o fluxo.
5. Após a incubação de 15 min a 4 °C da amostra com as esferas Tomm22, transfira a amostra para a coluna. Descarte o fluxo.
   OBS: As mitocôndrias permanecerão aderidas às esferas magnéticas da coluna (Figura 1E).
6. Lavar a coluna três vezes com 8 mL de MB + NaCl.
7. Retire a coluna do ímã e coloque-a em um tubo cônico de 15 mL.
8. Eluir as mitocôndrias adicionando 1,5 mL de MB + NaCl à coluna e aplicar um êmbolo imediatamente para eluir as mitocôndrias purificadas no tubo.
9. Transferir a mitocôndria eluída para um tubo de 1,5 mL e centrifugar a 21.000 x g por 10 min a 4 °C.
   NOTA: Uma pelota marrom se formará. Este contém as mitocôndrias isoladas e algumas das esferas acopladas a anticorpos (Figura 1F).
10. Retire o sobrenadante cuidadosamente do pellet. O pellet representa a fração "mitocôndria pura" para proteômica. Este pellet, juntamente com os pellets das etapas 3.4 e 3.17, pode ser armazenado a -20 °C e está pronto para aplicações a jusante.

Resultados

Três amostras com graus crescentes de pureza mitocondrial são geradas no presente protocolo: células totais, mitocôndrias brutas ("mito-crude") e mitocôndrias puras ("mito-pure") (Figura 1). Validamos a purificação das mitocôndrias da linhagem celular de macrófagos RAW264.7 carregando quantidades iguais de proteína de cada fração em um gel e immunoblotting, e descobrimos que a citrato sintase mitocondrial (Cs) foi enriquecida a cada etapa de purificação; enquanto isso, as proteínas do citosol (GAPDH), da membrana plasmática (Na/K ATPase), do núcleo (Lamin B), dos lisossomos (Lamp1) e do retículo endoplasmático (ER) (Pdi) desapareceram progressivamente (Figura 2A). Resultados semelhantes foram obtidos com o uso de BMDMs. Para posterior validação da pureza e integridade das mitocôndrias isoladas, foi realizada microscopia eletrônica sobre a fração mitocondrial pura. Observamos mitocôndrias com forma oval clássica e cristas íntegras circundadas por partículas elétron-densas correspondentes às esferas revestidas de anticorpos (Figura 2B). Portanto, pode-se concluir que nosso protocolo enriquece mitocôndrias, esgota outros componentes celulares e mantém a integridade estrutural mitocondrial.

Em seguida, foi realizada a análise do proteoma de cada fração por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC/MS). Foram identificadas 6.248 proteínas do extrato de células totais, das quais 907 foram previamente anotadas como mitocondriais no inventário MitoCarta3.0⁵. Depois de filtrar proteínas com um limiar de pelo menos dois peptídeos únicos, calculamos um escore de enriquecimento para cada proteína em cada amostra com base em sua intensidade em comparação com o total de células. Em seguida, alocamos as proteínas em sete grandes compartimentos subcelulares: mitocôndrias, RE, lisossomos, aparelho de Golgi, citoesqueleto, núcleo e citosol, utilizando como referências a Ontologia Gênica (GO)^16,17 e a MitoCarta3,0 ⁵. É importante ressaltar que foi observado um enriquecimento médio para proteínas mitocondriais de mais de 10 vezes e mais de 20 vezes nas frações bruta e pura das mitocôndrias, respectivamente (Figura 2C). Em contraste, componentes dos outros seis compartimentos celulares analisados foram esgotados durante o procedimento de purificação. Destaca-se que, na fração bruta da mitocôndria, observou-se um enriquecimento transitório para RE e proteínas lisossômicas, duas classes de proteínas contaminantes frequentemente presentes seguindo protocolos de centrifugação^{diferencial18}. Isso possivelmente se deveu às interações organela-organela e coeficientes de sedimentação semelhantes, especialmente para os lisossomos, que são altamente abundantes em macrófagos¹⁹. Embora ambos tenham sido principalmente esgotados após a captura imune, detectamos um pequeno sinal para proteínas dos sítios de contato ER-mitocôndrias na fração mito-pura.

Em seguida, comparamos diretamente a abundância de proteínas das células totais e das amostras mitopuras e observamos duas populações distintas, correspondentes a proteínas mitocondriais e não mitocondriais (Figura 2D). Enquanto a grande maioria das proteínas MitoCarta se agrupou, encontramos algumas (<5%) que se agruparam com proteínas não-MitoCarta. Essas proteínas podem representar (1) proteínas citosólicas que interagem com mitocôndrias (uma nova categoria anotada na versão 3.0 do MitoCarta), (2) proteínas de localização dupla ou (3) proteínas mal anotadas. Por outro lado, encontramos alguns casos de agrupamento de proteínas não-mitocondriais. Embora tais proteínas possam representar contaminantes do procedimento de isolamento, elas também podem representar proteínas não previamente classificadas como presentes nas mitocôndrias.

Para investigar essa nova classe de potenciais proteínas mitocondriais, a proteômica subtrativa, foi utilizada uma abordagem que tem se mostrado útil para a descoberta de proteomas organelares, incluindo as mitocôndrias6,12. A proteômica subtrativa pressupõe que as mitocôndrias devem ficar enriquecidas durante as etapas de purificação, e os contaminantes devem se esgotar⁶. Por exemplo, enquanto os contaminantes podem se acumular durante a centrifugação diferencial (por exemplo, devido a propriedades de sedimentação semelhantes) ou durante a captura imune (por exemplo, devido à ligação não específica de anticorpos), apenas proteínas mitocondriais de boa-fé devem se acumular significativamente em ambas. Assim, é possível filtrar proteínas que foram encontradas na fração mitocondrial pura, mas mostraram padrões inconsistentes de enriquecimento. No presente exemplo com células RAW264.7, estabelecendo um limiar para peptídeos únicos de ≥1 para as amostras mito-brutas e mito-puras, e usando limiares rigorosos de enriquecimento, fomos capazes de refinar a lista de proteomas mitocondriais recuperados de 1.127 proteínas inicialmente encontradas na fração mitocondrial bruta após centrifugação diferencial, até 481 proteínas após a segunda rodada de purificação usando imunosseleção de Tomm22. O número reduzido de proteínas anotadas MitoCarta na fração mito-pura reflete o alto rigor aplicado para seleção. Curiosamente, 70 das proteínas presentes na fração mito-pura não estavam presentes no inventário MitoCarta3.0 (Figura 3A, B). Estas últimas proteínas podem representar potenciais novas proteínas candidatas mitocondriais, que só podem ser expressas na linhagem celular de macrófagos RAW264.7 e em células relacionadas, e que merecem investigação adicional.

Figura 1: Ilustração do protocolo de isolamento de mitocôndrias em duas etapas, sem tags . (A) Uma suspensão celular é interrompida através de uma agulha de 25 G. (B) Núcleos e células inteiras são separados por centrifugação a 2.000 x g e o sobrenadante é salvo. (C) As mitocôndrias brutas são isoladas por centrifugação diferencial do sobrenadante a 13.000 x g (mito-bruto). (D) As mitocôndrias brutas são então incubadas com anticorpos Tomm22 (Ab) ligados covalentemente a esferas superparamagnéticas. (E) Os complexos mitocôndrias-Tomm22 são separados dos contaminantes usando colunas magnéticas e eluídos. (F) As mitocôndrias puras são coletadas e concentradas por centrifugação (mito-puras). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gráfico 2. Resultados representativos do isolamento de mitocôndrias de duas fontes de macrófagos. (A) Análise de immunoblot proteico de células RAW264.7 (acima) e BMDM (abaixo) utilizando anticorpos contra citrato sintase mitocondrial (Cs - mitocôndria), gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (Gapdh - citosol), bomba de sódio-potássio (Na/K ATPase - membrana plasmática), Lamin B (Lamin B - núcleo), proteína de membrana associada ao lisossomo 1 (Lamp1 - lisossomo) e proteína dissulfeto-isomerase (Pdi - ER). (B) Microscopia eletrônica de mitocôndrias purificadas de células RAW264.7. As partículas de alta densidade ao redor das mitocôndrias correspondem às esferas de Tomm22 que são carregadas com amostras mito-puras após a eluição das colunas. Barras de escala: 80 nm. (C) Escores de enriquecimento entre células totais, mito-brutas e mito-puras de sete compartimentos celulares em células RAW264.7. MitoCarta3.0 e GO foram utilizados para anotação proteica e os escores médios estão representados. Abreviação: RE = retículo endoplasmático. (D) Valores de abundância de proteínas (riBAQ) para proteínas em células totais e amostras mitopuras de células RAW264.7. As proteínas MitoCarta3.0 são mostradas em laranja. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gráfico 3. Descoberta de novas proteínas mitocondriais utilizando proteômica subtrativa. (A) Estratégia proteômica subtrativa para a descoberta de novas proteínas mitocondriais. Altos limiares de seleção (4x e 2x) são aplicados para minimizar a seleção de falsos positivos. (B) Rendimentos de enriquecimento (dobra do total de células) de novas proteínas candidatas mitocondriais não anotadas anteriormente no inventário MitoCarta3.0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Combinamos centrifugação diferencial e imunocaptura para alcançar uma pureza melhorada para o isolamento mitocondrial. Nosso procedimento permite o acesso a material primário para a identificação e caracterização de novas proteínas mitocondriais. O protocolo é simples e robusto, podendo ser aplicado em linhagens celulares, células primárias e tecidos sem a necessidade de modificação genética. Validamos nosso protocolo por meio de análises de immunoblotting e proteômica em amostras coletadas em diferentes etapas ao longo do procedimento de purificação.

Em comparação com métodos de isolamento único, a combinação de etapas de enriquecimento de diferentes naturezas - aqui, centrifugação e marcação imunológica - gera um protocolo mais robusto para isolar mitocôndrias. Isso porque, embora as proteínas mitocondriais se tornem enriquecidas em ambas as purificações, é improvável que os contaminantes também sejam enriquecidos após ambas as etapas de enriquecimento. Embora a alta pureza mitocondrial também possa ser alcançada por ultracentrifugação por gradiente de densidade, essa abordagem requer uma grande quantidade de material de partida e acesso a uma ultracentrífuga. Por fim, ao contrário de métodos recentes baseados no isolamento mitocondrial baseado em tags²⁰, nossa abordagem não requer modificação genética da amostra, tornando-a adequada para material primário de qualquer fonte.

Algumas considerações técnicas e biológicas precisam ser levadas em consideração no planejamento experimental ao aplicar nosso protocolo. (1) A quantidade de matérias-primas é crítica para obter material suficiente. Inevitavelmente, um pequeno número de mitocôndrias será perdido durante a homogeneização (passo 3.10), uma vez que nem todas as células estão lisadas, ou durante as três lavagens de coluna (passo 4.6). Embora nosso protocolo se concentre na pureza sobre o rendimento, a eficiência do isolamento das mitocôndrias e, portanto, seu rendimento, não foi medida ou otimizada. Espera-se que o uso de mais contas Tomm22 e mais colunas aumente o rendimento da recuperação mitocondrial. Ao mesmo tempo, uma otimização completa da etapa de homogeneização também pode levar à melhoria do rendimento mitocondrial. Este protocolo e os números iniciais de células que relatamos aqui para células RAW264.7 e BMDMs são adequados para proteômica e podem ser ajustados para outras aplicações. No caso de BMDMs primárias, descobrimos que um único camundongo era suficiente para uma réplica. Quando necessário, o procedimento pode ser ampliado para isolar BMDMs de vários animais, que podem então ser agrupados para obter material suficiente. O número de células pode ser otimizado dependendo do tipo celular, seu tamanho e seu conteúdo mitocondrial. (2) Tomm22 é expresso em mitocôndrias de todos os tipos celulares e tecidos²¹, mas seu nível de expressão pode variar. Portanto, ao projetar um experimento para comparar diferentes condições, é importante garantir que os níveis de expressão de Tomm22 sejam comparáveis. Além disso, devido à expressão ubíqua de Tomm22, não é possível estudar proteínas mitocondriais específicas do tipo celular dentro de tecidos complexos. (3) O tempo necessário para gerar mitocôndrias puras (em torno de 2,5 h) é incompatível com o estudo de eventos transitórios, como alterações no perfil metabólico. Nesse caso, recomendamos a captura imunológica direta baseada em tags⁹, o que também permite estudar mitocôndrias específicas do tipo celular in vivo²⁰. (4) Embora estudos com mitocôndrias isoladas obtidas apenas com esferas marcadas com anticorpos Tomm22 tenham mostrado atividade em ensaios funcionais¹¹, resta determinar se as mitocôndrias geradas com nosso protocolo são compatíveis com ensaios baseados em atividade a jusante. MitoTracker ou coloração de perclorato de éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM), ou medidas de respirometria, são abordagens potenciais para quantificar a funcionalidade de mitocôndrias isoladas²². (5) Após a eluição da amostra "mito-pura" da coluna, algumas esferas de Tomm22 estarão presentes na fração mitocondrial pura (Figura 2B). Embora não tenhamos observado interferência na digestão de tripsina e espectrometria de massa de proteínas, a presença dessas esferas e das imunoglobulinas deve ser levada em consideração em outras aplicações a jusante. O anticorpo Tomm22 é um anticorpo monoclonal produzido em camundongos²³e, portanto, é importante ter em mente que, ao usar anticorpos secundários contra camundongos em immunoblotting, ele gerará bandas inespecíficas no tamanho das cadeias de imunoglobulinas. (6) A homogeneização completa da suspensão celular é fundamental para o sucesso do isolamento das mitocôndrias. Aqui, usamos uma seringa com uma agulha de 25 G para lisar as células RAW264.7 e BMDMs. No entanto, dependendo do tipo celular e seu tamanho, outros métodos de homogeneização mecânica, como o uso de um homogeneizador Dounce, ou abordagens mais controladas, como dispositivos homogeneizadores de células, podem ser mais adequados. Métodos de homogeneização não mecânicos, como a sonicação suave, também podem ser considerados. Abordagens de homogeneização tecidual são discutidas em outros estudos^24,25. (7) Embora a validação por immunoblotting seja o método mais simples e barato, seus resultados nem sempre podem se correlacionar com alterações em todo o nível da organela. É por isso que recomendamos o uso da proteômica para validar completamente o enriquecimento ou depleção de mitocôndrias e outras organelas, respectivamente.

O protocolo de purificação mitocondrial em duas etapas aqui descrito nos permitiu gerar amostras sequenciais com pureza mitocondrial crescente, e isso nos permitiu descobrir novos candidatos a proteínas mitocondriais através da proteômica subtrativa¹². Para nossa análise, usamos limiares rigorosos para selecionar proteínas mitocondriais significativamente enriquecidas e, embora isso possa falhar em identificar algumas proteínas mitocondriais conhecidas (Figura 3A), a taxa de falso-positivos para a descoberta de novas proteínas mitocondriais está diminuída. No entanto, é importante ressaltar que quaisquer proteínas candidatas reveladas por nosso protocolo devem ser validadas através de abordagens ortogonais. Recomendamos a marcação de GFP carboxi-terminal ou o uso de anticorpos contra a proteína endógena para validar a associação com mitocôndrias microscopicamente ou por ensaios de proteção proteásica.

A aplicação direta do nosso método no caso de células e tecidos não modificados oferece uma ferramenta poderosa para investigar como as mitocôndrias mudam e se adaptam ao seu ambiente em condições saudáveis e de doença. A aplicação de nosso protocolo a linhagens celulares, modelos de doenças animais, fluidos humanos e até mesmo biópsias de cirurgia pode ser particularmente útil para melhorar nossa compreensão das mitocôndrias e seus distúrbios associados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 1 mL	BD Plastipal	309628
25 G Agulha	BD Microlance	300400
40 µ filtro de células m	Corning	352340
Microesferas Anti-TOM22, camundongo	Miltenyi Biotec	130-127-693
Raspador de células	FisherScientific	11577692
DMEM, glicose alta, GlutaMAX	ThermoFisher	31966
Ácido etilenodiaminotetracético	FisherScientific	BP-120-1
Soro bovino fetal	Gibco	10270
HEPES	BioConcept	5-31F00-H
LS colunas e êmbolos	Miltenyi Biotec	130-042-401
Fator estimulador de colônias de macrófagos	Immunotools	12343115
Manitol	Sigma	M4125
Cloreto de sódio	Sigma	71380
Sacarose	Sigma	S1888
Penicilina/estreptomicina	BioConcept	4-01F00-H
Placas de Petri	Corning	BH93B-102
Solução salina tamponada com fosfato 10X	Eurobio Scientific	CS3PBS01-01
Separador QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
Analisador de Viabilidade de Células Vi-CELL BLU	Beckman Coulter	C19196