A estria vascular é vital para a geração do potencial endococlear. Apresentamos aqui a dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação.
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Artigo de método
Dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação
Neste artigo
Resumo
Resumo
O potencial endococlear, gerado pela estria vascular, é essencial para manter um ambiente propício à adequada mecanotransdução das células ciliadas e, finalmente, à audição. Patologias da estria vascular podem resultar em diminuição da audição. A dissecção da estria vascular do adulto permite a captura focalizada de núcleo único e subsequente sequenciamento e imunomarcação de núcleo único. Essas técnicas são usadas para estudar a fisiopatologia da estria vascular em nível unicelular.
O sequenciamento de núcleo único pode ser usado na análise transcricional da estria vascular. Enquanto isso, a imunomarcação continua a ser útil na identificação de populações específicas de células. Ambos os métodos requerem dissecção adequada da estria vascular como pré-requisito, o que pode revelar-se tecnicamente desafiador.
Introdução
A cóclea consiste de três câmaras cheias de líquido, a escala vestibular, a escala média e a escala timpânica. A escala vestibular e a escala timpânica contêm perilinfa, que apresenta alta concentração de sódio (138 mM) e baixa concentração de potássio (6,8 mM)1. A escala média contém endolinfa, que apresenta alta concentração de potássio (154 mM) e baixa concentração de sódio (0,91 mM)1,2,3. Essa diferença na concentração de íons pode ser chamada de potencial endococlear (PE), e é gerada primariamente pelo movimento de íons potássio através de vários ....
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Protocolo
Todos os experimentos e procedimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e do National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e pelo National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes do Comitê de Cuidados e Uso de A....
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Resultados
Apresentamos um método para isolar o VS a ser usado para sNuc-Seq ou imunomarcação. A anatomia relevante (Figura 1) da cóclea em relação à VS pode ajudar o usuário a entender melhor a organização da VS e as etapas do protocolo de dissecção.
Cada passo dessa microdissecção de VS de um mouse P30 é detalhado no vídeo associado, e instantâneos dos principais passos dessa dissecção e isolamento de VS são apresentados na Figura 2.
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Discussão
Antes do advento do sequenciamento de célula única, muitos pesquisadores usaram a análise de tecido em massa, que só tornou possível analisar transcriptomas médios entre células. Em particular, unicelular e sNuc-Seq permitiram isolar o transcriptoma de uma única célula ou núcleo único, respectivamente32. Nesse caso, transcriptomas de núcleo único podem ser identificados para células marginais, intermediárias e basais, bem como células fusiformes30. Isso permite a investigaç.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, NIDCD para M.H. (DC000088)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10-µ m filtro (Polietilenoreftalato) | PluriSelect | #43-50010-01 | Tecido filtrante durante a cobertura de vidro sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm | Fisher Scientific | 12-541A | Lamínula para montagem SV |
| 30-µ m filtro (Polietilenoreftalato) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filtre o tecido durante o sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide para montar SV em |
| camundongos C57BL/6J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | Cepa de camundongo de uso geral que tem pigmento mais facilmente visto nas células intermediárias do SV. |
| Contador de Células | Logos Biosystems | L20001 | Usado para contagem de células |
| Chalizon curete 5'', tamanho 3 2.5 mm | Instrumentos de Pesquisa Biomédica | 15-1020 | Usado para transferir SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Gera bibliotecas de expressão gênica de célula única 3' |
| Esmalte transparente | Fisher Scientific | NC1849418 | Usado para selar |
| placas de cultura de tecidos padrão Corning Falcon | Corning | 08-772B | usada para segurar a amostra durante a dissecação |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Mancha usada para rotulagem de núcleo |
| Homogeneizador Dounce | Sigma-Aldrich | D8938 | Usado para homogeneizar tecido para pinça |
| sNuc-seq Dumont #5Ferramentas de Ciências Finas | 11252-30 | Fórceps gerais para dissecação | |
| Dumont # 55 Fórceps | Ferramentas de Ciências Finas | 11255-20 | Fórceps com ponta fina que facilita a manipulação do SV |
| Soro Bovino Fetal | ThermoFisher | 16000044 | Usado para etapas de cola sNuc-Seq |
| Stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Usado para montagem SV |
| GS-IB4 Anticorpo | Molecular Sondas | I21411, RRID: AB-2314662 | Anticorpo usado para marcação capilar |
| KCNJ10-ZsGreen Camundongos | n/a | n/a | Camundongo transgênico que expressa KCNJ10-ZsGreen, particularmente nas células intermediárias do SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Usado para etapas de reagente de montagem sNuc-Seq |
| ThermoFisher | #S36940 | Reagente de montagem para | |
| placa de 24 poços SV Multiwell | Placa Corning | #353047 | usada para imunocoloração |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Usado para etapas de sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Usado para etapas de sNuc-Seq |
| Água livre de nuclease | ThermoFisher | 4387936 | Usado para etapas de sNuc-Seq |
| Agitador orbital | Silent Shake | SYC-2102A | Usado para etapas de imunocoloração |
| PBS | ThermoFisher | J61196. AP | Usado para etapas de imunocoloração e dissecação |
| RNA Posteriormente | Invitrogen | AM7021 | Usado para preservação de SV para sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Usado para dividir o crânio de camundongo |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Usado para etapas de sNuc-Seq |
| Coloração azul de tripano | Gibco | 15250061 | Usado para contagem de células |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Usado para etapas de sNuc-Seq |
| Estereomicroscópio Zeiss STEMI SV 11 Apo | Zeiss | n/a | Microscópio usado para dissecções |
Referências
- Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences.
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Reimpressões e permissões
