Method Article

Métodos Baseados em Imagem para Estudo de Eventos de Tráfego de Membranas em Células de Linhagem Estomática

DOI:

10.3791/65257

⸱

May 12th, 2023

 ,  , 
1Department of Biology, Rutgers University, 2Pharmacology and Toxicology Department, University of Arkansas for Medical Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vários métodos comumente usados são introduzidos aqui para estudar os eventos de tráfego de membrana de uma quinase do receptor de membrana plasmática. Este manuscrito descreve protocolos detalhados, incluindo a preparação do material vegetal, tratamento farmacológico e configuração de imagens confocais.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Em células eucarióticas, os componentes da membrana, incluindo proteínas e lipídios, são transportados espaço-temporalmente para seu destino dentro do sistema endomembrana. Isso inclui o transporte secretor de proteínas recém-sintetizadas para a superfície celular ou para o exterior da célula, o transporte endocítico de cargas extracelulares ou componentes da membrana plasmática para dentro da célula, e a reciclagem ou transporte de cargas entre as organelas subcelulares, etc. Os eventos de tráfico de membranas são cruciais para o desenvolvimento, crescimento e adaptação ambiental de todas as células eucarióticas e, portanto, estão sob regulamentação rigorosa. As quinases dos receptores de superfície celular, que percebem os sinais dos ligantes do espaço extracelular, sofrem transporte secretor e endocítico. Abordagens comumente usadas para estudar os eventos de tráfego de membrana usando uma quinase do receptor de leucina rica em repetição localizada na membrana plasmática, ERL1, são descritas aqui. As abordagens incluem preparação de material vegetal, tratamento farmacológico e configuração de imagens confocais. Para monitorar a regulação espaço-temporal do ERL1, este estudo descreve a análise de co-localização entre ERL1 e uma proteína marcador de corpo multivesicular, RFP-Ara7, a análise de séries temporais dessas duas proteínas e a análise z-stack de ERL1-YFP tratadas com os inibidores de tráfego de membrana brefeldina A e wortmannina.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O tráfego de membranas é um processo celular conservado que distribui componentes da membrana (também conhecidos como cargas), incluindo proteínas, lipídios e outros produtos biológicos, entre diferentes organelas dentro de uma célula eucariótica ou através da membrana plasmática de e para o espaço extracelular1. Esse processo é facilitado por uma coleção de membranas e organelas denominada sistema endomembrana, que consiste na membrana nuclear, no retículo endoplasmático, no aparelho de Golgi, no vacúolo/lisossomos, na membrana plasmática e em múltiplos endossomos1. O sistema de endomembrana permite a modificação, empacotamento e transporte de componentes da membrana usando vesículas dinâmicas que transitam entre essas organelas. Os eventos de tráfico de membranas são cruciais para o desenvolvimento, crescimento e adaptação ambiental das células e, portanto, estão sob regulação rigorosa e complexa2. Atualmente, múltiplas abordagens em biologia molecular, biologia química, microscopia e espectrometria de massas têm sido desenvolvidas e aplicadas ao campo do tráfego de membranas e têm avançado muito o entendimento da regulação espaço-temporal do sistema endomembrana3,4. A biologia molecular é usada para manipulações genéticas clássicas dos possíveis atores envolvidos no tráfico de membranas, como alterar a expressão gênica da proteína de interesse ou rotular a proteína de interesse com certas etiquetas. Ferramentas em biologia química incluem o uso de moléculas que interferem especificamente no tráfego de determinadas rotas 4,5. A espectrometria de massas é poderosa para identificar os componentes de uma organela que foi isolada mecanicamente por abordagens bioquímicas 3,4. No entanto, o tráfego de membranas é um processo biológico dinâmico, diversificado e complexo1. Para visualizar o processo de tráfego de membranas em células vivas sob várias condições, a microscopia de luz é uma ferramenta essencial. Progressos contínuos têm sido feitos em técnicas avançadas de microscópio para superar os desafios na medição da eficiência, cinética e diversidade dos eventos4. Aqui, este estudo se concentra nas metodologias amplamente adotadas em biologia química/farmacológica, biologia molecular e microscopia para estudar eventos de tráfego de membranas em um sistema naturalmente simplificado e experimentalmente acessível, o processo de desenvolvimento estomático.

Estomatas são microporos na superfície aérea das plantas que se abrem e fecham para facilitar as trocas gasosas entre as células internas e o ambiente 6,7,8. Assim, os estômatos são essenciais para a fotossíntese e transpiração, dois eventos cruciais para a sobrevivência e crescimento das plantas. O desenvolvimento estomático é ajustado dinamicamente por pistas ambientais para otimizar a adaptação da planta ao entorno9. Remontando a estudos realizados em 2002, a identificação da proteína receptora Too Many Mouths (TMM) abriu as portas para uma nova era de investigação dos mecanismos moleculares do desenvolvimento estomático na planta-modelo Arabidopsis thaliana10. Após apenas algumas décadas, uma via de sinalização clássica foi identificada. De montante para jusante, essa via inclui um grupo de ligantes peptídicos secretores na família dos fatores de padronização epidérmica (EFP), várias quinases de receptores de repetição rica em leucina (LRR) de superfície celular da família EREECTA (ER), a proteína TMM do receptor LRR, uma cascata MAPK e vários fatores de transcrição bHLH, incluindo SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA, e SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Trabalhos anteriores indicam que uma das quinases receptoras, ER-LIKE 1 (ERL1), demonstra comportamentos subcelulares ativos sobre a percepção do PFE20. O ERL2 também trafega dinamicamente entre a membrana plasmática e algumas organelas intracelulares27. O bloqueio das etapas de tráfego da membrana causa padrões estomáticos anormais, resultando em aglomerados estomáticos na superfície foliar28. Estes resultados sugerem que o tráfego de membranas desempenha um papel essencial no desenvolvimento estomático. Este estudo descreve um protocolo para investigar espaço-temporalmente a dinâmica do ERL1 usando análise de co-localização subcelular proteína-proteína combinada com tratamento farmacológico usando alguns inibidores do tráfego de membrana.

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Protocol

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1. Preparação das soluções

  1. Preparar a solução de esterilização de sementes misturando 15 mL de água sanitária com 35 mL de água destilada e 50 μL de Triton X-100.
  2. Preparar a solução de brefeldina A (BFA) dissolvendo o pó de BFA em etanol até uma concentração final de 10 mM (stock). Preparar a solução de wortmannin (Wm) dissolvendo o pó de Wm em DMSO até uma concentração final de 10 mM (stock).

2. Semeando as sementes

  1. Alíquota 10-50 sementes de cada uma das plantas transgênicas necessárias em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione 1 mL de solução de esterilização de sementes em cada tubo e misture bem invertendo o tubo suavemente por 10 min em um agitador.
  2. Eliminar a solução de esterilização das sementes e lavá-las cinco vezes com 1 mL de água destilada autoclavada.
  3. Adicionar 300 μL de água destilada autoclavada em cada tubo e semear as sementes em meio MS de meia força contendo 1% (p/v) de sacarose e 0,75% (p/v) de ágar. Suplemente o meio com os antibióticos correspondentes, conforme necessário.
  4. Manter a placa de cabeça para baixo a 4 °C no escuro por 2 dias para sincronizar a germinação.
  5. Após 2 dias, transferir a placa para uma sala de crescimento com um ciclo claro/8 h escuro de 16 h (80 μmol/m2/s1) a 22 °C. Este é considerado o primeiro dia pós-germinação (1 dpg).
  6. Transplantar as mudas para o solo a 10 dpg para posterior crescimento.

3. Preparação de plantas transgênicas F1 bicolores

  1. Cultivar plantas transgênicas homozigotas com ERL1-YFP (planta A) e plantas transgênicas homozigotas com uma proteína marcada com RFP RFP-Ara7 (planta B)20 lado a lado até florescer em uma sala de crescimento com um ciclo de 16 h claro/8 h escuro (80 μmol/m2/s1) a 22 °C.
  2. Escolha uma inflorescência jovem da planta A. Mantenha uma flor que está prestes a se abrir na inflorescência para cruzamentos genéticos. Retire todas as flores e siliques mais velhas. Além disso, remova cuidadosamente as flores mais jovens e os meristemas florais para evitar confusão futura.
  3. Disseque suavemente a flor fechada removendo as sépalas, pétalas e estames usando um par de pinças afiadas. Deixe apenas o pistilo sobre a inflorescência.
  4. Pegue um estame maduro de uma flor aberta na planta B e deposite os grãos de pólen no estigma do pistilo dissecado na planta A.
  5. Rotule esta flor cruzada manualmente, indicando seu pai, mãe e a data do cruzamento genético. Deixe a flor amadurecer e colha as sementes F1 quando a silique ficar amarela/marrom (~20 dias após a cruz). Verifique se há uma planta de F1 bem-sucedida que tenha sinais YFP e RFP.

4. Tratamento farmacológico

  1. Para o tratamento com BFA, remova os cotilédones de plântulas com 7 dias de idade, mergulhe o restante das mudas em uma solução simulada (etanol 0,3%) ou solução de BFA 30 μM, aplique vácuo por 1 min e mantenha a amostra imersa por 30 min antes da obtenção de imagens.
  2. Para o tratamento com wortmannina, remova os cotilédones de plântulas com 7 dias de idade, mergulhe o restante das mudas em solução de DMSO 0,25% ou wortmannin 25 mM, aplique vácuo por 1 min e mantenha a amostra imersa por 30 min antes da obtenção de imagens.
  3. Para o tratamento a vácuo das amostras, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicionar 500 μL da solução do fármaco correspondente e imergir as plântulas dissecadas na solução. Fixar firmemente uma seringa de 10 mL no tubo da microcentrífuga e aplicar vácuo por 1 min (Figura 1). Retire a seringa e mantenha a amostra na solução durante o tempo necessário. Retire delicadamente as mudas para o preparo das imagens.

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Figura 1: Dispositivo de vácuo simples. Uma seringa de 10 mL é conectada a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para o tratamento a vácuo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Preparação da amostra para aquisição de imagens

  1. Dissecar a folha verdadeira da amostra tratada usando uma lâmina de barbear afiada. Coloque suavemente a folha verdadeira em uma gota de água em uma lâmina de vidro e mantenha o lado abaxial para cima. Cubra lentamente a folha verdadeira com uma lamínula, evitando prender bolhas.

6. Imagem confocal

NOTA: Um microscópio confocal de varredura invertido Leica SP8 foi usado para obter imagens do sinal de fluorescência das amostras neste trabalho.

  1. Configuração do caminho do feixe
    1. Selecione um laser de 514 nm para excitação YFP. Utilize um alto poder de laser para aumentar a intensidade do sinal e, assim, obter alta qualidade de imagem. No entanto, potências do laser acima de 5% correm o risco de fotoclareamento, e a saúde da amostra pode ser afetada. Se o sinal da amostra não for muito fraco, comece com baixa intensidade de laser.
    2. Ative o PMT/HyD para detecção e defina os limites superior e inferior da banda de emissão com base no espectro do fluoróforo YFP. Defina uma janela de detecção de 530-570 nm para coletar o sinal YFP.
    3. Imagem sequencial para a segunda cor: Clique no botão Seq e adicione um novo canal. Por padrão, o caminho do feixe YFP projetado anteriormente será Seq 1. Em Seq 2, selecione um laser de 561 nm para a excitação de RFP e defina uma janela de detecção de 570-630 nm para coletar o sinal de RFP.
  2. Configuração das condições de varredura (Figura 2)
    1. Para obter imagens da atividade de tráfego da membrana subcelular dentro das células precursoras estomáticas, escolha uma lente Corr de 63x/1,2 W no sistema de aquisição de imagens.
    2. O formato refere-se ao tamanho da imagem em pixels. Comece com 1.024 pixels x 1.024 pixels e, em seguida, otimize isso com base no fator de zoom e nas configurações de objetivo para uma boa resolução da qualidade da publicação.
    3. A velocidade refere-se à velocidade do canseiro à medida que o laser passa sobre cada pixel. Embora as velocidades de varredura lentas geralmente resultem em uma melhor relação sinal-ruído, elas podem não capturar com eficiência os eventos de tráfego de membrana que mudam rapidamente. Comece com uma velocidade de 400 Hz e otimize-a com base na situação específica das amostras.
    4. O fator de zoom é usado para ampliar uma região de interesse sem alterar a lente objetiva. Comece com um fator de zoom de 1 e otimize-o com base nas necessidades específicas do experimento.
    5. A média da linha refere-se ao número de vezes que cada linha X será digitalizada para obter um resultado médio. Uma média de linha maior reduz o ruído na imagem resultante, mas também aumenta o tempo de digitalização e o tempo de exposição à luz laser. Para criar imagens de eventos de tráfego de membrana, não use uma média de linha alta. Comece com uma média de 2x linhas e otimize conforme necessário.
  3. Coletando uma série temporal
    NOTA: Ao estudar eventos de tráfego de membrana, uma série temporal é frequentemente necessária para registrar o movimento rápido dos endossomos subcelulares.
    1. No Modo de Aquisição, selecione o modo de varredura xyt para habilitar o utilitário de série temporal.
    2. Decida um período de espera entre os pontos de tempo em Intervalo de tempo. Alternativamente , clique em Minimizar para tirar as imagens imediatamente uma após a outra. Um intervalo de tempo de 7 s foi usado no experimento de série temporal seguinte.
    3. Selecione Duração e insira o tempo total de execução do experimento. Como alternativa, defina o número de quadros a serem coletados selecionando Quadros (Figura 3).
  4. Para coletar as informações tridimensionais sobre o evento de tráfego de membrana dentro de toda a célula, use o modo de varredura Z-stack. A projeção de intensidade máxima das imagens Z-stack é frequentemente usada para a análise.
    1. Selecione o modo de verificação xyz no Modo de aquisição e, em seguida, o utilitário Z-Stack ficará acessível.
    2. Selecione a opção Z-wide. No Modo de varredura, defina a imagem superior e a imagem inferior da pilha Z usando os botões Início e Fim.
    3. Defina a espessura do z-step clicando no tamanho z-step. Alternativamente, defina quantas imagens tirar para cobrir toda a faixa da pilha Z. Para garantir a consistência entre as amostras, defina o tamanho do passo z (Figura 4).
  5. Processamento de imagens
    1. A projeção de intensidade máxima das imagens z-stack é gerada pelo software confocal (http://www.leica-microsystems.com). Na guia Processo principal, primeiro escolha o arquivo z-stack interessado na guia Abrir projetos no lado esquerdo. Em seguida, alterne para a guia do meio chamada Ferramentas de Processo, selecione a função Projeção , escolha Máximo no painel suspenso de Método e clique no botão Aplicar . Uma imagem de projeção z-stack será gerada na guia Abrir projetos.
    2. O vídeo das imagens da série temporal é gerado por Fiji (https://imagej.net/Fiji). Na guia Arquivo , use a função Abrir para abrir todas as imagens de séries temporais na ordem correta. Na guia Imagem , localize a função Pilha e escolha Imagens a serem empilhadas para gerar um vídeo. Salve o arquivo no formato .avi com a taxa de quadros desejada (5 quadros/s para o Vídeo 1).

figure-protocol-2
Figura 2: O painel do modo de varredura da dimensão XY. O painel do modo de digitalização é usado para configurar as condições de digitalização da imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-3
Figura 3: O utilitário de série temporal no modo de varredura xyt. O utilitário de série temporal é usado para configurar as condições de imagem para coletar consecutivamente uma série de imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-4
Figura 4: O utilitário z-stack no modo de varredura xyz. O utilitário z-stack é usado para configurar as condições de imagem para coletar uma série de imagens no eixo z. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Results

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Um estudo anterior indicou que ERL1 é um receptor quinase ativo que sofre eventos dinâmicos de tráfego de membrana20. ERL1 é uma quinase transmembrana do receptor LRR na membrana plasmática. O ERL1 recém-sintetizado no retículo endoplasmático é processado nos corpos de Golgi e posteriormente transportado para a membrana plasmática. As moléculas de ERL1 na membrana plasmática podem perceber ligantes de FPE usando seu domínio LRR extracelular18. Após a ativação pelos FPEs ini...

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Discussion

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O sistema de endomembrana separa o citoplasma de uma célula eucariótica em diferentes compartimentos, o que possibilita a função biológica especializada dessas organelas. Para entregar proteínas de carga e macromoléculas ao seu destino final no momento certo, inúmeras vesículas são guiadas para transportar entre essas organelas. Eventos de tráfico de membrana altamente regulados desempenham papéis fundamentais na viabilidade, desenvolvimento e crescimento das células. O mecanismo que regula esse processo crucial e compli...

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Disclosures

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) e pela University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) Bronson Foundation Award (H.Z.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Seringas de 10 mLVWR BD309695Amostras a vácuo
Brefeldin A (BFA)SigmaB7651droga de tráfico de membrana
Microscópio confocalLeicaLecia SP8 TCS com pacote de software LAS-X
Pinça de dissecação deVWR82027-402Cruz genética
FijiNIHhttps://imagej.net/FijiProcessamento de imagens
Leica LAS AF SoftwareLeicahttp://www.leica-microsystems.comProcessamento de
imagens de sementes transgênicas de ERL1-YFPQi, X. et al. As múltiplas ações dos peptídeos de sinalização na dinâmica subcelular de um receptor especificam o destino da célula estomática. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
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Wortmannin (Wm)SigmaW1628membrana tráfico de drogas
imagem

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