Sistema de Pseudoilhotas Humanas para Avaliação Síncrona da Dinâmica de Biossensores Fluorescentes e Perfis Secretores de Hormônios

Resumo

Este protocolo descreve um método para a aquisição sincrônica e o co-registro de eventos de sinalização intracelular e a secreção de insulina e glucagon por pseudoilhotas humanas primárias usando a entrega adenoviral de um biossensor cíclico de adenosina monofosfato (AMPc), um detector de diferença de AMPc in situ (cADDis) e um sistema de microperfusão.

Resumo

As ilhotas pancreáticas de Langerhans, que são pequenas coleções 3D de células endócrinas e de suporte especializadas intercaladas por todo o pâncreas, têm um papel central no controle da homeostase da glicose através da secreção de insulina pelas células beta, que reduz a glicemia, e glucagon pelas células alfa, que eleva a glicemia. As vias de sinalização intracelular, incluindo aquelas mediadas pelo AMPc, são fundamentais para a secreção regulada dos hormônios alfa e beta. A estrutura 3D das ilhotas, embora essencial para a função coordenada das ilhotas, apresenta desafios experimentais para estudos mecanísticos das vias de sinalização intracelular em células primárias das ilhotas humanas. Para superar esses desafios e limitações, este protocolo descreve uma plataforma microfluídica e de imagem integrada de células vivas usando pseudoilhotas humanas primárias geradas a partir de doadores sem diabetes que se assemelham a ilhotas nativas em sua morfologia, composição e função. Estas pseudoilhotas são controladas pelo tamanho através do processo de dispersão e reagregação das células primárias das ilhotas humanas. No estado disperso, a expressão gênica das ilhotas celulares pode ser manipulada; por exemplo, biossensores como o biossensor cAMP codificado geneticamente, cADDis, podem ser introduzidos. Uma vez formadas, as pseudoilhotas que expressam um biossensor codificado geneticamente, em combinação com microscopia confocal e uma plataforma de microperifusão, permitem a avaliação sincrônica da dinâmica do biossensor fluorescente e dos perfis secretores de hormônios alfa e beta para fornecer mais informações sobre os processos e a função celular.

Introdução

As ilhotas de Langerhans são miniórgãos espalhados pelo pâncreas cuja função é crucial para a manutenção da homeostase da glicose. A insulina é secretada pelas células beta após o metabolismo da glicose, o aumento da relação ATP/ADP, o fechamento dos canais de potássio sensíveis ao ATP, a despolarização da membrana plasmática e o influxo de cálcio extracelular¹. A secreção de glucagon pelas células alfa é menos compreendida, mas tem sido postulado que as vias intracelular e parácrina contribuem para a exocitose dos grânulos de glucagon ^2,3,4. Tanto o diabetes tipo 1 quanto o tipo 2 estão associados à disfunção das ilhotas ^5,6,7. Portanto, a elucidação das vias de sinalização intracelular que mediam a secreção do hormônio das ilhotas é essencial para a compreensão dos mecanismos fisiológicos e patológicos nas ilhotas pancreáticas.

A arquitetura esférica das ilhotas apresenta certos obstáculos à experimentação. Esses desafios incluem a variação do tamanho das ilhotas e a natureza 3D das ilhotas, o que reduz a transdução viral dentro do núcleo das ilhotas ^8,9. Para superar esses desafios, um sistema de pseudoilhotas foi desenvolvido, no qual ilhotas humanas primárias são dispersas em células únicas, transduzidas adenoviricamente com construtos que codificam alvos de interesse e reagregadas para formar estruturas semelhantes a ilhotas controladas por tamanho, denominadas pseudoilhotas⁷. Comparadas às ilhotas nativas do mesmo doador cultivadas em paralelo, essas pseudoilhotas são semelhantes em morfologia, composição celular endócrina e secreção hormonal⁷. Esse método permite a expressão de construtos ao longo da pseudoilhota, ou seja, supera uma barreira anterior à manipulação genética uniforme das ilhotas humanas primárias ^7,8,9.

Neste protocolo, o sistema das pseudoilhotas é integrado a um dispositivo microfluídico para expressar biossensores em células primárias das ilhotas humanas e ganhar resolução temporal da secreção do hormônio das ilhotas durante a perfusão dinâmica10,11,12. As pseudoilhotas são colocadas em um microchip e expostas a um fluxo constante de diferentes secretagogos através de uma bomba peristáltica¹². O microchip tem um fundo de vidro transparente e é montado em um microscópio confocal para registrar a dinâmica da sinalização intracelular através de mudanças na intensidade de fluorescência do biossensor. A imagem por biossensores é sincronizada com a coleta de efluente de microperifusão para posterior análise da secreção de insulina e glucagon7^. Comparada à macroperifusão, essa abordagem de microperifusão permite o uso de menos pseudoilhotas devido ao menor volume do dispositivo microfluídico em relação à câmara de macroperifusão⁷.

Para aproveitar a utilidade desse sistema, o biossensor in situ detector de diferença de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) foi expresso em pseudoilhotas humanas para avaliar a dinâmica do AMPc e a secreção hormonal. O biossensor cADDis é composto por uma proteína fluorescente verde circularmente permutada (cpGFP) posicionada na região da dobradiça de uma proteína de troca ativada pelo cAMP 2 (EPAC2), conectando suas regiões reguladora e catalítica. A ligação do AMPc à região regulatória da EPAC2 provoca uma mudança conformacional na região da dobradiça que aumenta a fluorescência da cpGFP¹³. Mensageiros intracelulares como o AMPc provocam a secreção de insulina e glucagon após a ativação a montante dos receptores acoplados à proteína G¹⁴. A imagem de células vivas acoplada à microperifusão ajuda a conectar a dinâmica do AMPc intracelular com a secreção do hormônio das ilhotas. Especificamente, neste protocolo, pseudoilhotas que expressam cADDis são geradas para monitorar as respostas do AMPc em células alfa e beta a vários estímulos: glicose baixa (glicose 2 mM; G 2), glicose elevada mais isobutilmetilxantina (IBMX; 20 mM glicose + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX) e glicose baixa mais epinefrina (Epi; 2 mM glicose + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Esse fluxo de tratamento permite a avaliação da dinâmica do AMPc intracelular diretamente via 1) inibição da fosfodiesterase mediada por IBMX, que aumenta os níveis de AMPc intracelular impedindo sua degradação, e 2) epinefrina, um conhecido estimulador dependente de AMPc da secreção de glucagon de células alfa mediada pela ativação do receptor β-adrenérgico. As etapas para a instalação do aparelho de microperifusão para experimentos de imagem de células vivas, o carregamento das pseudoilhotas no microchip, imagens síncronas de células vivas e microperifusão, e a análise dos traços do biossensor e secreção hormonal por ensaios hormonais baseados em microplacas são detalhadas abaixo.

Protocolo

As ilhotas humanas (N = 4 preparações) foram obtidas através de parcerias com o Programa Integrado de Distribuição de Ilhotas, Programa de Análise do Pâncreas Humano, Prodo Laboratories, Inc., e Imagine Pharma. O Comitê de Revisão Institucional da Universidade Vanderbilt não considera espécimes pancreáticos humanos desidentificados como pesquisa em seres humanos. Esse trabalho não seria possível sem doadores de órgãos, suas famílias e organizações de captação de órgãos. Consulte a Tabela 1 para obter informações demográficas dos doadores. Ilhotas humanas de doadores de pâncreas sem diabetes foram isoladas com menos de 15 h de tempo de isquemia fria.

1. Formação de pseudoilhotas (detalhado em Walker et al.^7º)

1. Obter e escolher manualmente ilhotas humanas primárias usando uma pipeta P200 e microscópio de bancada, prestando muita atenção para não contaminar a ponta da pipeta em nenhuma superfície fora do meio de cultura das ilhotas (10% FBS, 100 μg/mL estreptomicina, 100 U/mL penicilina, 2 mM L-glutamina em CMRL 1066).
2. Transfira ilhotas primárias para um tubo de 15 mL e execute todas as etapas seguintes de formação de pseudoilhotas sob um capuz de cultura de tecidos para evitar contaminação. Dissociar lentamente as ilhotas primárias por 7 min à temperatura ambiente com uma pipeta P1000 em tripsina a 0,025%. A solução se tornará opaca à medida que as ilhotas começarem a se separar.
   1. Para esses estudos, 200-300 ilhotas primárias escolhidas a dedo com diâmetros de aproximadamente 200 μm dispersas em 500 μL de tripsina a 0,025% produzem de uma a duas placas de 96 poços de pseudoilhotas; O número exato pode variar dependendo do tamanho médio da ilhota e da viabilidade. Para >500 ilhotas primárias, aumente o volume de 0,025% de tripsina usado em uma proporção de 1:1 (por exemplo, 600 μL de tripsina a 0,025% para 600 ilhotas escolhidas manualmente).
3. Atenuar a dispersão adicionando um volume de Vanderbilt Pseudoislet Media (VPM) equivalente ao volume de tripsina utilizado. Em seguida, lavar duas vezes com 1 mL de VPM. Para as lavagens, centrifugar as células dispersas a 485 x g por 2-3 min a 4 °C em uma centrífuga de bancada. Ressuspenda as células em um volume definido de VPM (normalmente 1 mL) para contagem.
   NOTA: A geração da pseudoilhota e a composição do VPM estão detalhadas em uma publicação anterior⁷. Resumidamente, o VPM contém volumes iguais de meio CMRL enriquecido (20% FBS, 100 μg/mL de estreptomicina, 100 U/mL de penicilina, 1 mM de piruvato de sódio, 2 mM de Glutamax, 2 mM de HEPES em CMRL 1066) e iEC-media (VEGF Medium Complete Kit menos FBS + 1 frasco de Suplemento Médio de Células Endoteliais). Um esquema resumido da geração de pseudoilhotas está incluído na Figura 1A.
4. Determinar a contagem e a viabilidade celular utilizando um contador de células automatizado combinando 10 μL de Azul de Tripano com 10 μL da suspensão celular. Misture bem a suspensão celular para garantir uma contagem de células precisa.
5. Calcule o volume de suspensão celular, vírus e VPM necessário para o número desejado de pseudoilhotas. Baseie todos os cálculos na contagem de células vivas obtida na etapa 1.4.
   1. Para esses estudos, transduzir células de ilhotas humanas dispersas em MOI 500 (N = 1) ou 1.000 (N = 2) com Ad-CMV-cADDis em um volume total de 500 μL. Uma placa de pseudoilhotas transduzidas (2.000 células/pseudoilhota) produz três réplicas técnicas por doador (32 pseudoilhotas/experimento). O adenovírus foi obtido comercialmente neste trabalho.
6. Combine as quantidades calculadas de suspensão celular, vírus e VPM em um tubo de 1,5 mL. Misture suavemente o conteúdo pipetando para cima e para baixo.
7. Durante a transdução, incubar os tubos com tampas abertas e cobri-los com uma placa de Petri estéril por 2 h em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 °C e 5% CO₂/95% ar.
8. Adicionar 500 μL de VPM a cada tubo e lavar as células centrifugando-as a 500 x g durante 3 min a 4 °C. Complete mais duas lavagens para um total de três lavagens. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de VPM.
9. Calcular o volume total de semeadura celular (200 μL/pseudoilhota). Adicione o VPM (o volume de semeadura celular calculado menos 2 mL) a um tubo cônico de tamanho adequado. Adicionar a suspensão celular transduzida do passo 1.7 ao tubo cónico. Mantenha o tubo cônico ligeiramente fechado, mas não bem fechado para permitir a troca de ar para as células.
10. Enxaguar o tubo de 1,5 mL (do passo 1.7) com 1 mL de VPM e transferir o conteúdo para o tubo cônico, momento em que o tubo cônico deve conter o volume total de semeadura celular.
11. Misture bem o conteúdo do tubo cônico pipetando para cima e para baixo com uma pipeta sorológica motorizada e, em seguida, transfira o conteúdo para um reservatório de reagente estéril. Se o reservatório não retiver todo o volume de semeadura da célula, realize transferências seriadas e certifique-se de que a suspensão esteja bem misturada em cada etapa.
12. Usando uma pipeta P200 multicanal, pipetar a suspensão da célula no reservatório de reagente para cima e para baixo 3-4 vezes para garantir a homogeneidade e, em seguida, pipetar 200 μL da suspensão da célula em cada poço das placas de micropoço.
13. Incubar as pseudoilhotas em incubadora de cultura de tecidos a 37 °C e 5% de CO₂/95% de ar por 6 dias sem alterações do meio. Até o 6º dia, as pseudoilhotas devem estar totalmente formadas e prontas para experimentos (Figura 1B-D).

2. Preparação para imagens de células vivas e microperifusão (1 dia antes do experimento)

NOTA: As informações sobre a preparação do meio de microperifusão estão disponíveis através do recurso protocols.io (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).

1. Colha as pseudoilhotas usando uma pipeta multicanal, transferindo-as da placa de 96 poços para uma placa de Petri estéril. Em seguida, escolha manualmente as pseudoilhotas e transfira-as para outra placa de Petri estéril contendo VPM fresco. Permitir que as pseudoilhotas incubem em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 °C e 5% de CO₂/95% de ar durante a noite.
2. Preparar 1 L de DMEM adicionando 1 g de BSA (grau de radioimunoensaio), 0,11 g de piruvato de sódio, 0,58 g de L-glutamina, 3,2 g de bicarbonato de sódio, 1,11 g de HEPES e 1 frasco de DMEM a 1 L de água ultrapurificada. Preparar uma solução estoque de glicose 1 M em DMEM. Mantenha ambas as soluções a 4 °C durante a noite.
3. Verificar o fluxo do sistema de microperifusão no dia anterior ao experimento. Conecte toda a tubulação a um suporte de chip contendo um microchip vazio, conforme descrito na Figura 2A-B. Utilizar água ultrapurificada como efluente para confirmar uma vazão de 100 μL/min no coletor de fração.

3. Adição de secretagogos ao DMEM (dia do experimento)

1. Adicionar 0,07 mg/mL de ascorbato ao DMEM e preparar os secretagogos em tampão DMEM + ascorbato usando um estoque de glicose 1 M para os tampões contendo glicose.
   NOTA: Ascorbato é usado para estabilizar a epinefrina, impedindo a sua oxidação. Se a epinefrina não estiver sendo usada, o ascorbato pode ser omitido do DMEM.
2. Filtrar os secretagogos duas vezes através de um filtro de poros de 0,22 μm, usando um filtro fresco de cada vez. Aquecer as soluções a 37 °C e medir a glicose através de um glicosímetro para confirmar a concentração desejada.

4. Configuração do aparelho de microperifusão

1. Aqueça a câmara ambiental de um microscópio confocal de varredura a laser a 37 °C, garantindo que todas as portas estejam fechadas e que a câmara mantenha uma temperatura estável. Coloque o suporte do chip que contém o microchip na câmara para aquecer. Verifique a temperatura do chip com uma pistola infravermelha.
   NOTA: Neste caso, a câmara ambiental é ajustada para 38,5 °C, o que permite que o chip atinja 37 °C.
2. Conecte toda a tubulação ao suporte do chip (conforme descrito na Figura 2A-B). Linha nivelada com secretagogo basal por 5 min. Neste estudo, a linha foi lavada com glicose 2 mM (G2). Troque a membrana do bubble trap do desborbulhador a cada 8-10 experimentos.

5. Carregamento das pseudoilhotas no microchip

1. Antes de carregar o microchip, pegue uma imagem de campo claro e campo escuro (aumento de 10x) das pseudoilhotas que serão usadas no experimento para a subsequente quantificação de equivalentes de ilhotas (IEQ).
   NOTA: O IEQ é usado para normalizar a secreção hormonal para variações no número de ilhotas ao longo dos experimentos. Essa etapa também pode ser feita no dia anterior ao experimento.
2. Aspirar qualquer fluido extra das metades inferior e superior do microchip. A metade superior do microchip contém juntas que garantem uma vedação adequada de cada poço, enquanto a metade inferior do microchip contém os poços com uma tampa de vidro acoplada. Pré-molhado um poço no microchip com 5 μL de DMEM. Certifique-se de pipetar em torno das bordas externas do poço para molhar as fendas.
3. Use uma pipeta pré-molhada para coletar 30-32 pseudoilhotas em um volume de 23 μL e distribua lentamente as pseudoilhotas no centro do poço na parte inferior do microchip. Verifique a ponta da pipeta para quaisquer pseudoilhotas que possam ter sido anexadas.
4. Use uma ponta de carregamento de gel para manobrar suavemente as pseudoilhotas no centro do poço. Isso garante que o número máximo de pseudoilhotas será capturado em um campo de visão.
5. Pegue uma imagem das pseudoilhotas no microchip no estereoscópio. Essa contagem será usada para ajustar o IEQ calculado para qualquer perda de pseudoilhota durante esse processo.
   1. Se todas as pseudoilhotas da etapa 5.3 não forem carregadas no microchip, ajuste o IEQ de acordo. Por exemplo, se 30 pseudoilhotas são visualizadas agora, mas 32 foram visualizadas na etapa 5.1, calcule o IEQ nas imagens da etapa 5.1 e, em seguida, multiplique por 30/32.
6. Coloque a parte inferior do microchip no suporte do microchip. Coloque cuidadosamente a parte superior do microchip com a junta verde virada para baixo.
7. Enquanto mantém o microchip no lugar, feche suavemente o suporte do microchip para prender o microchip. Tente não aplicar pressão excessiva no microchip durante esse processo, pois isso deslocará o fluido contido no poço e pode levar à perda de pseudoilhotas. Evite introduzir bolhas de ar no poço.

6. Imagem sincrônica de células vivas e microperifusão

1. Transfira os secretagogos, a bomba e o microchip do suporte para a câmara ambiental instalada no microscópio confocal. Direcione a tubulação de efluxo para fora da câmara para o coletor de frações.
   1. Coloque os tampões em tubos cônicos de 15 mL com aberturas perfuradas em suas tampas. Esses orifícios impedem que a tubulação de coleta saia do tubo.
   2. Ao rosquear a tubulação no desborbulhador, separe a porca e a virola e, em seguida, rosqueie no desborbulhador. Isso evita a torção da linha.
2. Defina o coletor de frações para girar a cada 2 min. Carregar o número adequado de tubos no coletor de frações, contabilizando as lavagens e frações experimentais. Para esses experimentos, foram utilizados 15 tubos de lavagem (30 min de lavagem total) e 28 tubos para coleta de frações.
3. Inicie a bomba para fornecer o meio basal (contendo a concentração de glicose basal) a 100 μL/min (uma coleta de 2 min a uma taxa de fluxo de 100 μL/min resulta em 200 μL de efluente por cada tubo de fração). Essa taxa de fluxo foi escolhida para limitar o estresse absoluto nas pseudoilhotas e prevenir o movimento significativo das pseudoilhotas durante a imagem ao vivo.
   1. Enquanto o fluido estiver atravessando o aparelho, observe o seguinte:
      1. Fique atento às gotículas no final do bico coletor de frações, que indicam o fluxo pelo sistema.
      2. Fique atento às diminuições no efluxo do sistema; se houver <200 μL nos tubos de coleta, isso indica que pode haver um bloqueio ou vazamento no sistema. Consulte a Tabela 2 para obter uma lista das causas potenciais da diminuição do volume de efluentes, soluções e dicas de prevenção.
4. Uma vez que haja um fluxo médio constante da tubulação de efluxo, gire a cabeça do coletor de fração para distribuir nos tubos e inicie o coletor de fração. Recolher as primeiras 15 fracções (30 min) como lavagem para permitir que as pseudoilhotas se equilibrem. Use essas primeiras 15 frações para garantir um fluxo médio contínuo e preciso através do sistema. Descarte essas frações depois.
5. Durante a lavagem de 30 min, configurar o microscópio para obtenção de imagens de células vivas de acordo com os seguintes parâmetros: lente objetiva: U Plan Fluorite 20x com zoom de 1x; canais de fluorescência: EGFP (emissão = 510 nm, comprimento de onda do laser = 488, comprimento de onda de detecção = 500-600 nm); séries temporais: imagem adquirida a cada 2 s durante todo o experimento (i.e., 56 min); Velocidade de amostragem: 2 μS/pixel.
   1. Identificar a parte inferior das pseudoilhotas no campo de visão e ajustar o plano focal para 15 μm acima dessa posição. Este é o quadro que será usado durante todo o experimento de imagem.
6. Uma vez concluída a lavagem de 30 minutos, inicie a coleta da fração e a aquisição das imagens.
   NOTA: Todos os esforços devem ser feitos para identificar e corrigir quaisquer problemas antes desta etapa. Uma vez iniciada a coleta de dados, qualquer pausa no experimento ou exposição excessiva a secretagogos pode afetar adversamente os resultados.
7. Continuar a perifundir as pseudoilhotas com meio basal durante a primeira coleta basal, coletando o efluente em tubos de 1,5 mL. Trocar manualmente a tubulação do tampão basal para o novo tubo tampão de estímulo quando o tempo for apropriado para o experimento.
   1. Uma sequência padrão de microperifusão é mostrada na Tabela 3.
   2. Depois de coletar ~10 frações, coloque todas as frações em um refrigerador de 4 °C até o final do experimento para evitar a degradação dos hormônios, especialmente o glucagon.
   3. Continue a monitorar o fluxo do sistema durante todo o experimento, verificando o volume de efluente em cada tubo.
8. Quando o experimento estiver concluído, volte para o meio basal e permita que a bomba continue funcionando por 5 min para lavar o estímulo com o meio basal (neste caso, 2 mM de glicose).
9. Pare a bomba e desconecte a tubulação do suporte do microchip no desborbulhador e no coletor de frações para remover o suporte do microchip da câmara ambiental. Feche todas as portas após remover o microchip para manter a temperatura.
10. Armazenar os perifusatos a -80 °C para posterior análise hormonal.

7. Extração de etanol ácido de pseudoilhotas

1. Abra cuidadosamente o suporte do microchip e levante a parte superior do microchip. Use uma pipeta e um microscópio de bancada para retirar pseudoilhotas do poço e transferi-las para um tubo de 1,5 mL. Certifique-se da coleta de todas as pseudoilhotas usando um microscópio de bancada, se necessário.
   1. Pegue uma imagem final das pseudoilhotas no microchip antes da remoção do poço para ajustar o extrato da ilhota IEQ, semelhante ao da etapa 5.5.
2. Lavar duas vezes com 500 μL de PBS. Gire as pseudoilhotas por 1 min a 94 x g entre cada lavagem e aspirar o sobrenadante.
3. Após a remoção da última lavagem, adicionar 200 μL de etanol ácido (5,5 mL de etanol 95% + 50 μL de HCl 12 N). Conservar a 4 °C durante a noite.
4. No dia seguinte, gire os extratos por 10 min a 15.989 x g e 4 °C. Alíquota 45 μL em três novos tubos. Conservar a -80 °C para análise do teor hormonal. Como alternativa à normalização da secreção hormonal para o IEQ, a secreção hormonal também pode ser normalizada para o conteúdo hormonal das pseudoilhotas medido a partir dos extratos.

8. Experiências adicionais e limpeza

1. Repita as etapas 5 a 7 com grupos subsequentes de pseudoilhotas para obter réplicas técnicas adicionais.
2. Depois de terminar todos os experimentos de microperifusão, passe água sanitária a 10% através do microchip e tubulação por 5 min e, em seguida, água ultrapurificada por 30 min para higienizar a tubulação.

9. Análise dos dados

NOTA: A imagem de células vivas foi realizada usando um microscópio confocal de varredura a laser. As imagens foram analisadas usando o software de imagem associado ao microscópio. As diretrizes a seguir são gerais, mas podem diferir dependendo do fabricante do microscópio e do software de aquisição de imagens.

1. Determinando os equivalentes totais de ilhotas (IEQ) para normalização de dados
   1. Abra o programa de software e clique na guia Aquisição no canto superior direito da janela. Grave em lote em todas as imagens de campo escuro selecionando a função Gravação em lote no Gerenciador de Macros (Exibir > Ferramenta Windows > Gerenciador de Macros).
      1. Para gravar várias imagens de uma só vez, clique no botão Alternar Modo em lote antes de clicar no botão Executar no Gerenciador de Macros. Siga as instruções na tela para selecionar o local da imagem de origem e o local de destino das imagens gravadas. Para o tipo de arquivo de imagem, escolha Tagged Imagine File Format (*.tif).
   2. Para a medição IEQ, abra a versão gravada da imagem de campo escuro de 10x obtida na etapa 5.1. Clique na guia Contagem e Medida na parte superior e escolha o botão Limite HSV Manual à esquerda.
      1. Use a função conta-gotas para adicionar/remover a área positiva (em vermelho) até que cada pseudoilhota seja realçada em vermelho, sem se estender além da borda da pseudoilhota. Clique em Contar e Medir.
   3. Use as funções de divisão automática ou divisão manual para dividir as pseudoilhotas que foram unidas.
      1. Para dividir manualmente as pseudoilhotas, escolha a função de divisão manual, clique com o botão esquerdo do mouse para desenhar uma linha separando as pseudoilhotas e clique com o botão direito do mouse para concluir a linha. Para dividir automaticamente, escolha a função de divisão automática e clique nas pseudoilhotas agrupadas de interesse. Confirme a divisão automática correta depois.
   4. Em imagens gravadas em lote, a barra de escala e o texto de ampliação podem ser marcados como positivos. Exclua esses objetos para obter uma contagem precisa realçando o texto e a barra de escala usando o mouse e pressionando a tecla Delete do teclado.
   5. Ative e desative o filtro para confirmar que todas as pseudoilhotas estão sendo contadas. O arquivo também pode ser aberto fora do programa para referência cruzada. Quando terminar, clique em Exportar para Excel.
   6. Abra a planilha e modifique-a da seguinte maneira.
      1. Exclua as informações de contagem, média e classificação na parte inferior. Classifique os objetos com base em seu diâmetro médio. Insira uma coluna após o diâmetro médio e nomeie a coluna como "Contagem de pseudoilhotas".
      2. A contagem de ilhotas é determinada pelo número de pseudoilhotas com diâmetros médios que se enquadram dentro de cada índice abaixo. Multiplique o número de pseudoilhotas por índice pelo respectivo fator de conversão IEQ e soma esses valores para determinar o IEQ total. Realizar os cálculos do IEQ nas imagens adquiridas antes de cada experimento. Use os seguintes índices e fatores de conversão IEQ:
         1-49 μm: × 0,167
         50-100 μm: × 0,667
         101-150 μm: × 1.685
         151-200 μm: × 3.500
         201-300 μm: × 6,315
         301-350 μm: × 10.352
      3. Para obter um exemplo de planilha para determinar as contagens IEQ, consulte Arquivo Suplementar 1.
2. Quantificação de imagens em células vivas em software
   1. Abra o arquivo desejado (.oir) em cellSens.
   2. Designe as regiões de interesse (ROIs) da seguinte maneira.
      1. Use as ferramentas de desenho para designar as ROIs (ou seja, cada pseudoilhota). Se estiver usando a opção de desenho à mão livre, clique com o botão direito do mouse para fechar a forma.
      2. Realce todas as ROIs usando o ponteiro de seta e arrastando-o para abranger todas as ROIs na imagem. Com todos os ROIs realçados, clique com o botão direito do mouse e selecione Converter em ROI dinâmico ao longo do tempo
      3. Reproduza o arquivo XYT para confirmar se as ROIs são precisas ao longo do tempo. Se o ROI não for preciso em um período específico, corrija seu tamanho/localização nesse período. O software ajustará gradualmente o tamanho/localização do ROI ao longo do tempo para corresponder a essas alterações. Repita essas etapas até que a ROI seja precisa durante todo o experimento de imagem.
   3. Realize medições de intensidade em cada ROI da seguinte maneira.
      1. Na barra de ferramentas, clique em Medir Perfil de Intensidade. Destaque os ROIs a serem analisados; use shift + clique para selecionar várias ROIs.
         Observação : enquanto vários arquivos podem ser abertos ao mesmo tempo no software, analisar apenas os ROIs de um arquivo de cada vez.
      2. Para contabilizar o ruído de fundo, selecione um valor constante para subtrair de cada valor de intensidade ou designe um ROI como plano de fundo. Clique em Executar.
      3. Na barra de ferramentas Perfil de intensidade , clique em Exportar para Excel para exportar os dados.
      4. Normalize todos os pontos de dados para a média das intensidades medidas de 7-8 min (ou seja, o último minuto da primeira perifusão média basal). Esses valores normalizados em cada momento são definidos como a intensidade relativa do cADDis. Para obter um exemplo de planilha de análise e normalização de dados de imagem, consulte Arquivo suplementar 2.
3. Medir a secreção hormonal em cada fração e extrato de ilhotas. Nesses experimentos, as concentrações de insulina e glucagon foram medidas por ELISA. Normalizar a secreção hormonal em cada fração para o volume da pseudoilhota usando as medidas de IEQ determinadas na etapa 9.1 ou pelo conteúdo hormonal do extrato.

Resultados

Pseudoilhotas humanas que expressam biossensores foram criadas através da liberação adenoviral de construtos que codificam o cADDis do biossensor cAMP (Figura 1A). A Figura 1B mostra a reagregação das células das ilhotas humanas transduzidas ao longo do tempo, com pseudoilhotas totalmente formadas observadas após 6 dias de cultivo. As células começaram a apresentar fluorescência visível do cADDis dentro de 48 h, e houve alta expressão de biossensores na...

Discussão

A integração de um sistema de microperifusão, pseudoilhotas que expressam biossensores e microscopia confocal de varredura a laser permite a avaliação sincrônica de eventos de sinalização intracelular e perfis secretores hormonais dinâmicos. O sistema dinâmico de microperifusão pode fornecer uma série de estímulos bem definidos às pseudoilhotas e permite a coleta do efluente, no qual as concentrações de insulina e glucagon podem ser medidas por ELISA comercialmente disponível. Ao mesmo tempo, imagens de células vivas das...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Não aplicável
0,01" Tubulação FEP	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Componente de Mídia Enriquecido-CMRL
1.5 mL e tubos cônicos	Qualquer	Qualquer
10 μ m Filtro PTFE	Cole-Parmer	SK-21940-41	Troque a cada 8-10 corridas
100 mM Pyruvate de Sódio	Thermo Scientific	11360070	Componente de Mídia Enriquecido-CMRL
190 prova Etanol	Decon labs	2816	Componente de Etanol Ácido
200 mM Suplemento GlutaMAX-I	Gibco	35050061	Componente de Mídia Enriquecido-CMRL
Ascorbato	Sigma	A5960	DMEM Componente Tampão de Perifusão
Soro Bovino Albumina	Sigma	A7888	DMEM Componente Tampão de Perifusão
Armadilha de bolhas	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA  Microplacas de 96 poços	Perkin Elmer	6055330
cellSens software de análise	Olympus	v3.1	Software usado para análise de dados
CMRL 1066	MediaTech	Componente de Mídia Enriquecido	15-110-CV
Adaptador Cônico (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glicose	Sigma	G7528	Componente Tampão de Glicose
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Componente de Tampão de Perifusão Câmara
ambiental	okolab	IX83
Epineferina (Epi)	Sigma	E4250	Componente de Buffer de Estimulação
Soro Bovino Fetal (FBS), Componente de Mídia Enriquecido	Sigma	12306C	Enriquecido com CMRL
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Kit Glucagon HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Qualquer	Qualquer	Componente de Etanol Ácido
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Componente Tampão de Perifusão iCell
Células Endoteliais Suplemento Médio	Cell	Dynamics M1019	iEC Componente de Mídia
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulina ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutilmetilonina (IBMX)	Sigma	I5879	Componente de Buffer de Estimulação
Microscópio confocal de varredura a laser	Olympus	FV3000
L-Glutamina	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer
Component Microchip (Universidade de Miami, FP-3W)	Universidade de Miami	Suporte para microchip FP-3W
	Micronit Microfluídica	FC_PRO_CH4525
Modelo 2110 Coletor de Frações	Biorad	7318122
P10, P200, e P1000 pipetas e pontas	Qualquer	Penicilina
/Estreptomicina	Gibco	15140-122	Componente de Mídia Enriquecido-CMRL
Bomba peristáltica	Instech	P720
Tampão com Fosfato Salino	Gibco	14190-144	Ilhotas de Lavagem
Sarstedt pratos	Sarstedt depende	do diâmetro
Bicarbonato de Sódio	Sigma	S6014	DMEM Componente Tampão de Perifusão
Pirovato de Sódio	Sigma	P2256	Estereoscópio de Componente de Buffer de Perifusão DMEM
	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μ m)	de SCGP00525	Millipore	todos os buffers duas vezes
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component