Sistema de Pseudoilhotas Humanas para Avaliação Síncrona da Dinâmica de Biossensores Fluorescentes e Perfis Secretores de Hormônios

Tiffany M. Richardson; Yasminye D. Pettway; John T. Walker; Heather A. Nelson; Matthew Ishahak; Gregory Poffenberger; Radhika Aramandla; Conrad Reihsmann; Ashutosh Agarwal; Alvin C. Powers; Marcela Brissova

doi:10.3791/65259

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Artigo de método

Sistema de Pseudoilhotas Humanas para Avaliação Síncrona da Dinâmica de Biossensores Fluorescentes e Perfis Secretores de Hormônios

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DOI:

10.3791/65259

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3 de novembro de 2023

Tiffany M. Richardson^*¹ , Yasminye D. Pettway^*¹ , John T. Walker¹ , Heather A. Nelson² , Matthew Ishahak³ , Gregory Poffenberger² , Radhika Aramandla² , Conrad Reihsmann² , Ashutosh Agarwal³ , Alvin C. Powers¹^,²^,⁴ , Marcela Brissova²

¹Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, ²Division of Diabetes, Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, ³Department of Biomedical Engineering, University of Miami, ⁴VA Tennessee Valley Healthcare System

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método para a aquisição sincrônica e o co-registro de eventos de sinalização intracelular e a secreção de insulina e glucagon por pseudoilhotas humanas primárias usando a entrega adenoviral de um biossensor cíclico de adenosina monofosfato (AMPc), um detector de diferença de AMPc in situ (cADDis) e um sistema de microperfusão.

Resumo

As ilhotas pancreáticas de Langerhans, que são pequenas coleções 3D de células endócrinas e de suporte especializadas intercaladas por todo o pâncreas, têm um papel central no controle da homeostase da glicose através da secreção de insulina pelas células beta, que reduz a glicemia, e glucagon pelas células alfa, que eleva a glicemia. As vias de sinalização intracelular, incluindo aquelas mediadas pelo AMPc, são fundamentais para a secreção regulada dos hormônios alfa e beta. A estrutura 3D das ilhotas, embora essencial para a função coordenada das ilhotas, apresenta desafios experimentais para estudos mecanísticos das vias de sinalização intracelular em células primárias das ilhotas humanas. Para superar esses desafios e limitações, este protocolo descreve uma plataforma microfluídica e de imagem integrada de células vivas usando pseudoilhotas humanas primárias geradas a partir de doadores sem diabetes que se assemelham a ilhotas nativas em sua morfologia, composição e função. Estas pseudoilhotas são controladas pelo tamanho através do processo de dispersão e reagregação das células primárias das ilhotas humanas. No estado disperso, a expressão gênica das ilhotas celulares pode ser manipulada; por exemplo, biossensores como o biossensor cAMP codificado geneticamente, cADDis, podem ser introduzidos. Uma vez formadas, as pseudoilhotas que expressam um biossensor codificado geneticamente, em combinação com microscopia confocal e uma plataforma de microperifusão, permitem a avaliação sincrônica da dinâmica do biossensor fluorescente e dos perfis secretores de hormônios alfa e beta para fornecer mais informações sobre os processos e a função celular.

Introdução

As ilhotas de Langerhans são miniórgãos espalhados pelo pâncreas cuja função é crucial para a manutenção da homeostase da glicose. A insulina é secretada pelas células beta após o metabolismo da glicose, o aumento da relação ATP/ADP, o fechamento dos canais de potássio sensíveis ao ATP, a despolarização da membrana plasmática e o influxo de cálcio extracelular¹. A secreção de glucagon pelas células alfa é menos compreendida, mas tem sido postulado que as vias intracelular e parácrina contribuem para a exocitose dos grânulos de glucagon ^2,3,4. Tanto o d....