Modelando Tumores Cerebrais In Vivo Usando a Liberação Eletroporada de DNA Plasmidial Representando Assinaturas de Mutação de Pacientes

Katie B. Grausam; Joshua J. Breunig

doi:10.3791/65286

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Artigo de método

Modelando Tumores Cerebrais In Vivo Usando a Liberação Eletroporada de DNA Plasmidial Representando Assinaturas de Mutação de Pacientes

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DOI:

10.3791/65286

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23 de junho de 2023

Katie B. Grausam^*¹ , Joshua J. Breunig^*¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Board of Governor’s Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, ²Center for Neural Sciences in Medicine, Cedars-Sinai Medical Center, ³Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, ⁴Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute, Cedars-Sinai Medical Center, ⁵Department of Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A utilização de um modelo de tumor autóctone imunocompetente conduzido por mutações comuns de pacientes para testes pré-clínicos é fundamental para testes imunoterapêuticos. Este protocolo descreve um método para gerar modelos de tumor cerebral em camundongos usando a entrega baseada em eletroporação de DNA plasmidial que representa mutações comuns em pacientes, fornecendo assim um modelo de camundongo preciso, reprodutível e consistente.

Resumo

Os modelos tumorais são fundamentais para o teste pré-clínico de tumores cerebrais em termos de exploração de novos tratamentos mais eficazes. Com interesse significativo em imunoterapia, é ainda mais crítico ter um modelo de camundongo consistente, clinicamente pertinente e imunocompetente para examinar as populações de células tumorais e imunes no cérebro e sua resposta ao tratamento. Enquanto a maioria dos modelos pré-clínicos utiliza o transplante ortotópico de linhagens de células tumorais estabelecidas, o sistema de modelagem apresentado aqui permite uma representação "personalizada" de mutações tumorais específicas do paciente em um desenvolvimento gradual, mas eficaz, a partir de construções de DNA inseridas em células precursoras neurais (NPCs) em divisão in vivo. As construções de DNA apresentam a análise em mosaico com o método de troca de mediado por dupla recombinase (MADR), permitindo mutagênese somática de cópia única de mutações condutoras. Usando filhotes de camundongos recém-nascidos entre o nascimento e 3 dias de idade, os NPCs são visados aproveitando essas células em divisão que revestem os ventrículos laterais. A microinjeção de plasmídeos de DNA (por exemplo, derivados de MADR, transposons, sgRNA direcionado por CRISPR) nos ventrículos é seguida por eletroporação usando pás que circundam a região rostral da cabeça. Após a estimulação elétrica, o DNA é levado para dentro das células em divisão, com potencial de integração ao genoma. O uso deste método tem sido demonstrado com sucesso no desenvolvimento de tumores cerebrais pediátricos e adultos, incluindo o tumor cerebral maligno mais comum, o glioblastoma. Este artigo discute e demonstra as diferentes etapas do desenvolvimento de um modelo de tumor cerebral utilizando esta técnica, incluindo o procedimento de anestesia de filhotes jovens de camundongos, para microinjeção da mistura de plasmídeos, seguida de eletroporação. Com este modelo autóctone e imunocompetente do rato, os pesquisadores terão a capacidade de expandir as abordagens da modelagem pré-clínica, nos esforços para melhorar e examinar o tratamento eficaz do cancro.

Introdução

Modelos de tumores cerebrais murinos são cruciais para a compreensão dos mecanismos de formação e tratamento de tumores cerebrais. Os modelos atuais tipicamente incluem transplantes subcutâneos ou ortotópicos de linhagens de células tumorais comumente usadas, baseados em um número limitado de mutações condutoras ou modelos de xenoenxertos derivados do paciente, usando camundongos imunodeficientes que dificultam estudos adequados de imunoterapia 1,2,3,4. Além disso, esses resultados pré-clínicos podem levar a falsos positivos, na medida em qu....