Apresentamos aqui um protocolo eficaz de perfusão rápida de sangue para preparar amostras de tecido de rãs africanas com garras para estudos transcriptômicos e proteômicos.
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Artigo de método
Perfusão sanguínea rápida eficaz em Xenopus
Neste artigo
Resumo
Resumo
Xenopus têm sido poderosos organismos modelo para entender o desenvolvimento de vertebrados e doenças por mais de 100 anos. Aqui, um protocolo de perfusão sanguínea rápida em Xenopus, visando uma redução consistente e drástica do sangue dentro de todos os tecidos, é definido. A perfusão é realizada inserindo uma agulha diretamente no ventrículo do coração e bombeando solução salina tamponada com fosfato heparinizado (PBS) através do sistema vascular. O procedimento pode ser concluído em aproximadamente 10 min por animal. O sangue é dominado por algumas proteínas e tipos celulares altamente abundantes, criando inúmeros problemas, pois essas proteínas mascaram a maioria das outras moléculas e tipos celulares de interesse. A caracterização reprodutível de tecidos adultos de Xenopus com proteômica quantitativa e transcriptômica de célula única se beneficiará da aplicação deste protocolo antes da amostragem de órgãos. Os protocolos para amostragem de tecidos são definidos em artigos complementares. Esses procedimentos visam à padronização de práticas entre Xenopus de diferentes sexos, idades e estados de saúde, especificamente X. laevis e X. tropicalis.
Introdução
A perfusão de corpo inteiro dos anfíbios é rotineiramente completada para fins de preservação e fixação 1,2,3,4,5,6. No entanto, esses procedimentos ocorrem a uma taxa que limita o número de amostras frescas que podem ser coletadas por animal. O objetivo deste trabalho é desenvolver um protocolo de perfusão sanguínea efetivo em Xenopus, priorizando a velocidade da técnica. O protocolo leva menos de 10 min por animal para X. tropicalis e menos de 15 min po....
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Protocolo
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas e regulamentos da Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
NOTA: Embora o método primário de eutanásia descrito seja considerado uma técnica aceitável para eutanásia pela Associação Médica VeterináriaAmericana 12, não foi encontrado que levasse à cessação de um batimento cardíaco13. Mesmo o método secundário frequentemente usado de pithing duplo não impede isso, nem remove o coração do animal. A exsanguinação de animais anestesiados é considerada um método humano e eficaz para o su....
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Resultados
Após uma perfusão bem-sucedida, todos os tecidos (excluindo o fígado em Xenopus pigmentado) serão nitidamente mais leves e menos saturados de sangue. Os principais vasos sanguíneos tornar-se-ão menos perceptíveis (Figura 10), e os tecidos (excluindo o fígado) serão enxaguados de forma limpa no tampão após a amostragem. Embora a execução bem-sucedida do protocolo só possa ser confirmada pela qualidade dos dados das amostras de tecido exsangüinado, vários problemas típicos, suas possí.......
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Discussão
Este protocolo descreve as técnicas tradicionais de dissecção para acesso à cavidade celômica. Outras técnicas também são aceitáveis, desde que causem danos mínimos aos tecidos, o coração seja acessível e o pulmão e o estômago sejam visíveis. Da mesma forma, a maioria das ferramentas de dissecção listadas pode ser facilmente substituída por itens comparáveis.
Embora tenham sido feitas tentativas para otimizar a eficácia desse procedimento, os resultados podem variar dependendo da experiência e.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo OD031956 de concessão OD R24 do NIH e pelo HD073104 de concessão NICHD R01. Agradecemos a Darcy Kelly pelas discussões úteis e contribuições iniciais sobre este protocolo. Também gostaríamos de agradecer a Samantha Jalbert, Jill Ralston e Wil Ratzan por sua assistência e apoio, bem como aos nossos três revisores anônimos por seus comentários.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 5x Lupa com luz LED e suporte | amazon.com | luz B08QJ6J8P1 | não deve produzir calor |
| Pipetas de transferência descartáveis | VWR | em>414004-036 | |
| Pinça de dissecação de ponta fina | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Tesoura de dissecação pino afiado, reto 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Bandeja de dissecação | Fisher Scinetific | 14-370-284 | são uma alternativa aceitável |
| Recipiente para eutanásia | de plástico dos EUA | 2860 | recipientes opacos alternativos aceitáveis |
| Tampa de recipiente de eutanásia | Item de plástico dos EUA | 3047 | |
| Pinos de dissecação fina | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| Agulhas hipodérmicas de uso geral, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | para X. laevis |
| Agulhas hipodérmicas de uso geral, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | para X. tropicalis |
| Heparina, mucosa | intestinal suínaTesoura de iridectomia MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| 6" | vwr | 470018-938 | tesouras de íris são uma alternativa aceitável |
| Adaptador Luer-to-barb macho Luer com anel de trava | amazon.com B09PTX6M2Z | tamanho dependerá da mangueira da bomba usada | |
| Porta-agulha Mayo-Hegar | Fisher Scinetific | 08-966 | são uma alternativa aceitável |
| MS-222: Síncaína (anteriormente tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Bomba de dosagem de líquido peristáltico 5– 100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | qualquer bomba peristáltica capaz de bombear 5-10mL/min é aceitável |
| Pedra de amolar | VWR | 470150-112 | opcional; para agulhas embotantes |
| Bicarbonato de sódio, pó, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Pinça de amostra, serrilhada | VWR | 82027-442 | |
| Pinos em T para dissecar | Fisher Seringas | Scinetific S99385 | |
| , cortadores de arame | de BD328438 | VWR | |
| cortadores laterais ultra afiados e potentes de 6 polegadas | amazon.com | B087P191LP |
Referências
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B.
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Reimpressões e permissões
