Apresentamos aqui um protocolo eficaz de perfusão rápida de sangue para preparar amostras de tecido de rãs africanas com garras para estudos transcriptômicos e proteômicos.
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Artigo de método
Perfusão sanguínea rápida eficaz em Xenopus
Neste artigo
Resumo
Resumo
Xenopus têm sido poderosos organismos modelo para entender o desenvolvimento de vertebrados e doenças por mais de 100 anos. Aqui, um protocolo de perfusão sanguínea rápida em Xenopus, visando uma redução consistente e drástica do sangue dentro de todos os tecidos, é definido. A perfusão é realizada inserindo uma agulha diretamente no ventrículo do coração e bombeando solução salina tamponada com fosfato heparinizado (PBS) através do sistema vascular. O procedimento pode ser concluído em aproximadamente 10 min por animal. O sangue é dominado por algumas proteínas e tipos celulares altamente abundantes, criando inúmeros problemas, pois essas proteínas mascaram a maioria das outras moléculas e tipos celulares de interesse. A caracterização reprodutível de tecidos adultos de Xenopus com proteômica quantitativa e transcriptômica de célula única se beneficiará da aplicação deste protocolo antes da amostragem de órgãos. Os protocolos para amostragem de tecidos são definidos em artigos complementares. Esses procedimentos visam à padronização de práticas entre Xenopus de diferentes sexos, idades e estados de saúde, especificamente X. laevis e X. tropicalis.
Introdução
A perfusão de corpo inteiro dos anfíbios é rotineiramente completada para fins de preservação e fixação 1,2,3,4,5,6. No entanto, esses procedimentos ocorrem a uma taxa que limita o número de amostras frescas que podem ser coletadas por animal. O objetivo deste trabalho é desenvolver um protocolo de perfusão sanguínea efetivo em Xenopus, priorizando a velocidade da técnica. O protocolo leva menos de 10 min por animal para X. tropicalis e menos de 15 min por animal X. laevis. As prioridades secundárias são a facilidade de replicação e o uso de equipamentos de fácil aquisição para que amostras de alta qualidade possam ser amplamente compartilhadas entre os laboratórios Xenopus.
As rãs Xenopus são amplamente utilizadas em pesquisas biomédicas para estudar processos biológicos e patológicos fundamentais conservados entre espécies. Este tetrápode tem uma relação evolutiva mais próxima com os mamíferos do que outros modelos aquáticos, tendo pulmões, um coração de três câmaras e membros com dedos. A comunidade internacional usa efetivamente o Xenopus para obter uma compreensão mais profunda da doença humana por meio de modelagem profunda da doença e análise molecular da função gênica relacionada à doença. As inúmeras vantagens do Xenopus como modelo animal os tornam ferramentas inestimáveis para estudar as bases moleculares do desenvolvimento humano e das doenças; Essas vantagens incluem: grande tamanho do ovócito e do embrião, alta fecundidade, facilidade de alojamento, rápido desenvolvimento externo e facilidade de manipulação genômica. Estima-se que o Xenopus compartilhe ~80% dos genes de doenças humanas identificados7.
Em comparação com modelos populares de mamíferos, o Xenopus é um modelo rápido e econômico, com a facilidade de knock-down de morfolinos e disponibilidade de transgênicos eficientes e mutações gênicas direcionadas usando CRISPR8. A espectrometria quantitativa de massas e a transcriptômica unicelular têm sido aplicadas com sucesso em embriões de Xenopus9,10, mas um atlas celular recente de Xenopus laevis mostra que a composição da maioria dos tecidos é dominada pelos tipos de células sanguíneas 11. Ao desenvolver uma técnica que exsanguina o tecido em um ritmo rápido e usando meios refrigerados, o frescor da amostra é minimamente afetado pela perfusão. Isso é particularmente importante para aplicações onde o objetivo é traçar o perfil fisiologicamente não perturbado do RNAm ou da expressão de proteínas.
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Protocolo
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas e regulamentos da Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
NOTA: Embora o método primário de eutanásia descrito seja considerado uma técnica aceitável para eutanásia pela Associação Médica VeterináriaAmericana 12, não foi encontrado que levasse à cessação de um batimento cardíaco13. Mesmo o método secundário frequentemente usado de pithing duplo não impede isso, nem remove o coração do animal. A exsanguinação de animais anestesiados é considerada um método humano e eficaz para o sucesso da eutanásia12. Como a manutenção de tecidos frescos através da eutanásia é o objetivo deste protocolo, é benéfico que o coração continue a bater através da eutanásia primária com MS-222, e que a perfusão seja em si um método de eutanásia secundária através da exsanguinação.
1. Preparo
- Certificar-se de que a instituição de pesquisa aprovou a técnica de eutanásia e perfusão descrita neste protocolo.
- Preparar uma solução de 5 g/L MS-222 (metanossulfonato de tricaina) e 5 g/L de bicarbonato de sódio. O volume deve ser maior do que o volume necessário para cobrir completamente os animais a serem eutanasiados. Verifique o pH para garantir que está ≥7.
- Preparar 500 μL de 180 U/mL de heparina em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por X. laevis, ou 200 μL por X. tropicalis.
- Realizar a eutanásia primária colocando o Xenopus nesta solução (a partir do passo 1.2); O animal permanecerá submerso por um total de 1 h.
- Confirme que o Xenopus perdeu sua resposta de dor ao beliscar o pé 15 minutos após a eutanásia. Se o animal for reativo, devolva-o à solução de eutanásia até que essa resposta seja perdida.
- Pese o Xenopus e faça todas as medições adicionais necessárias antes da amostragem.
- Com uma agulha de 31 G, injetar X. laevis com 250 μL e X. tropicalis com 100 μL de 180 U/mL de heparina em PBS (a partir do passo 1.3) na musculatura de cada membro torácico.
- Preparar uma solução de 1 mL/g do peso do animal de 54 U/mL de heparina em perfusato de PBS. Indivíduos mais experientes com esse protocolo podem achar que menos meios são necessários para completar a perfusão.
- Use uma agulha hipodérmica 22 G para perfundir X. laevis e uma agulha hipodérmica 25 G para X. tropicali s. Embotar a agulha de perfusão aparando a ponta com cortadores de arame (Figura 1)14.
NOTA: Isso reduz a probabilidade de a agulha perfurar através do ventrículo se deslocada. Além de embotar, a agulha pode ser ligeiramente moída com uma pedra afiada ou lima, mas ainda permanecendo afiada o suficiente para perfurar o ventrículo. - Preparar a bomba ligando a agulha aparada e circulando 54 U/mL de perfusato de PBS heparinizado (a partir do passo 1.8). Certifique-se de purgar todas as bolhas de ar da tubulação para eliminar a possibilidade de embolia gasosa, o que leva à diminuição da eficiência ou falha da perfusão (ver Tabela 1). Manter o meio de perfusão no gelo durante todo o procedimento.
- Se a bomba não for programável, com a agulha no lugar, meça o volume bombeado do meio sob as diferentes configurações para determinar quais configurações estão mais próximas de 5 mL/min e 10 mL/min. Estes caudais serão utilizados independentemente da espécie. Se a bomba de perfusão for programável, calibre-a com a agulha no lugar, seguindo as instruções do fabricante.
- Coloque a superfície de dissecção (bandeja ou folha de espuma) em uma inclinação dentro de um recipiente secundário ou arranje-a para facilitar a drenagem do sangue.
- Uma vez que a rã tenha estado na solução por 1 h, a eutanásia primária foi concluída. Remova a rã e verifique novamente a perda de resposta à dor realizando uma pinça no pé.
- Coloque a rã de costas e fixe cada membro (Figura 2). Se for necessário preservar o tecido dos membros, pinos finos podem ser colocados através dos dedos ou grampos em forma de U ao redor dos membros.
- Com tesoura de dissecção, corte a pele, suba a linha média e depois lateralmente, confeccionando dois retalhos. (Gráfico 2)
- Use pinça para agarrar a linha alba e puxá-la para longe da cavidade celômica (Figura 3). Use cuidadosamente a tesoura para cortar a musculatura. Faça dois retalhos para fora da parede da cavidade e corte ou fixe todos os retalhos fora do caminho.
- Utilizar tesoura de dissecção para cortar os ossos coracoide e cortar o excesso de tecido para melhor acesso ao coração (Figura 3).
- O coração ainda deve estar batendo. Se o coração parou de bater antes da perfusão, observe que o frescor da amostra foi comprometido.
2. Perfusão
- Identifique o estômago e desloque-o suavemente para que fique em cima do lobo esquerdo do fígado (à direita do observador), com sua vasculatura visível durante o procedimento. Identifique um pulmão e segure-o por sua ponta usando pinças de tecido. Puxar o pulmão para fora da cavidade celômica e fixá-lo através da ponta (Figura 4). Faça isso suavemente, pois os vasos sanguíneos quebrados não perfundem bem. Observe se o sangue é visível dentro do lóbulo, pois isso afetará a capacidade de determinar a conclusão do procedimento.
- Tire uma imagem da cavidade celômica para avaliar melhor a eficiência da perfusão e potencialmente identificar tecidos anormais em uma data posterior.
- Identificar o pericárdio fino e tracioná-lo com pinça de tecido (Figura 5). Perfurar suavemente o pericárdio usando a ponta da tesoura de iridectomia, tomando cuidado para não cortar os tecidos subjacentes. Descasque o pericárdio para longe das três câmaras do coração.
- Use pinças para segurar suavemente o ventrículo pelo seu ápice. Aplicar pressão limitada para que haja espaço suficiente entre as superfícies de tração da pinça para a passagem da agulha de perfusão (Figura 6).
- Inserir a agulha através do fechamento da pinça na câmara do ventrículo, tomando cuidado para não perfurar através do ventrículo (Figura 7). Aperte a pinça de tecido no lugar usando um suporte de agulha usando um hemostático.
NOTA: Esta técnica estabiliza a posição da agulha, que ainda está afiada. O pinçamento da agulha diretamente no ventrículo também causará danos desnecessários, dificultando a recuperação caso seja necessário (ver Tabela 1). - Iniciar o fluxo da bomba em aproximadamente 5 mL/min. As três câmaras do coração e do tronco arterial irão ingurgitar (Figura 8; ver Tabela 1).
- Com tesoura, lance cuidadosamente a aurícula direita (à esquerda do espectador); sangue derramará. Ajuste o fluxo em 5 mL/min ou aumente-o para 10 mL/min.
- Continue até que a vasculatura do estômago se abra (ver Tabela 1), depois lance a aurícula esquerda do coração (à direita do espectador). Se o fluxo ainda for de 5 mL/min, aumente-o para aproximadamente 10 mL/min.
- Use uma pipeta de transferência para enxaguar a cavidade celômica em meios de perfusão, para ajudar a manter a visibilidade e avaliar melhor a cor do perfusato que flui das aurículas.
- Manter a agulha no lugar até que o perfusato que flui das aurículas esteja claro (ver Tabela 1) e o pulmão tenha perdido sua tonalidade vermelha (ver Tabela 1; Gráfico 9).
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Resultados
Após uma perfusão bem-sucedida, todos os tecidos (excluindo o fígado em Xenopus pigmentado) serão nitidamente mais leves e menos saturados de sangue. Os principais vasos sanguíneos tornar-se-ão menos perceptíveis (Figura 10), e os tecidos (excluindo o fígado) serão enxaguados de forma limpa no tampão após a amostragem. Embora a execução bem-sucedida do protocolo só possa ser confirmada pela qualidade dos dados das amostras de tecido exsangüinado, vários problemas típicos, suas possí...
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Discussão
Este protocolo descreve as técnicas tradicionais de dissecção para acesso à cavidade celômica. Outras técnicas também são aceitáveis, desde que causem danos mínimos aos tecidos, o coração seja acessível e o pulmão e o estômago sejam visíveis. Da mesma forma, a maioria das ferramentas de dissecção listadas pode ser facilmente substituída por itens comparáveis.
Embora tenham sido feitas tentativas para otimizar a eficácia desse procedimento, os resultados podem variar dependendo da experiência e...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo OD031956 de concessão OD R24 do NIH e pelo HD073104 de concessão NICHD R01. Agradecemos a Darcy Kelly pelas discussões úteis e contribuições iniciais sobre este protocolo. Também gostaríamos de agradecer a Samantha Jalbert, Jill Ralston e Wil Ratzan por sua assistência e apoio, bem como aos nossos três revisores anônimos por seus comentários.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 5x Lupa com luz LED e suporte | amazon.com | luz B08QJ6J8P1 | não deve produzir calor |
| Pipetas de transferência descartáveis | VWR | em>414004-036 | |
| Pinça de dissecação de ponta fina | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Tesoura de dissecação pino afiado, reto 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Bandeja de dissecação | Fisher Scinetific | 14-370-284 | são uma alternativa aceitável |
| Recipiente para eutanásia | de plástico dos EUA | 2860 | recipientes opacos alternativos aceitáveis |
| Tampa de recipiente de eutanásia | Item de plástico dos EUA | 3047 | |
| Pinos de dissecação fina | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| Agulhas hipodérmicas de uso geral, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | para X. laevis |
| Agulhas hipodérmicas de uso geral, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | para X. tropicalis |
| Heparina, mucosa | intestinal suínaTesoura de iridectomia MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| 6" | vwr | 470018-938 | tesouras de íris são uma alternativa aceitável |
| Adaptador Luer-to-barb macho Luer com anel de trava | amazon.com B09PTX6M2Z | tamanho dependerá da mangueira da bomba usada | |
| Porta-agulha Mayo-Hegar | Fisher Scinetific | 08-966 | são uma alternativa aceitável |
| MS-222: Síncaína (anteriormente tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Bomba de dosagem de líquido peristáltico 5– 100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | qualquer bomba peristáltica capaz de bombear 5-10mL/min é aceitável |
| Pedra de amolar | VWR | 470150-112 | opcional; para agulhas embotantes |
| Bicarbonato de sódio, pó, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Pinça de amostra, serrilhada | VWR | 82027-442 | |
| Pinos em T para dissecar | Fisher Seringas | Scinetific S99385 | |
| , cortadores de arame | de BD328438 | VWR | |
| cortadores laterais ultra afiados e potentes de 6 polegadas | amazon.com | B087P191LP |
Referências
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154(2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306(2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37(2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331(2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
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Reimpressões e permissões
