Método "Brain Milking" para o Isolamento de Células-Tronco Neurais e Células Progenitoras de Oligodendrócitos de Ratos Vivos

Resumo

Um método para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras de oligodendrócitos do cérebro de ratos vivos é apresentado aqui em detalhes experimentais. Permite múltiplas coletas dessas células dos mesmos animais sem comprometer seu bem-estar.

Resumo

As células-tronco neurais tecido-específicas (NSCs) permanecem ativas no cérebro pós-natal de mamíferos. Residem em nichos especializados, onde geram novos neurônios e glia. Um desses nichos é a zona subependimária (ZEE, também chamada de zona ventricular-subventricular), que está localizada através das paredes laterais dos ventrículos laterais, adjacente à camada de células ependimárias. As células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) distribuem-se abundantemente pelo sistema nervoso central, constituindo um pool de células progenitoras proliferativas que podem gerar oligodendrócitos.

Tanto NSCs quanto OPCs exibem potencial de auto-renovação e ciclos de quiescência/ativação. Devido à sua localização, o isolamento e a investigação experimental dessas células são realizados post-mortem. Aqui, descrevemos em detalhes a "ordenha cerebral", um método para o isolamento de NSCs e OPCs, entre outras células, de animais vivos. Este é um protocolo de duas etapas projetado para uso em roedores e testado em ratos. Primeiro, as células são "liberadas" do tecido por meio da injeção intracerebroventricular (i.c.v.) estereotáxica de um "coquetel de liberação". Os principais componentes são a neuraminidase, que tem como alvo as células ependimárias e induz o desnudamento da parede ventricular, um anticorpo bloqueador da integrina-β1 e o fator de crescimento de fibroblastos-2. Em uma segunda etapa de "coleta", biópsias líquidas do líquido cefalorraquidiano são realizadas a partir da cisterna magna, em ratos anestesiados, sem a necessidade de incisão.

Os resultados aqui apresentados mostram que as células isoladas mantêm seu perfil endógeno e que as NSCs da ZEE preservam sua quiescência. O desnudamento da camada ependimária é restrito ao nível anatômico de injeção e o protocolo (liberação e coleta) é bem tolerado pelos animais. Esta nova abordagem abre caminho para a realização de estudos longitudinais de neurogênese endógena e gliogênese em animais experimentais.

Introdução

As células-tronco tecido-específicas são células parcialmente comprometidas que podem dar origem a todas as populações celulares que constituem os respectivos tecidos. Além de multipotentes, são células auto-renovadoras e cruciais para a manutenção da homeostase e da capacidade regenerativa dos^tecidos1. Algumas células-tronco tecido-específicas permanecem em um estado ativo e fortemente proliferativo, como células-tronco intestinais ou hematopoiéticas. Outras, como as células-tronco cerebrais, permanecem em grande parte quiescentes ou dormentes². No cérebro adulto, as células-tronco neurais (NSCs) podem ser encontradas em áreas especializadas, muitas vezes chamadas de nichos. Duas dessas áreas bem descritas existem na zona subependimária (ZEE) dos ventrículos laterais e no giro denteado do hipocampo. O nicho SEZ gera o maior número de células, principalmente neuroblastos que migram em direção aos bulbos olfativos e contribuem para a população local de interneurônios; em contraste, os oligodendroblastos gerados migram para o corpo caloso adjacente (CC)³. As células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) são células mitoticamente ativas, amplamente distribuídas pelo sistema nervoso central, que: i) estão comprometidas com a linhagem oligodendroglial, ii) podem migrar para sítios de desmielinização e iii) podem se diferenciar em oligodendrócitos mielinizantes. OPCs também apresentam potencial de auto-renovação e quiescência⁴.

Até agora, o isolamento e o estudo de NSCs e OPCs exigiam a dissociação post-mortem do tecido cerebral e medular dissecado. Para contornar essa limitação experimental, estabelecemos um método que permite, pela primeira vez, o isolamento de NSCs e OPCs cerebrais de animais vivos. Chamamos esse método de "ordenha", porque ele permite várias coletas de células, pois seus pools não se esgotam. O protocolo foi desenvolvido em ratos, devido ao seu grande tamanho cerebral, visando principalmente a ZEE, ou CC, e inclui duas etapas principais. Primeiro, NSCs ou OPCs são "removidos" do tecido por meio da injeção i.c.v. de um "coquetel de liberação" contendo neuraminidase, uma toxina que induz desnudamento da parede ventricular, um anticorpo bloqueador de integrina-β1 e fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2). O coquetel é injetado estereotaxicamente bilateralmente dentro dos ventrículos laterais. Se o uso pretendido for o isolamento de NSCs, áreas rostrais dos ventrículos laterais são alvo. Se o objetivo é isolar OPCs mais puramente, o coquetel é injetado caudalmente na área da fímbria hipocampal. Em uma segunda etapa de "coleta", biópsias líquidas do líquido cefalorraquidiano (LCR) são realizadas a partir da cisterna magna de ratos anestesiados, sem a necessidade de incisão. A biópsia líquida é misturada com meio de cultura NSC e pode ser mantida a 4 °C até o plaqueamento.

Protocolo

Os procedimentos de criação, manutenção e experimentação de animais foram conduzidos de acordo com o UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, autorizado pelo Ministério do Interior, e com o Decreto Presidencial 56/2013 da República Helênica, examinados pelos Órgãos de Bem-Estar Animal e Revisão Ética das Universidades de Cambridge e Patras, bem como aprovados e examinados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Prefeitura local (número do protocolo: 5675/39/18-01-2021). Foram utilizados ratos machos e fêmeas da linhagem Sprague-Dawley, Wistar e Long-Evans, com idade variando entre 2 e 4 meses e peso corporal entre 150 g e 250 g. O protocolo está resumido graficamente na Figura 1.

1. Liberar o coquetel de preparação

OBS: Prepare fresco no dia do procedimento e mantenha no gelo. As quantidades são dadas por 2 μL a serem injetados i.c.v. em cada ventrículo lateral. Prepare mais 1 μL por injeção pretendida.

1. Preparar 0,5 μL de neuraminidase 500 mU de Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
   NOTA: Conservar esta conserva em 1 U/μL diluída em água estéril a -20 °C. Outros tipos de neuraminidases não foram testados.
2. Preparar 1 μL contendo 1 μg de anticorpo bloqueador de integrina-β1.
   NOTA: Conservar a 4 °C.
3. Preparar 0,5 μL contendo 0,5 μg de fator de crescimento básico de fibroblastos (FGF-básico humano recombinante).
   NOTA: Conservar como uma reserva de 1 μg/μL diluída em água estéril a -20 °C.

2. Injeção de coquetel de liberação

NOTA: Todo o processo pode ser realizado dentro de 20 min. Tome o cuidado de realizar a cirurgia em condições assépticas. Limpe todas as superfícies com antisséptico (por exemplo, peróxido de hidrogênio a 3% ou 6%). Use ferramentas, luvas, aventais e campos autoclavados ou prontamente estéreis.

1. Anestesiar o animal experimental por inalação de isoflurano (2,5% para indução e 2% para manutenção). Confirme a profundidade da anestesia verificando o reflexo corneano, a reação aos estímulos (teste de pinça dos membros posteriores e cauda) e o modo de respiração.
   NOTA: Os procedimentos cirúrgicos podem ser realizados sob anestesia geral induzida por anestesia intraperitoneal injetável (por exemplo, cetamina [40 mg/kg] e xilazina [10 mg/kg]). A anestesia profunda foi confirmada pela verificação do reflexo corneano, da reação aos estímulos (teste de pinça dos membros posteriores e cauda) e do modo respiratório.
2. Administrar analgesia por via subcutânea (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina) na indução anestésica.
3. Monte o rato na estrutura estereotáxica.
4. Raspe o pelo da cabeça com uma navalha e limpe a pele com antisséptico, como solução de iodopovidona a 10% e, em seguida, álcool. Aplique o antisséptico três vezes usando cotonetes estéreis. Esfregue em um movimento circular por 3-5 s de cada vez. Aplique pomada ocular para evitar o ressecamento.
5. Faça uma incisão de 2 cm na pele da cabeça ao longo da linha média usando um bisturi estéril.
6. Limpe meticulosamente o crânio usando cotonetes estéreis e soro fisiológico estéril.
7. Identifique o bregma utilizando a borda da agulha de uma seringa Hamilton de 10 μL montada no dispositivo estereotáxico. Defina o bregma como "ponto 0,0".
   OBS: O bregma é identificado como o ponto de intersecção entre as suturas sagital e coronal. Mais detalhes podem ser encontrados no atlas do cérebro de ratos de Paxinos e Watson⁵.
8. Deslocar o aparelho para as coordenadas anteroposterior (AP) = 0,3 mm, lateral (L) = +1,2 mm (para atingir a ZEE) ou AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (para atingir a CC).
9. Faça um furo de rebarba de 1 mm usando uma broca dental.
   NOTA: Ao perfurar manualmente, tome cuidado para não ferir a superfície cortical. Não se espera que a hemorragia seja considerável. Limpe qualquer sangue com soro fisiológico e aplique pressão para parar o sangramento mais persistente.
10. Coloque 4 μL do cocktail de libertação na seringa Hamilton de 10 μL.
11. Abaixe a agulha (de preferência romba ou borda cônica) da seringa de Hamilton para entrar em contato com a dura-máter.
12. Inserir a agulha na profundidade desejada (D = 3,5 mm).
    NOTA: Despeje soro fisiológico na superfície da dura-máter para manter o tecido hidratado.
13. Infundir 2 μL do cocktail de libertação a uma taxa de 1 μL/min.
14. Deixe a agulha no lugar por mais 2 minutos antes da recuperação lenta para evitar o surgimento do coquetel de liberação.
15. Repita os passos 2,8-2,14 para o outro hemisfério nas coordenadas AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (para atingir a ZEE) ou AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (para atingir a CC).
16. Sutura da incisão com náilon 5-0 (diâmetro 0,1 mm) e limpeza da área suturada com antisséptico.
17. Retirar a máscara que fornece o anestésico e transferir o animal para a área de monitorização pós-operatória.
    NOTA: A recuperação da anestesia e a manutenção da decúbito devem ocorrer dentro de 5-10 min, e a recuperação completa (comportamento normal) dentro de 25 min.
    1. Monitore de perto a recuperação (movimento vívido e ininterrupto, acesso frequente à água) em um espaço bem aquecido (24-25 °C), silencioso, sem camas de partículas pequenas, que podem bloquear as vias aéreas. Devolva o animal à companhia de seus companheiros de gaiola (não a novos animais) somente após confirmar a recuperação completa.
    2. Monitorar o animal na instalação de manutenção por pelo menos 48 h após a cirurgia. Resolva os sinais de dor (ocultação da cabeça, postura anormal da cabeça ou do corpo, hipersensibilidade e hiperexcitabilidade ao manuseio) administrando analgesia (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina, por via subcutânea). Encaminhe animais com pelos descoloridos ou erguidos ao veterinário responsável.

3. Biópsia líquida do líquido cefalorraquidiano (LCR)

NOTA: Todo o processo pode ser realizado dentro de 10 min. A biópsia líquida descrita aqui é realizada 3 dias após a injeção do coquetel de liberação, mas pode ser realizada exatamente da mesma maneira sempre que necessário. Tome o cuidado de realizar a cirurgia em condições assépticas. Limpe todas as superfícies com antisséptico (por exemplo, peróxido de hidrogênio a 3% ou 6%). Use ferramentas, luvas, aventais e campos autoclavados ou prontamente estéreis.

1. Anestesiar o animal por inalação de isoflurano (2,5% para indução e 2% para manutenção). Confirme a profundidade da anestesia verificando a córnea
   reflexo, a reação aos estímulos (teste da pinça dos membros posteriores e cauda) e o modo de respiração.
   NOTA: Os procedimentos cirúrgicos podem ser realizados sob anestesia geral induzida por anestesia intraperitoneal injetável (por exemplo, cetamina [40 mg/kg] e xilazina [10 mg/kg]). No entanto, isso não é aconselhável, pois o procedimento é curto, especialmente se as biópsias forem realizadas várias vezes em dias consecutivos.
2. Administrar analgesia por via subcutânea (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina) na indução anestésica.
3. Monte o animal experimental sobre a estrutura estereotáxica. Use barras auriculares para fixar a cabeça sem obstruir o movimento rotacional em direção à frente e às costas.
4. Estabilize a cabeça em um ângulo descendente de 40° para que uma boa extensão da parte de trás do pescoço possa ser alcançada.
   Observação : uma maneira de fazer isso é usando a barra de boca do dispositivo⁶.
5. Raspe o pelo na área do pescoço usando uma navalha e limpe a pele com antisséptico, como solução de iodopovidona a 10% e, em seguida, álcool. Aplique o antisséptico três vezes usando cotonetes estéreis. Esfregue em um movimento circular por 3-5 s de cada vez.
6. Com a ponta do dedo, encontrar a área depressível em forma de losango posicionada entre a protuberância occipital e a espinha do atlas⁶.
7. Desenhe um ponto (por exemplo, usando um marcador).
8. Fixe uma seringa de 1 ml ou 0,5 ml na estrutura estereotáxica.
   OBS: É aconselhável o uso de seringas com agulhas não destacáveis, pois produzem melhor sucção e possuem menor volume morto.
9. Traga a agulha no ponto de contacto com a pele na marca pontual.
10. Com um par de pinças, levante a pele enquanto abaixa a seringa através das camadas da pele.
11. Recupere ligeiramente o êmbolo para gerar pressão negativa na seringa.
12. Reinicie para mergulhar a agulha muito lentamente até que o líquido (LCR) apareça na seringa.
13. Assente a agulha nesta posição e permita o fluxo lento do líquor.
    NOTA: A agulha pode ser abaixada ou elevada ligeiramente se o fluxo do LCR for muito lento.
14. Iniciar a remoção lenta do líquor (em passos de 40 μL/min) até 120 μL.
15. Recupere lentamente a seringa.
16. Administrar intraperitonealmente 1 mL de soro normal para apoiar a reposição de fluidos do animal experimental.
17. Misturar a biópsia líquida (LCR) com 400 μL de meio NSC e manter o tubo de microcentrífuga a 4 °C até nova utilização.
    NOTA: As biópsias líquidas devem ser processadas dentro de 3 h se não forem congeladas.
18. Retirar a máscara que fornece o anestésico e transferir o animal para a área de monitoramento pós-operatório.
    NOTA: A recuperação da anestesia e a manutenção da decúbito devem ocorrer dentro de 5-10 min, e a recuperação completa (comportamento normal) dentro de 25 min.
    1. Monitore de perto a recuperação (movimento vívido e ininterrupto, acesso frequente à água) em um espaço bem aquecido (24-25 °C), silencioso, sem camas de partículas pequenas, que podem bloquear as vias aéreas. Devolva o animal à companhia de seus companheiros de gaiola (não a novos animais) somente após a recuperação total ter sido confirmada.
    2. Monitorar o animal na instalação de manutenção por pelo menos 48 h após a cirurgia. Se forem observados sinais de dor (ocultação da cabeça, postura anormal da cabeça ou do corpo, hipersensibilidade e hiperexcitabilidade ao manuseio), administrar analgesia (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina por via subcutânea). Encaminhe animais com pelos descoloridos ou erguidos ao veterinário responsável.

4. Processamento de tecidos para imunofluorescência

1. Eutanásia do animal por infusão intracárdica de 20 mL de solução salina gelada, seguida de 50 mL de paraformaldeído a 4% gelado (PFA; em solução salina tamponada com fosfato [PBS] de pH = 7,4).
2. Dissecção do tecido cerebral.
   1. Separe a cabeça do corpo usando uma tesoura para fazer um corte na área cervical. Use a tesoura para remover a pele e, em seguida, corte o osso do crânio ao longo da linha média sagital, com as pontas da tesoura apontando para cima, a fim de não danificar o tecido cerebral. Procure continuar cortando o máximo possível, passando a linha média coronal.
   2. Use pinças para remover os ossos, começando pelos ossos supraoccipital e parietal e, finalmente, os ossos frontais.
   3. Uma vez que o tecido cerebral é revelado, use a pinça ou uma espátula para retirá-lo do crânio. Para facilitar isso, corte os nervos na base do cérebro e os bulbos olfativos, se não quiser.
3. Pós-fixar o tecido durante a noite em PFA a 2% a 4 °C.
4. Crio-proteger o tecido em sacarose a 30% (em PBS) por pelo menos 48 h a 4 °C até que o tecido afunde para o fundo.
5. Congelar o tecido a -80 °C.
6. Cortar o tecido cerebral em cortes coronais de 14 μm de espessura com um criostato.
7. Realizar coloração por imunofluorescência utilizando protocolos padronizados ^3,7
   1. Incubar os cortes com tampão de bloqueio (albumina de soro bovino a 3% [BSA], Triton X-100 a 0,1%, em PBS) por 2 h à temperatura ambiente.
   2. Realizar recuperação antigênica (fervura por 15 min em tampão citrato 10 mM, pH = 6,0, utilizando frascos de vidro).
      NOTA: Esta etapa é opcional, mas necessária para antígenos nucleares.
   3. Levar à temperatura ambiente e incubar com anticorpos primários contra proteína glial fibrilar ácida (GFAP), doublecortin (Dcx), S100β e β-catenina (ver Tabela de Materiais) em tampão de bloqueio durante a noite a 4 °C.
   4. Incubar durante 2 h com anticorpos secundários em PBS com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para contramarcação nuclear à temperatura ambiente (ver Tabela de Materiais).
   5. Monte as lamínulas.

5. Processamento de células isoladas para imunofluorescência

1. Placatear as células em placas de 96 poços compatíveis para microscopia, revestidas com poli-D-lisina (100 μg/mL).
2. Fixar as células em PFA a 2% gelado por 10 min e lavar 3x com PBS.
3. Realizar imunofluorescência usando procedimentos padrão^3,7 para PDGFRα, GFAP^, Dcx, SOX2 e ID3 (consulte a Tabela de Materiais).
4. Manter as células em PBS + NaN₃ (0,1%) a 4 °C no escuro.

6. Microscopia e análise de imagens

1. Tire imagens usando epifluorescência ou microscopia confocal e realize contagens de células usando ferramentas padrão de software de análise de imagem, como contadores de células.

Resultados

Lançamento e coleta de NSCs
As NSCs da ZEE são separadas do LCR apenas pela monocamada de células ependimárias, embora permaneçam em contato direto com o conteúdo ventricular por meio de processos monociliados intercalantes ^8,9. A neuraminidase age especificamente nas células ependimárias via clivagem de resíduos de ácido siálico e pode induzir desnudamento da parede ventricular. Isso leva ao agrupamento de neuroblastos na superfície do ventrículo^10,11. Além disso, um fluxo de neuroblastos tem sido observado no LCR após a injeção i.c.v. de um anticorpo bloqueador de integrina-β1, provavelmente devido à soltura das junções celulares inter-ependimárias¹². Essas observações levaram ao desenvolvimento de um protocolo que permite o isolamento das células-tronco e progenitoras do cérebro por meio do comprometimento controlado da integridade das paredes do ventrículo lateral. Em uma primeira etapa, a liberação do parênquima e o fluxo subsequente de NSCs ou OPCs dentro do LCR são induzidos via injeção i.c.v. do coquetel de liberação. O coquetel é injetado estereotaxicamente a uma taxa de 1 μL/min, bilateralmente (2 μL por injeção) nos ventrículos laterais (coordenadas visando NSCs SEZ: AP = 0,3 mm, L = ± 1,2 mm, D = 3,5 mm; coordenadas visando CC OPCs: AP = 1,5 mm, L = ± 2 mm, D = 3,5 mm). A segunda etapa ("coleta") envolve a realização de biópsias líquidas liquóricas da cisterna magna. Os ratos precisam ser anestesiados e a biópsia pode ser feita com seringas de 1 mL. O uso do dispositivo estereotáxico permite sucesso quase completo na recuperação de aproximadamente 100 μL de LCR, sem a necessidade de incisões. A biópsia líquida é adicionada ao meio de cultura gelado e mantida a 4 °C até o plaqueamento por <3 h (o meio de cultura NSC contém meio Eagle modificado de Dulbecco [DMEM], suplemento B27 [2%], suplemento N2 [1%], FGF2 [20 ng/mL] e fator de crescimento epidérmico [EGF; 20 ng/mL]).

Avaliação histológica da área periventricular após a injeção do coquetel de liberação
Uma primeira coorte de experimentos revelou que, ao injetar mais de 3 μL de líquido, os ventrículos poderiam ser danificados devido a lesão mecânica inespecífica (Figura 2B,C). A injeção lenta de 2 μL de coquetel de liberação levou ao surgimento de aglomerados de neuroblastos imunopositivos para Dcx na superfície ventricular. Esses agrupamentos permaneceram visíveis mesmo aos 8 meses após a injeção (Figura 2D). Como o método foi destinado a estudos longitudinais, visando o acompanhamento a longo prazo dos animais, avaliou-se o dano tecidual causado pelo coquetel de liberação. A imunomarcação foi realizada em cortes cerebrais criostato de 14 μm de espessura para marcadores de células ependimárias, como S100β e β-catenina¹³, e a integridade global da camada ependimária foi avaliada. Os locais de desnudamento da camada ependimária estavam presentes apenas próximos ao nível rostrocaudal das injeções, com declínio gradual das perturbações da camada ependimária detectadas nas áreas mais posteriores e anteriores da ZEE (Figura 2E,F) e ausentes após uma distância de ±2 mm do local da injeção. Os resultados acima mostram que o desnudamento parcial da camada ependimária causado pela injeção i.c.v. do coquetel de liberação é focal, contido na proximidade do local da injeção e deixa o restante da camada ependimária periventricular intacto.

Perfil de marcadores e comportamento in vitro de células coletadas
Posteriormente, avaliou-se o comportamento in vitro e o perfil de marcadores das células isoladas via protocolo de ordenha. O rendimento celular médio de cada biópsia líquida é de aproximadamente 300 ± 45 células (por biópsia de 100 μL)⁷. As biópsias de ordenha resultaram em culturas de NSC com uma média de 3,17 ± potencial de passagem de 0,45. Células isoladas de ratos injetados com solução salina puderam ser passadas em média 1,92 ± 0,76 vezes; em contrapartida, aqueles isolados por ordenha chegaram a nove passagens (p = 0,038, teste t) (Figura 3A)⁷. A capacidade média de passagem de culturas da neuroesfera post-mortem, derivadas de SEZ, é superior a 12 passagens em nossas mãos. Como o potencial de expansão in vivo das NSCs SEZ, como revelado por experimentos de mapeamento de destino celular in vivo ¹⁴, tem se mostrado limitado, a ordenha produz células com comportamento in vitro significativamente diferente daquele das células em culturas padrão, embora muito mais próximas do comportamento de NSCs endógenos. onde cresceram tanto como monocamadas aderentes quanto mais raramente como neuroesferas (Figura 3B). Células recém-isoladas (coletadas 3 dias após a injeção e fixadas 24 h após o plaqueamento) imunopositivas para o marcador astroglial GFAP também foram imunopositivas para ID3, um marcador de quiescência, e tinham a característica para a morfologia bipolar do NSC (Figura 3C). Além disso, como relatado anteriormente⁷, uma comparação imunocitoquímica mais detalhada de células derivadas de biópsia e de células derivadas post-mortem dos mesmos animais, aos 3 dias após a injeção (procurando astrócitos GFAP+, neuroblastos Dcx+, progenitores de oligodendrócitos PDGFRa+ e células SOX2+ da linhagem neural) mostrou que o perfil das células coletadas era semelhante ao das células SEZ endógenas (Figura 3D). Notavelmente, quando células derivadas de biópsia e tecido foram comparadas em diferentes condições (por exemplo, injeção de um coquetel de liberação com e sem FGF2), verificou-se que o fator de crescimento resultou em um aumento concomitante e significativo na presença de células SOX2+, bem como em uma diminuição significativa na presença de neuroblastos Dcx+ em ambas as amostras (Figura 3D). Esses dados confirmaram que quaisquer mudanças que aparecem no perfil das populações endógenas de NSCs são espelhadas em amostras de células geradas pela ordenha.

Figura 1: Resumo gráfico da ordenha. Seção coronal de um hemisfério cerebral com os principais marcos anatômicos (ventrículo lateral, corpo caloso sobrejacente e comissura anterior abaixo [tratos da substância branca em cinza] e zona subependimária nas paredes laterais [em azul]). O coquetel de liberação é injetado no ventrículo lateral, levando ao comprometimento da integridade do tecido e à liberação de células-tronco neurais cerebrais pós-natais no líquido cefalorraquidiano, das quais podem ser coletadas por meio de biópsias líquidas. Abreviaturas: SEZ = zona subependimária; VE = ventrículo lateral; LCR = líquido cefalorraquidiano; pbNSCs = células-tronco neurais cerebrais pós-natais; β1-int = integrina beta1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Avaliação histológica dos efeitos das injeções i.c.v. (A-D) Imagens de baixa magnificação da metade dorsal do ventrículo lateral após imunomarcação para Dcx (em vermelho, para marcar neuroblastos). (A) A simples inserção i.c.v. de uma seringa de Hamilton não perturba a citoarquitetura da ZEE, enquanto a injeção i.c.v. de 10 mL (taxa de infusão de 1 mL/min) leva a danos graves da parede ventricular, independentemente de seu conteúdo. (B) soro fisiológico e (C) coquetel de lançamento. (D) A injeção de 2 μL do coquetel de liberação leva a um comprometimento controlado da parede ventricular, observado mesmo aos 8 meses de pós-operatório. Detalhes de maior ampliação da parede da ZEE aos 7 e 14 dias após a injeção são mostrados em (E) e (F), respectivamente. Há uma estrutura desorganizada, com neuroblastos Dcx+ (em verde) descansando na superfície da parede e as outras células do nicho (Sox2+, em branco) descansando mais profundamente. O tecido periventricular é danificado no nível rostrocaudal da injeção no momento de 2 meses (em G), enquanto o tecido está intacto em um nível mais caudal (em H) no mesmo animal. A parede ventricular é avaliada por imunomarcação para os marcadores ependimários S100β e β-catenina. Detalhe da arquitetura típica da parede é mostrado em (I). A coloração nuclear é realizada usando DAPI (mostrado em azul). Barras de escala = 300 μm (A-C,G,H, inserções), 150 μm (D), 30 μm (E,F) e 50 μm (I). Esse número é modificado de McClenahan et ^al.13. Abreviaturas: SEZ = zona subependimária; i.c.v = intracerebroventricular; DCX = doublecortin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Avaliação das células isoladas via ordenha. (A) Gráfico mostrando o número máximo de passagens obtidas por amostra de biópsia líquida de animais injetados com soro fisiológico (barras cinzas, total de 12 amostras), ou após ordenha (barras pretas, total de 29 amostras, coquetel de liberação com neuraminidase e anticorpo bloqueador de integrina-β1). (B) Imagem representativa de microscopia confocal de células primárias obtidas por ordenha, aos 3 dias após a injeção, imunomarcadas contra GFAP e ID3. (C,D) Imagens de campo claro de células isoladas 3 dias após a injeção, plaqueadas em poços revestidos com poli-D-lisina e deixadas crescer em meio de proliferação NSC por 7 dias. (E) Gráfico mostrando o perfil celular-tipo das células isoladas via ordenha da ZEE e da população endógena de NSCs da SEZ dos mesmos animais experimentais. As frações SOX2+ e Dcx+ aumentaram e diminuíram significativamente, respectivamente, após a co-injeção de FGF2. (Análise ANOVA one-way por marcador, seguida de análise post hoc; n = 4-6 animais por grupo experimental.) Barras de escala = 100 μm (C,D) e 10 μm (B). Esse número é modificado de McClenahan et ^al.13. Abreviaturas: SEZ = zona subependimária; IPS = dias pós-injeção; NSC = células-tronco neurais; DCX = doublecortin; GFAP = proteína glial fibrilar ácida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

As células-tronco e progenitoras são relativamente esparsas no tecido cerebral de mamíferos. Além disso, os NSCs estão localizados em áreas inacessíveis para biópsias fáceis e seguras (paredes ventriculares, hipocampo). Portanto, a única maneira de trabalhar experimentalmente com essas células, até agora, tem sido seu isolamento post-mortem. Um método que permite a coleta única ou repetida de NSCs e OPCs de ratos vivos, denominado ordenha, é descrito passo a passo. O método baseia-se em duas características principais: i) NSCs ou OPCs são separados pela monocamada de células ependimárias do LCR, fluindo dentro do sistema ventricular do cérebro; ii) células ependimárias e progenitores neurais mantêm contato entre si e com outros tipos celulares vizinhos via integrinas. Portanto, o coquetel de liberação injetado em áreas específicas dos ventrículos para permitir o desengajamento de NSCs, ou OPCs, do parênquima cerebral contém neuraminidase, uma toxina que visa e mata especificamente as células ependimárias^10,11, e um anticorpo bloqueador de integrina-β1. Também contém FGF2, pois esse fator de crescimento é essencial para a sobrevivência e manutenção dos NSCs no nicho e na cultura^15,16. Já^{foi demonstrado 7} que este protocolo é bem tolerado pelos animais; neste relato, confirma-se ainda que o dano às células ependimárias, induzido pelo coquetel de liberação como pré-requisito para a liberação de NSCs/OPCs no LCR, é limitado em torno do nível rostrocaudal da injeção. Isso tem sido de fundamental importância, uma vez que o protocolo deve preservar a função homeostática do cérebro, incluindo o próprio nicho de células-tronco, e não deve comprometer o bem-estar a longo prazo dos animais. A injeção estereotáxica do coquetel de liberação é de gravidade leve e nunca resultou em morte. Além disso, a realização de biópsias líquidas da cisterna magna é um procedimento rápido e minimamente invasivo, que pode ser repetido várias vezes consecutivas.

É importante ressaltar que as amostras de NSC isoladas via ordenha refletem de perto o pool endógeno de NSCs. O perfil dos progenitores SEZ pode ser influenciado pela injeção i.c.v. de FGF2. Quando isso acontece, o perfil das células derivadas da ordenha é afetado da mesma forma. Além disso, trabalhos experimentais anteriores indicaram que NSCs isolados via ordenha da SEZ têm potencial de autorrenovação limitado, um comportamento semelhante ao de NSCs endógenos revelado com estratégias in vivo, transgênicas e de destino celular^14,17. Os NSCs cerebrais pós-natais são retidos em quiescência, raramente transitando em direção à ativação mitótica para gerar progênie neurogênica e gliogênica^18,19,20. Aqui, são fornecidas evidências de que a fração de células derivadas da ordenha que expressam GFAP e espera-se que inclua NSCs de boa-fé co-expressam ID3, um marcador de NSCs quiescentes²¹. A presença enriquecida de NSCs quiescentes, que são então plaqueados no meio NSC tipicamente usado para a cultura de NSCs isolados post-mortem, parece limitar o potencial de expansão dos NSCs coletados (por exemplo, um processo crucial se as células fossem usadas para transplantes autólogos). Isso ocorre porque esses meios são projetados especificamente para a sobrevivência e expansão mitótica de NSCs ativados; assim, a geração de protocolos que possibilitem a ativação mitótica eficiente e rápida de NSCs quiescentes aumentará o valor e a abrangência do uso da ordenha.

No geral, esses dados indicam que a ordenha permite a amostragem de NSCs e OPCs cerebrais pós-natais (dependendo do nível rostrocaudal de injeção do coquetel de liberação) de ratos vivos. Este trabalho indica a viabilidade da realização de sucessivas biópsias líquidas em um mesmo animal, mesmo em tempos significativos após a injeção do coquetel de liberação (assim, planejar e realizar estudos experimentais longitudinais), uma vez que os neuroblastos permanecem agrupados nas paredes ventriculares mesmo aos 8 meses após a injeção. Tais métodos são de fundamental importância, pois permitem a investigação de eventos dentro de animais individuais resultando em redução do ruído biológico gerado pela variação fisiológica. Isso, por sua vez, leva a uma maior precisão e à implementação dos princípios dos "3Rs" (substituição, redução e refinamento). Passos futuros fundamentais para o aprimoramento do método serão a determinação do número máximo e do prazo em que biópsias líquidas podem ser realizadas após um procedimento de liberação, embora a realização de procedimentos adicionais de liberação deva ser viável, se necessário.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
lançamento forte
β Anticorpo bloqueador de 1-integrina	BD Biosciences	#555002	purificado NA/LE Hamster Anti-Rato CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Qualquer abntibody com atividade de bloqueio deve ser apropriado.
Neuraminidase de Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases de outras fontes (por exemplo, de Vibrio cholerae) não foram testadas.
FGF-básico humano recombinante (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	mantido como 1 μ g/μ L estoque, diluído em água estéril a -20 &graus; C
Procedimentos cirúrgicos
10 µ L Seringa	Hamilton	#80330	Modelo 701 RN, Agulha Pequena Removível, calibre 26s, 2 pol., estilo de ponta 2
BD Seringas de insulina Micro-finas de 1 mL	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT. SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU:
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenofina 0,3 mg/mL)
Digital Novo Padrão Estereotáxico, Ratos e Ratos	Sistema de Monitoramento	51500D
	Aparelho Harvard	55-7020
ISOFLURINA 1.000 mg/g vapor de inalação, líquido	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU:	Cetamina 100 mg/mL
Sutura de nylon, Ethilon	Ethicon	D9635	Transparente, tamanho 5-0
Aparadores cirúrgicos sem fio recarregáveis	de armazenamento	: 51472
Lâminas de bisturi, estéreis	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  Cotonetes de 8 polegadas	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Broca Estereotáxica de Alta Velocidade	Foredom	1474w/o1464
Stoelting' s Kit de Instrumentos Estereotáxicos	Item de armazenamento	: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xilazina, 25 mL
Manuseio e imunocoloração de tecidos e células poços >
apropriadas para microscopia	Greiner	#655866	Suplemento
	de microplaca estrela de tela B27ThermoFisher Scientific	A1486701
Albumina de soro bovino (BSA)	Merck	P06-1391100	Fração V, choque térmico
Citrato	Merck	71497	Citrato de sódio monobásico
Criostato	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Coloração nuclear, Diluição: 1/1.000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	Alto teor de glicose, piruvato
de burro anti-cabra	Biotium	20016 ou 20106 ou 20048	Diluição: 1/1.000
burro anti-rato	Biotium	20014 ou 20105 ou 20046	Diluição: 1/1.000
burro anti-coelho	Biotium	20015 ou 20098 ou 20047	Diluição: 1/1.000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (ou bFGF)	Peprotech	100-18B
cabra anti-GFAP	Abcam ab53554	Diluição: 1/500
cabra anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Diluição: 1/200
camundongo anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Diluição: 1/200
camundongo anti-S100β	Sigma	S2532	Diluição: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Meio de montagem
suplemento N2	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1,0 mg / mL
de coelho anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Diluição: 1/500
coelho anti-PDGFR&alfa;	Abcam	ab51875	Diluição: 1/200
coelho anti-β- catenina	Abcam	ab16051	Diluição: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopia e análise de imagem
Microscópio confocal	Leica	SP6 e SP8
Análise de imagem	NIH, EUA	Análise de imagem ImageJ
	Leica	LasX