Um método para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras de oligodendrócitos do cérebro de ratos vivos é apresentado aqui em detalhes experimentais. Permite múltiplas coletas dessas células dos mesmos animais sem comprometer seu bem-estar.
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Artigo de método
Método "Brain Milking" para o Isolamento de Células-Tronco Neurais e Células Progenitoras de Oligodendrócitos de Ratos Vivos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco neurais tecido-específicas (NSCs) permanecem ativas no cérebro pós-natal de mamíferos. Residem em nichos especializados, onde geram novos neurônios e glia. Um desses nichos é a zona subependimária (ZEE, também chamada de zona ventricular-subventricular), que está localizada através das paredes laterais dos ventrículos laterais, adjacente à camada de células ependimárias. As células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) distribuem-se abundantemente pelo sistema nervoso central, constituindo um pool de células progenitoras proliferativas que podem gerar oligodendrócitos.
Tanto NSCs quanto OPCs exibem potencial de auto-renovação e ciclos de quiescência/ativação. Devido à sua localização, o isolamento e a investigação experimental dessas células são realizados post-mortem. Aqui, descrevemos em detalhes a "ordenha cerebral", um método para o isolamento de NSCs e OPCs, entre outras células, de animais vivos. Este é um protocolo de duas etapas projetado para uso em roedores e testado em ratos. Primeiro, as células são "liberadas" do tecido por meio da injeção intracerebroventricular (i.c.v.) estereotáxica de um "coquetel de liberação". Os principais componentes são a neuraminidase, que tem como alvo as células ependimárias e induz o desnudamento da parede ventricular, um anticorpo bloqueador da integrina-β1 e o fator de crescimento de fibroblastos-2. Em uma segunda etapa de "coleta", biópsias líquidas do líquido cefalorraquidiano são realizadas a partir da cisterna magna, em ratos anestesiados, sem a necessidade de incisão.
Os resultados aqui apresentados mostram que as células isoladas mantêm seu perfil endógeno e que as NSCs da ZEE preservam sua quiescência. O desnudamento da camada ependimária é restrito ao nível anatômico de injeção e o protocolo (liberação e coleta) é bem tolerado pelos animais. Esta nova abordagem abre caminho para a realização de estudos longitudinais de neurogênese endógena e gliogênese em animais experimentais.
Introdução
As células-tronco tecido-específicas são células parcialmente comprometidas que podem dar origem a todas as populações celulares que constituem os respectivos tecidos. Além de multipotentes, são células auto-renovadoras e cruciais para a manutenção da homeostase e da capacidade regenerativa dostecidos1. Algumas células-tronco tecido-específicas permanecem em um estado ativo e fortemente proliferativo, como células-tronco intestinais ou hematopoiéticas. Outras, como as células-tronco cerebrais, permanecem em grande parte quiescentes ou dormentes2. No cérebro adulto, as células-tronco neurais (NSCs) podem ser encontradas e....
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Protocolo
Os procedimentos de criação, manutenção e experimentação de animais foram conduzidos de acordo com o UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, autorizado pelo Ministério do Interior, e com o Decreto Presidencial 56/2013 da República Helênica, examinados pelos Órgãos de Bem-Estar Animal e Revisão Ética das Universidades de Cambridge e Patras, bem como aprovados e examinados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Prefeitura local (número do protocolo: 5675/39/18-01-2021). Foram utilizados ratos machos e fêmeas da linhagem Sprague-Dawley, Wistar e Long-Evans, com idade variando entre 2 e 4 meses e peso corporal entre 150 g e 250 g. O protocolo está resumido graf....
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Resultados
Lançamento e coleta de NSCs
As NSCs da ZEE são separadas do LCR apenas pela monocamada de células ependimárias, embora permaneçam em contato direto com o conteúdo ventricular por meio de processos monociliados intercalantes 8,9. A neuraminidase age especificamente nas células ependimárias via clivagem de resíduos de ácido siálico e pode induzir desnudamento da parede ventricular. Isso leva ao agrupamento de neuroblastos na su.......
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Discussão
As células-tronco e progenitoras são relativamente esparsas no tecido cerebral de mamíferos. Além disso, os NSCs estão localizados em áreas inacessíveis para biópsias fáceis e seguras (paredes ventriculares, hipocampo). Portanto, a única maneira de trabalhar experimentalmente com essas células, até agora, tem sido seu isolamento post-mortem. Um método que permite a coleta única ou repetida de NSCs e OPCs de ratos vivos, denominado ordenha, é descrito passo a passo. O método baseia-se em duas características principais: i.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa Action Medical Research (UK) (GN2291) para R.J.M.F. e I.K. O trabalho de pesquisa também foi parcialmente apoiado (custos de animais e apoio à D.D.) pela Fundação Helênica para Pesquisa e Inovação (H.F.R.I.) no âmbito da "Primeira Chamada para Projetos de Pesquisa H.F.R.I. para apoiar membros do corpo docente e pesquisadores e a aquisição de bolsa de equipamentos de pesquisa de alto custo" (Número do Projeto: 3395).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| lançamento forte | |||
| β Anticorpo bloqueador de 1-integrina | BD Biosciences | #555002 | purificado NA/LE Hamster Anti-Rato CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Qualquer abntibody com atividade de bloqueio deve ser apropriado. |
| Neuraminidase de Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases de outras fontes (por exemplo, de Vibrio cholerae) não foram testadas. |
| FGF-básico humano recombinante (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | mantido como 1 μ g/μ L estoque, diluído em água estéril a -20 &graus; C |
| Procedimentos cirúrgicos | |||
| 10 µ L Seringa | Hamilton | #80330 | Modelo 701 RN, Agulha Pequena Removível, calibre 26s, 2 pol., estilo de ponta 2 |
| BD Seringas de insulina Micro-finas de 1 mL | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT. SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenofina 0,3 mg/mL) |
| Digital Novo Padrão Estereotáxico, Ratos e Ratos | Sistema de Monitoramento | 51500D | |
| Aparelho Harvard | 55-7020 | ||
| ISOFLURINA 1.000 mg/g vapor de inalação, líquido | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: | Cetamina 100 mg/mL |
| Sutura de nylon, Ethilon | Ethicon | D9635 | Transparente, tamanho 5-0 |
| Aparadores cirúrgicos sem fio recarregáveis | de armazenamento | : 51472 | |
| Lâminas de bisturi, estéreis | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. Cotonetes de 8 polegadas | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Broca Estereotáxica de Alta Velocidade | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting' s Kit de Instrumentos Estereotáxicos | Item de armazenamento | : 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xilazina, 25 mL |
| Manuseio e imunocoloração de tecidos e células poços > | |||
| apropriadas para microscopia | Greiner | #655866 | Suplemento |
| de microplaca estrela de tela B27ThermoFisher Scientific | A1486701 | ||
| Albumina de soro bovino (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fração V, choque térmico |
| Citrato | Merck | 71497 | Citrato de sódio monobásico |
| Criostato | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Coloração nuclear, Diluição: 1/1.000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | Alto teor de glicose, piruvato |
| de burro anti-cabra | Biotium | 20016 ou 20106 ou 20048 | Diluição: 1/1.000 |
| burro anti-rato | Biotium | 20014 ou 20105 ou 20046 | Diluição: 1/1.000 |
| burro anti-coelho | Biotium | 20015 ou 20098 ou 20047 | Diluição: 1/1.000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (ou bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| cabra anti-GFAP | Abcam ab53554 | Diluição: 1/500 | |
| cabra anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Diluição: 1/200 |
| camundongo anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Diluição: 1/200 |
| camundongo anti-S100β | Sigma | S2532 | Diluição: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Meio de montagem |
| suplemento N2 | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1,0 mg / mL |
| de coelho anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Diluição: 1/500 |
| coelho anti-PDGFR&alfa; | Abcam | ab51875 | Diluição: 1/200 |
| coelho anti-β- catenina | Abcam | ab16051 | Diluição: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopia e análise de imagem | |||
| Microscópio confocal | Leica | SP6 e SP8 | |
| Análise de imagem | NIH, EUA | Análise de imagem ImageJ | |
| Leica | LasX |
Referências
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal....
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Reimpressões e permissões
