Aqui, uma abordagem simples e rápida para a realização de injeções intracerebroventriculares em camundongos usando uma abordagem à mão livre (ou seja, sem um dispositivo estereotáxico) é descrita.
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Artigo de método
Injeções intracerebroventriculares à mão livre em camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A investigação de sistemas neuroendócrinos muitas vezes requer a entrega de drogas, vírus ou outros agentes experimentais diretamente no cérebro de camundongos. Uma injeção intracerebroventricular (ICV) permite a entrega generalizada do agente experimental em todo o cérebro (particularmente nas estruturas próximas aos ventrículos). Aqui, métodos para fazer injeções de ICV à mão livre em camundongos adultos são descritos. Usando pontos de referência visuais e táteis nas cabeças de camundongos, as injeções nos ventrículos laterais podem ser feitas de forma rápida e confiável. As injeções são feitas com uma seringa de vidro mantida na mão do experimentador e colocada a distâncias aproximadas dos pontos de referência. Assim, esta técnica não requer um quadro estereotáxico. Além disso, essa técnica requer apenas uma breve anestesia com isoflurano, o que permite a avaliação subsequente do comportamento e/ou fisiologia de camundongos em camundongos acordados e com comportamento livre. A injeção de ICV à mão livre é uma ferramenta poderosa para a entrega eficiente de agentes experimentais no cérebro de camundongos vivos e pode ser combinada com outras técnicas, como amostragem frequente de sangue, manipulação de circuitos neurais ou gravação in vivo para investigar processos neuroendócrinos.
Introdução
A entrega de agentes experimentais, como drogas1, vírus2 ou células3, ao cérebro é muitas vezes necessária para a pesquisa neuroendócrina. Se o agente não atravessar prontamente a barreira hematoencefálica ou o objetivo experimental for testar especificamente os efeitos centrais do agente, é importante ter um método confiável para administrar injeções no cérebro. Além disso, a injeção no espaço intracerebroventricular (ICV) oferece a oportunidade de distribuir amplamente o agente no cérebro e fornece uma grande área alvo, aumentando assim a probabilidade de injeção bem-sucedida2.
Um método comum para fazer injeções de ICV envolve a colocação de uma cânula de permanência permanente. Nesta abordagem, uma estrutura estereotáxica é necessária para posicionar a cânula comercialmente disponível ou feita sob medida, pois a cânula é colada ou cimentada no lugar. Muitas vezes, após a recuperação, uma dose suprafisiológica de angiotensina II é administrada através da cânula e, se o comportamento de beber for imediatamente observado, a cânula é considerada corretamente colocada4. Esta abordagem tem muitas vantagens, incluindo a capacidade de realizar infusão a longo prazo e a capacidade de injetar o mesmo animal várias vezes; além disso, se a angiotensina II for empregada, o posicionamento correto pode ser confirmado antes da administração de compostos experimentais. No entanto, existem algumas limitações para a colocação de uma cânula permanente, incluindo a necessidade de equipamentos caros (estrutura estereotáxica), a possibilidade de danos à cânula após a colocação (por exemplo, ratos podem mastigar a cânula de um companheiro de gaiola) e a possibilidade de infecções ao redor da cânula permanente. Injeções únicas de VCI podem ser feitas com o uso de um quadro estereotáxico3, que, embora eficaz, requer exposição substancial à anestesia e, portanto, pode obscurecer alguns efeitos fisiológicos e comportamentais agudos do tratamento. Além disso, a colocação de camundongos em um quadro estereotáxico requer treinamento substancial para alcançar uma colocação estável e evitar o rompimento dos canais auditivos.
Aqui, um método estabelecido para fazer injeções à mão livre em camundongos é descrito. Esse método é baseado em relatos anteriores 5,6. As vantagens dessa técnica são que ela é simples, rápida e não requer equipamentos especializados, como uma armação estereotáxica. Como descrito a seguir, esse procedimento envolve a manipulação de uma seringa de vidro em relação a pontos na cabeça do camundongo para fazer as injeções, o que pode ser feito rapidamente e, portanto, requer apenas alguns minutos de anestesia gasosa no dia do experimento.
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Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Colorado State University (#3960) e da University of California San Diego, onde os dados representativos foram coletados (S13235, PI Kellie Breen Church). Os dados de cinco camundongos adultos fêmeas e dois machos adultos C57/BL6 (9-16 semanas de idade) são mostrados na seção de dados representativos. Camundongos fêmeas foram ovariectomizados 3-4 semanas antes da injeção de ICV e coleta de sangue, como descrito anteriormente7. Antes da experimentação, esses camundongos foram alojados com um ciclo de luz de 12 h / 12 h de luz escura e tiveram livre acesso a ração e água de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Realização de craniotomia
NOTA: A craniotomia pode ser realizada um ou mais dias antes da injeção real, o que torna o processo de injeção mais rápido no dia do experimento.
- Preparar os materiais para a craniotomia conforme descrito abaixo.
- Coloque uma almofada de bancada limpa ou material de drape na superfície de trabalho. Colar o cone nasal de um vaporizador de isoflurano na superfície de trabalho (próximo, mas virado para longe, do experimentador; ver Figura 1A).
- Coloque a tubulação de silicone na extremidade de uma agulha estéril afiada de 18 G de modo que ~1 mm da ponta da agulha se projete. Coloque a tubulação de silastic na extremidade de uma agulha romba estéril de modo que ~1 mm da ponta da agulha se projete.
NOTA: Agulhas pré-embaladas separadas e estéreis (afiadas e rombas) devem ser usadas para cada mouse. - Reúna um barbeador elétrico, esfoliante de iodo, gaze estéril e almofadas de álcool para preparar o local de injeção.
- Pratique a movimentação de uma agulha 2 mm lateral e 1 mm caudal conforme descrito abaixo.
- Use uma régua e uma caneta para marcar uma folha de papel com um ponto de partida (este será bregma), uma marca de 2 mm à esquerda ou à direita e outra marca 1 mm acima da última (este será o local de injeção; ver Figura 1B).
- Pratique mover a agulha do ponto de partida para marcar o ponto 1 para marcar o ponto 2 (bregma para o local da injeção) até ter certeza de que o movimento é repetível sem guias.
NOTA: As coordenadas descritas aqui são eficazes em camundongos adultos C57/BL6, mas outras cepas ou grupos etários podem exigir ajuste.
- Prepare o mouse para craniotomia conforme descrito abaixo.
- Coloque o camundongo em uma câmara de indução e anestesiar o camundongo com isoflurano a 3%-4% em oxigênio de grau médico. Com prática e familiaridade com o procedimento, reduzir o tempo total de exposição ao isoflurano para menos de 10 min para o procedimento de craniotomia.
CUIDADO: A exposição ao isoflurano é perigosa para a saúde humana; Use um vaporizador de isoflurano aprovado e inspecionado em uma área bem ventilada com meios de remoção de gases residuais. - Quando o reflexo do dedo estiver ausente, raspe a cabeça do animal. Aplique lubrificante ocular.
- Coloque o mouse na superfície de trabalho com a cabeça no cone do nariz para manter a anestesia.
- Administrar um agente analgésico, como a buprenorfina (0,6-0,8 mg/kg de peso corporal de camundongo, por via subcutânea), conforme orientação do fornecedor.
- Limpe o local de injeção limpando a cabeça com gaze estéril mergulhada em uma solução de iodo (execute três esfoliações) e, em seguida, limpe com uma compressa de álcool (execute três vezes).
NOTA: Remova o pelo e limpe a pele ao redor do local da injeção e use instrumentos e agulhas estéreis, conforme recomendado pela Associação Médica Veterinária Americana para prevenir infecções.
- Coloque o camundongo em uma câmara de indução e anestesiar o camundongo com isoflurano a 3%-4% em oxigênio de grau médico. Com prática e familiaridade com o procedimento, reduzir o tempo total de exposição ao isoflurano para menos de 10 min para o procedimento de craniotomia.
- Segure firmemente a cabeça do mouse com a mão não dominante. Posicione a cabeça o mais plana possível na superfície de trabalho.
- Localize o local da injeção.
- Use a agulha afiada preparada 18 G para identificar primeiro o bregma; Para isso, arraste a agulha pela pele da cabeça ao longo da linha média, movendo-se no plano rostral-caudal. Imagine um triângulo equilátero em que os dois vértices são os olhos e o terceiro vértice é a localização aproximada do bregma (ver Figura 1C).
- A partir do bregma, mover a agulha 2 mm lateral e 1 mm caudal até o local da injeção.
- Ao segurar a agulha verticalmente, empurre firmemente a agulha através da pele e do osso até que a tubulação esteja nivelada com a pele.
- Retraia a agulha, gire a agulha e pressione a pele e o osso novamente. Repita o processo até que um pequeno orifício seja criado no osso.
- Use a agulha romba para verificar se um orifício suficiente foi produzido no osso. Procure fazer uma abertura no osso grande o suficiente para a agulha romba passar.
- Retire o rato do cone do nariz, limpe qualquer sangue do local de injeção com gaze estéril e coloque o rato numa gaiola num aquecedor de gaiola até ficar acordado. Como a abertura feita pela craniotomia é pequena (agulha 18G), o local não precisa ser fechado com sutura ou clipes da ferida.
NOTA: A abertura produzida aqui é pequena (18 G), por isso muitas instituições consideram este procedimento uma injeção em oposição a uma cirurgia. Além disso, embora seja feita uma abertura através da pele e dos ossos para o cérebro, segurar a pele tensa resulta no não alinhamento dos orifícios, o que provavelmente ajuda a evitar que a flora da pele ou a cama da gaiola entrem em contato com o cérebro.
2. Fazer a injeção
- Prepare os materiais para a injeção conforme descrito abaixo.
- Coloque uma almofada de bancada limpa ou material de drape na superfície de trabalho. Colar o cone nasal de um vaporizador de isoflurano na superfície de trabalho (próximo, mas virado para longe, do experimentador; ver Figura 1A).
- Ligue uma agulha de 27 G de 10 mm de comprimento com um bisel de 45° a uma seringa de vidro de 5 μL. Colocar tubos de silicone na agulha de modo que 3,5 mm da ponta da agulha se projetem; usar fita adesiva de laboratório para prender a tubulação ao corpo da seringa (ver Figura 1D).
- Prepare o meio de injeção (medicamento, vírus ou outro líquido injetável) em um tubo. Para os resultados representativos deste estudo, foi injetada solução salina isotônica estéril.
NOTA: Selecione um tubo que permita o acesso pela seringa de vidro e agulha, como um tubo de microcentrífuga de 2 mL. - Introduzir 3 μL de meio de injeção na seringa de vidro. Primeiro, retire mais do que o volume desejado e ejete até que 3 μL permaneçam na seringa.
- Reúna esfoliação de iodo, gaze estéril e almofadas de álcool para preparar o local de injeção.
- Inicie um temporizador de laboratório no modo de contagem regressiva e coloque o temporizador de modo a que fique visível para o experimentador durante as injeções.
- Pratique a movimentação de uma agulha 2 mm lateral e 1 mm caudal como realizado no dia anterior.
- Prepare o rato para injeção conforme descrito abaixo.
- Coloque o rato na câmara de indução e anestesiar o rato com isoflurano. Quando o reflexo do dedo estiver ausente, aplique lubrificante ocular e coloque o mouse na superfície de trabalho com a cabeça no cone do nariz.
- Limpe o local de injeção com três toalhetes cada de iodo e álcool. Identifique o local de injeção com uma agulha 18 G (ou agulha embotada), conforme descrito no passo 1.8. O orifício criado durante a craniotomia deve ser detectável.
NOTA: Se a craniotomia não tiver sido realizada com antecedência, ou se o orifício no crânio não for detectável, a craniotomia pode ser realizada aqui.
- Efetue a injeção com uma seringa de vidro conforme descrito abaixo.
- Segure firmemente a cabeça do mouse com a mão não dominante. Posicione a cabeça o mais plana possível na superfície de trabalho.
- Coloque a agulha da seringa de vidro através do orifício no crânio até que o tubo colocado sobre a agulha preparado no passo 2.1.2 repousa sobre a pele do rato.
- Segure a seringa o mais verticalmente possível, prestando atenção aos planos coronal e sagital. Injete lentamente o meio durante um período de 1 min.
- Segure a seringa e a agulha no lugar por mais um minuto após a conclusão da injeção para minimizar o refluxo. Retraia lentamente a agulha da cabeça do rato.
- Retire o rato do cone do nariz, limpe qualquer sangue do local de injeção com gaze estéril (se houver alguma) e coloque o rato numa gaiola num aquecedor de gaiola até estar acordado.
3. Confirmação do local de injeção
- Anestesiar profundamente e perfundir o camundongo com solução salina e paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS), conforme descrito anteriormente8. Armazenar o cérebro em sacarose a 30% em PBS a 4 °C até que o cérebro afunde (normalmente 2 dias).
- Cortar cortes coronais de 20-50 μm em criostato como descrito anteriormente9. Durante a secção, observe o trato de injeção no bloco de tecido. Registre se a via de injeção cruza claramente o ventrículo lateral.
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Resultados
Quando realizada com sucesso, essa técnica permite a rápida liberação de um agente experimental no sistema ventricular. Um perfil de pulso do hormônio luteinizante (LH) de uma camundongo ovariectomizada que recebeu uma injeção ICV de 3 μL de solução salina isotônica estéril, o veículo para muitos compostos farmacológicos, é mostrado na Figura 2A. Este exemplo demonstra que a breve exposição à anestesia gasosa e a injeção isolada de 3 μL de líquido no sistema ventricular não alteraram a secre...
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Discussão
Aqui, um meio simples e eficaz para fazer injeções de ICV em camundongos é descrito. Uma vez que esta técnica não requer uma estrutura estereotáxica, esta abordagem para a entrega central de drogas e agentes experimentais é acessível a mais pesquisadores. Além disso, essa abordagem é relativamente alta, uma vez que o procedimento de preparação e injeção pode ser realizado rapidamente.
Como esse procedimento requer a manipulação manual de agulhas e seringas de vidro utilizando distâncias aproxi...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer à Dra. Kellie Breen Church, ao Sr. Michael Kreisman e à Sra. Jessica Jang por suas contribuições para a coleta dos dados mostrados nos resultados representativos. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulhas rombas de calibre 18 | SAI Infusion | B18-150 | |
| Agulhas de calibre 18 | Medical | 305195 | |
| Almofadas de álcool | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Almofada de bancada | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Solução de betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorfina | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Substância controlada |
| Eyelube | Seringa de vidro Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Agulha de injeção | Hamilton | 7634-01 Hamilton 7803-01 | 27 gauge, agulha RN de cubo pequeno, estilo de ponta: 4, Comprimento da agulha: 10cm, Ângulo: 45 |
| Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | ||
| Vaporizador de isoflurano | Vet Equip | V-10 | |
| Fita de laboratório | VWR | 89098-128 | |
| Oxigênio de grau médico | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldeído | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Fosfato Tampolado Salino | Fisher Scientific | J67802. Software K2 | |
| PulsaR | Código aberto, Universidade de Otago | Veja ref 9 | |
| Régua | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Tubulação Silastic (0.040" I.D.) | Tubulação de DOW | 508-005 | |
| Silastic (0,078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Solução salina estéril | VWR | 101320-574 | |
| Sacarose | Fisher Scientific | S5-500 |
Referências
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- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725(2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
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- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939(2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
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Reimpressões e permissões
