Summary
このプロトコルは、神経(免疫)学研究のために、胚17日目のマウス脳から中枢神経系細胞培養を生成するユニークな方法を提示します。このモデルは、RT-qPCR、顕微鏡、ELISA、フローサイトメトリーなど、さまざまな実験手法を使用して分析できます。
Abstract
中枢神経系(CNS)のモデルは、 in vivoで 見られる相互接続された細胞の複雑なネットワークを再現する必要があります。CNSは、主にニューロン、星状細胞、希突起膠細胞、およびミクログリアで構成されています。動物の使用を置き換え、削減するための努力が高まっているため、CNS感染症および病状の治療法の開発を可能にする、生来の細胞特性を探索するために、さまざまな in vitro 細胞培養システムが開発されています。特定の研究課題は、(誘導された)多能性幹細胞などのヒトベースの細胞培養システムによって対処できますが、ヒト細胞を扱う作業には、可用性、コスト、および倫理に関して独自の制限があります。ここでは、マウスの胚性脳から細胞を単離および培養するための独自のプロトコルについて説明します。得られた混合神経細胞培養物は、 in vivoで脳に見られるいくつかの細胞集団および相互作用を模倣する。現在の同等の方法と比較して、このプロトコルは脳の特性をより厳密に模倣し、より多くの細胞を獲得するため、1匹の妊娠中のマウスからより多くの実験条件を調査できます。さらに、プロトコルは比較的簡単で再現性が高いです。これらの培養物は、96ウェルベースのハイスループットスクリーン、24ウェル顕微鏡分析、フローサイトメトリーおよび逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)分析用の6ウェル培養など、さまざまなスケールでの使用に最適化されています。この培養法は、 in vitro 法の利便性を備えたCNSの複雑さの文脈の中で感染と免疫を調査するための強力なツールです。
Introduction
中枢神経系(CNS)の理解を深めることは、多くの神経炎症性疾患および神経変性疾患の治療選択肢を改善するために重要です。CNSは、脳、脊髄、および視神経内の相互接続された細胞の複雑なネットワークであり、ニューロン、希突起膠細胞、星状細胞、およびそれらの自然免疫細胞であるミクログリア1で構成されています。in vitroアプローチは、多くの場合、有意義な研究を行うために必要なマウスの数を大幅に減らすことができます。しかし、CNSの複雑な性質により、細胞株を使用してin vivoの状況を再現することは不可能です。混合神経細胞培養は、置換、還元、改良(3R)の原則に沿って、関連するモデルで神経(免疫)学の質問を調査するための非常に貴重な研究ツールを提供します2,3。
Thomsonらは、前述の全ての主要なCNS細胞型に分化する出生前脊髄細胞を用いた細胞培養方法を記載した4。このシステムはまた、シナプス形成、有髄軸索、およびランヴィエの結節を有する。この培養方法の主な制限は、脊髄であるため、脳を有用にモデル化せず、胚13日目(E13)の脊髄からの細胞収量が収縮していることです。したがって、これにより、調査できる実験条件の数が制限されます。そこで本研究では、動物に対する必要量を減らすために、細胞収量を増加させた脳の特性を再現する新しい細胞培養システムの開発を目指しました。
Thomsonらを出発点として、純粋に出生前のマウスの脳に由来する細胞培養モデルを開発しました。これらの培養物は、脊髄培養物と同じ細胞集団、相互接続性、および治療オプションを持っていますが、比較すると髄鞘形成が少ない点が異なります。しかし、約3倍高い細胞収量を有するCNS インビトロ モデルを有することは、より効率的であり、より少ないマウスおよびより少ない時間で胚を処理する。この独自の培養システムは、顕微鏡分析用のガラスカバースリップや、ハイスループット研究用の96ウェルプレートを含むさまざまなサイズのプラスチックウェルプレートを使用するなど、複数のダウンストリームアプリケーションとスケール向けに最適化しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物実験は、動物使用に関する現地の法律とガイドラインに準拠しており、グラスゴー大学の地元の倫理審査委員会によって承認されました。動物は、英国内務省プロジェクトライセンスの後援の下、1986年英国動物科学的手順法に従って、特定の病原体のない状態で飼育されました。この研究では、社内で飼育した成体C57BL / 6Jマウスを使用しました。妊娠の成功率が高いため、若い女性(8〜12週間)の使用が推奨されます。オスは繁殖の複数のラウンドに再利用することができます。 図1 は、混合ニューロンおよびグリア培養物を生成するための記載された方法の概略概要を表す。
1.組織培養消耗品の調製
- クラス2安全キャビネット内の顕微鏡カバーガラスを含むプレートおよび/または皿を準備します。培養期間中の無菌性を確保するために、すべての試薬またはオートクレーブを滅菌してください。
- 各ウェルに適切な量のBA-PLL(13.2 μg/mLポリ-L-リジン臭化水素酸塩[PLL]、ホウ酸緩衝液[BA][50 mMホウ酸、12.5 mM四ホウ酸ナトリウム、pH 8.5]; 材料表参照)を加えます(6ウェルプレートでは1,000 μL/ウェル、96ウェルプレートでは100 μL/ウェル、容量は 表1にまとめられています)。顕微鏡カバースリップの場合は、200枚の滅菌カバースリップが入った直径9 cmの組織培養皿に20 mLのBA-PLLを加え、回転させて均等に分散させます。
- 37°Cで1〜2時間インキュベートします。
- 顕微鏡カバーガラスを含む各ウェルまたはディッシュからBA-PLL溶液を取り出し、20 mLの滅菌水を加え、カバーガラスを旋回させてから水を除去して洗浄します。この洗浄手順を3回繰り返します。カバーガラスを含む皿の場合は、カバーガラスを簡単に取り除くために、最終洗浄時に組織培養皿に滅菌水を残します。
- 滅菌ピペットでできるだけ多くの液体を取り除き、少なくとも2時間から一晩乾燥させます。
- コーティングされたプレートを4°Cで最大2か月間保管します。
注:ポリ-l-リジン(BA-PLL)溶液で調製したホウ酸は、毎回新しいPLLを追加して、最大3回再利用できます。BA-PLLは4°Cで保管してください。 PLLは細胞が突き出て成長することを可能にするので、皿はBA-PLLで処理されます。この処理を行わないと、細胞は約1週間の培養後に浮き上がり、分化できなくなります。
2. E17胚性脳の解剖
- 1匹または複数の雌マウスを雄マウスと共同飼育する。交尾が行われたことを示す粘液栓がないか毎日女性をチェックしてください。
注:「プラグを差し込んだ」メスのマウスは、妊娠の正しい開始日を確保するためにオスから分離する必要があります。マウスの体重を測定して妊娠を確認するか、視覚的に監視することができます。 - 地域の動物福祉ガイダンスおよび法律に準拠した適切な方法、例えば、二酸化炭素(CO2)濃度の上昇、致死麻酔薬の過剰摂取、または首の脱臼などを使用して、E17で妊娠中のマウスを淘汰する。
注:選択した方法は、胚を破壊してはなりません。この研究では、上昇する濃度の炭酸ガスへの曝露とそれに続く大腿動脈の切断による死亡の確認が、妊娠中のダムを淘汰するために使用されました。 - 淘汰された妊娠中のマウスを解剖板の背中に置きます。ピン留めする必要はありませんが、経験の浅い研究者にとっては簡単かもしれません。鉗子を使用して腹部の正中線をつまみます。鋭利なハサミを使用して、子宮に穴を開けないように注意しながら、生殖器から胸郭までの正中線を越えて皮膚と腹膜を通して腹部を切り開きます。
- マウスの子宮には2つの角があり、それぞれに通常1〜5個の胚が含まれています。胚を含む子宮を母親から取り除き、直ちに氷の上に置きます。
- 胎盤の側面にある卵黄袋を切り取り、胚を傷つけないように注意しながら、卵黄袋から胚を取り除きます。
- すぐに胚を斬首します。斬首された頭を、氷上でカルシウム(Ca2 +)とマグネシウム(Mg2 +)(HBSS-/-)を含まないハンクスのバランス塩溶液(HBSS)を入れた皿に加えます。
注:ジェノタイピングが必要な場合は、遺伝子分析のためにこの段階で尾を取り除くことができます。複数の遺伝子型が予想される場合は、各胚の頭部を別々に保管して培養する必要があります。 - 角度の付いた鉗子を使用して、頭を左向きの側に置きます。
- 鉗子の一方の端で目を突き刺し、もう一方の端であごをしっかりと保持します。
- うなじから始めて、鼻の先端に向かって正中線に沿って頭皮の皮膚をそっと引き裂きます。
- 白い楕円形として目立つ脊髄を通って入り、角度の付いた鉗子を使用して正中線に沿って頭蓋骨を割って開き、脳を露出させます。
- 上を向いた側の頭蓋骨をそっと剥がし、脳を露出させます。
- 脳を頭蓋骨から持ち上げ、脳が完全に除去されたら頭蓋骨を処分します。
- 鉗子を使用して、密な血管を持つ薄い膜として目立つ髄膜を取り除きます。
- 氷上で2 mLのHBSS-/-を含むビジュー( 材料の表を参照)に脳を置きます。
- 残りの頭脳で手順2.6から2.13を繰り返し、ビジューごとに最大4つの頭脳を追加します。
- 250 μLの10xトリプシンをビジューに加え、ビジューを振って脳を粉砕します。37°Cで15分間インキュベートします。
注:この時点以降のすべての手順は、滅菌組織培養フードで実行する必要があります。 - 2 mLの大豆トリプシン(SD)阻害剤(Leibovitz L-15、大豆由来の0.52 mg/mLトリプシン阻害剤、40 μg/mL DNase I、3 mg/mLウシ血清アルブミン[BSA]画分V; 材料表参照)を-20°Cから37°Cで解凍します。
- 脳を含む各ビジューに2 mLのSD阻害剤を加え(最大4つの脳を含むビジューあたり)、ビジューを再度振って均一に分散させます。
注:SD阻害剤はトリプシン活性を低下させ、サンプルの不必要な消化を防ぎ、細胞の生存率を維持します。 - 遠心分離せずに、各ビジューから2 mLの上清を取り除き、細胞凝集塊を移さないように注意しながら15 mLの遠沈管に移します。
- 懸濁液を2回吸引することにより、5 mLシリンジに取り付けられた19 Gの針でビジューの残りの細胞を粉砕します。これにより、濃厚な粘液のような混合物が作成されます。
- 21 Gの針を使用してさらに2回繰り返します。塊が残っている場合は、21Gの針でもう一度粉砕します。
- 23 Gの針を使用して、細胞をビジューから同じ15 mL遠沈管(ステップ2.18から)に移します。
- 室温(RT)で200 x g で5分間遠心分離します。
- 5 mLの血清学的ピペットを使用してすべての上清を取り除き、必要な細胞を含む底の緩いペレットを乱さないように注意しながら、別の15 mL遠沈管に移します。
- 上清を再び200 x g でRTで5分間遠心分離します。
注:このステップは必須ではありませんが、多くの細胞が必要な場合、または胚が少ない場合は、このステップを実行して、上清からできるだけ多くの細胞を回収できます。 - 10 mLのプレーティングメディア(PM)(49%ダルベッコ改変イーグル培地[DMEM]、1%ペニシリン/ストレプトマイシン[ペン/連鎖球菌]、25%ウマ血清、25%HBSS、Ca2+およびMg2 + [HBSS+ /+]; 材料表を参照)を使用して、2つのペレットを組み合わせて再懸濁し、細胞全体の懸濁液を作成します。
- トリパンブルーと血球計算盤またはデジタルセルカウンターを使用して細胞をカウントし、細胞懸濁液をPMで1.8 x 106 細胞/mLの濃度に希釈します。
3.セルのメッキ
- 表1に詳述されているように、必要量の細胞懸濁液を必要なフォーマットに加えます:6ウェルフォーマットではウェルあたり1,000 μL、96ウェルフォーマットではウェルあたり50 μL、またはカバーグラスあたり100 μL。
- 5%-7%CO 2中で37°Cで2〜4時間インキュベートする。倒立顕微鏡で細胞が接着していることを確認する。
- 培地を取り出し、新しい分化培地(DM+:DM-10 μg/mLインスリンを含む。DM-: DMEM、1%ペン/連鎖球菌、50 nMヒドロコルチゾン、10 ng / mLビオチン、2.5 mL 100x N1培地サプリメント; 材料表を参照)。ボリュームの詳細を 表 1 に示します。浮いているカバーガラスを滅菌ピペットチップで押し下げます。
4.文化の維持
注:これらの培養では、最適な成長と分化をサポートするために、週に3回給餌する必要があります。培養物は、DIV( in vitroでの日数)21での実験に最適な健康と成熟度に達します。細胞は最大28日間培養中に保持することができ、その後培養物は急速に変性する。
- DIV12まで週に3回、6ウェルフォーマットでウェルあたり500 μL、96ウェルフォーマットでウェルあたり50 μL、または3つのカバーガラスを含むディッシュあたり500 μLを除去し、6ウェルフォーマットでウェルあたり600 μL、96ウェルフォーマットでウェルあたり60 μLを加えて、上清の一部を新しいDM+と交換します。 またはカバースリップ皿あたり600μL(表1)。
- DIV13以降、週3回、上清の一部を新鮮なDM-と交換し、6ウェルフォーマットでウェルあたり500 μL、96ウェルフォーマットでウェルあたり50 μL、または3つのカバーガラスを含むディッシュあたり500 μLを除去し、6ウェルフォーマットでウェルあたり600 μL、96ウェルフォーマットでウェルあたり60 μLを追加します。 またはカバースリップ皿あたり600μL(表1)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
顕微鏡
ガラスカバーガラスで育てられた培養物は、顕微鏡で分析するのに理想的です。培養の発達を視覚化するために、カバーガラスをDIV0(細胞が付着した後)からDIV28までの複数の時点で4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定しました。NG2(未熟希突起膠細胞)とネスチン(神経幹/前駆細胞)、神経細胞マーカーとしてSMI31(軸索)、MBP(ミエリン)、NeuN(ニューロン細胞体)、またはグリアマーカーとしてCNP(希突起膠細胞)、GFAP(アストロサイト)、Iba1(ミクログリア)の3つの異なる染色の組み合わせを使用して、前述のように 免疫蛍光イメージングのために培養物を染色しました(図2)。
さまざまな細胞タイプを、CellProfilerパイプライン(',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール陽性(https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1)に基づく)を使用して定量しました。個々のデータポイントは、各時点の3つのカバーガラスから取得された平均10枚の画像から生成されました。ミクログリア、ニューロン、および希突起膠細胞について、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール陽性(DAPI+)細胞あたりの細胞型の割合を計算しました。アストロサイトの数を定量化するための細胞数の代わりにパーセンテージ視野を使用した。これは、個々の細胞が頻繁に重なり合うため、個々の細胞を区別することが困難であったためです(図2M、N)。培養物はDIV21で成熟度と細胞密度のピークに達し、その後培養物は分解し始めました(図2N)。
重要なことに、これらの培養物は、潜在的な治療薬などの薬物で簡単に処理したり、 in vitro 感染の追跡に使用したりできます。本実施例では、カバーガラス上の培養物を24ウェルプレートに移し、感染細胞でzsGreenを発現する向神経性の高いウイルスSemliki Forestウイルス(SFV)(SFV6株)6に感染させた。低レベルの感染を確実にするために、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞で滴定された0.05の感染の多重度(MOI-細胞ごとに追加されるウイルス粒子の数)が使用されました。感染後0〜72時間後(hpi)、培養物を4%PFAで固定し、免疫蛍光イメージングによる分析のために染色した。 図3 は、 in vivo 感染に沿って、SFVが主に希突起膠細胞およびニューロン6に感染することを示す。
qRT-PCR
顕微鏡検査に加えて、これらのCNS培養物は、治療に対するmRNA応答のRT-qPCRなどの分子的方法による分析に使用できます。自然抗ウイルス応答をさらに調査するために、6ウェルプレート培養物を、ある用量の強力な抗ウイルスサイトカインインターフェロンベータ(IFN-β)で24時間処理した。培養物をグアニジウム-チオシアン酸/フェノールで溶解し、RNAを単離してcDNAに変換し、前述のようにqPCRで分析しました7。この方法を用いると、多くの遺伝子の発現差を測定することができる。ここでは、 Ccl5 のアップレギュレーションをハウスキーピング遺伝子 18sに対して定量化した。CCL5は、炎症反応に関与する走化性サイトカイン(ケモカイン)である。IFN-β処理は、培養物中の Ccl5 mRNAのアップレギュレーションをもたらした(図4A)。
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)
96ウェルフォーマットの培養は、ハイスループットな治療スクリーニングのための優れたツールです。 Ccl5 mRNAのアップレギュレーションがCCL5タンパク質の発現をもたらすかどうかを調べるために、製造業者の指示に従って、ELISAによって培養の上清中のCCL5を測定しました( 材料表を参照)。この例では、96ウェル培養物を27回の増分用量のIFN−βで二重に処理して、用量反応曲線を生成した(図4B)。mRNA発現の増加(図4A)に沿って、上清中に放出されたCCL5の増加があった。予想通り、 図4C はmRNAとタンパク質発現の間に明確な相関関係があることを示しています。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、多くの細胞内および/または細胞外マーカーの発現を同時に調べるための強力なツールです。しかし、複雑で高度に相互作用性の高い培養物をフローサイトメトリーで解析することは、細胞を培養液から単一細胞懸濁液に取り込んで処理および解析する際に、細胞の損傷や死滅のために困難な場合があります。0.05%-0.5%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、EDTAを含まない1x-10xトリプシン、および穏やかな解離試薬を使用したさまざまなプロトコルを比較すると、6ウェルプレート培養物を0.05%トリプシン-EDTAで37°Cで穏やかに攪拌しながら10分間処理した後、細胞を穏やかな粉砕で持ち上げて単一細胞懸濁液を作成することがわかりました。特にCNS細胞のフローサイトメトリー解析では、細胞調製中は穏やかで、洗浄ステップを最小限に抑え、細胞を常に4°Cまたは氷上に保つように細心の注意を払うことが重要です。
この単一細胞懸濁液の生存率と細胞型を評価するために、細胞を生存率色素とCD45、CD11b、O4、ACSA-2、およびCD24に対する蛍光標識抗体で染色して、培養中の個々の細胞集団を視覚化できるようにしました8(図5)。この方法から約70%の細胞生存率が得られ、6ウェルプレートあたり平均約2 x 106生存可能な単一細胞が得られました(図5C)。顕微鏡観察の結果(図2N)と一致して、ミクログリア、ニューロン、および星状細胞が多数存在し、希突起膠細胞が最も豊富ではありませんでした。
図1:混合ニューロンおよびグリア培養を生成するための記載された方法の概略概要。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:経時的に免疫蛍光イメージング用細胞マーカーについて染色されたE17CNS培養物。細胞を透過処理する前に4%PFAで固定し、染色して異なる集団を可視化しました。(A、D、G、J、M)発生マーカーNG2(希突起膠細胞前駆細胞)およびネスチン(神経細胞およびグリア前駆細胞)、(B、E、H、K、N)ニューロンマーカーSMI31(軸索)、MBP(ミエリン)、およびNeuN(ニューロン細胞体)、および(C、F、I、L、O)グリアマーカーCNP(希突起膠細胞)、GFAP(アストロサイト)、およびIba1(ミクログリア)の代表的な画像。スケールバー = 50 μm。 (p)mm2当たりのDAPIのカウント、n = 3、3連あたり10枚の画像の技術的な三重からの各n。(Q)DAPI+細胞(ミクログリア、希突起膠細胞、およびニューロン)のパーセンテージとしての細胞数および視野(アストロサイト)の割合、n = 3、3つあたり10枚の画像の技術的なトリプリケートからそれぞれn。エラーバーは±平均の標準誤差(SEM)です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:経時的なE17 CNS培養物のセムリキフォレストウイルス(SFV)感染。非感染対照培養物(A、C、E、G)および0.05 MOI SFVに感染した培養物(B、D、F、H)の代表的な画像。細胞を0〜48時間感染させ、CNP(希突起膠細胞マーカー)およびNeuN(ニューロンマーカー)(A−D)またはGFAP(アストロサイトマーカー)およびIba1(ミクログリアマーカー)(E−H)で染色した。白い矢印は感染した細胞を示します。SFVのこの株は、ウイルス感染のトレースを可能にするために緑色蛍光タンパク質zsGreenを発現する。スケールバー = 20 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:IFN-β処理後のE17 CNS培養物のCCL5 mRNAおよびタンパク質発現。 細胞を6ウェルプレートフォーマット(mRNA)または96ウェルプレートフォーマット(タンパク質)で24時間、ある用量のIFN-βで処理した。(A)0-100 ng/mL IFN-β、生物学的n = 2で処理した後の Ccl5 mRNAの発現、それぞれテクニカルトリプリケートから採取。(B)0-100 ng/mL IFNβ処理後の上清中のCCL5濃度、生物学的n = 1、テクニカルトリプリケートから採取。(C)対数トレンドラインを有する上清中の細胞mRNA Ccl5 アップレギュレーション対CCL5タンパク質濃度。エラーバーはSEM±されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:E17 CNS培養から単一細胞集団を作製するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。 細胞を0.05%トリプシン-EDTAを用いて解離し、適切な抗体で染色し、個々の細胞集団に分類した。(A-C)生きた単一細胞を選別するためのゲーティング戦略。(D)ミクログリア(CD45+ CD11b+)を選択する戦略。(E)希突起膠細胞(CD45-CD11b-O4+)を選択する戦略。(F)アストロサイト(CD45-CD11b-O4-ACSA-2+ CD24+)およびニューロン(CD45-CD11b-O4-ACSA-2-CD24+)を選別する戦略。(g)個々の細胞集団を互いに重ね合わせ、離散的な集団を示す。(h)個々の細胞型を選別した全細胞に占める割合として、n=4。エラーバーはSEM±されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 必須の形式 | BA-PLL/ウェル | 洗浄用水 | プレートアウトするためのプレーティングメディア(PM)中のボリュームセル | メディアの補充 | 培養物に餌を与えるときに削除/追加(3回/週) |
| 6ウェルフォーマット(9.6cm2) | 1000 μL | 1000 μL | 1000 μL | -400 μL | -500 μL のメディア |
| +600 μL DM+ | +600 μL DM+/- | ||||
| 96ウェルフォーマット(0.32 cm2) | 100μL | 100 μL | 50 μL | +60 μL DM+ | -50 μL のメディア |
| +60 μL DM+/- | |||||
| 皿形式のカバーガラス | カバースリップ 200 枚あたり 20 mL | 20ミリリットル | カバーガラスあたり100 μL | +600 μL DM+ | -500 μL のメディア |
| +300 μL PM | +600 μL DM+/- |
表1:コーティングされた組織培養プラスチックの調製に必要な量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CNSは、脳から脊髄にまたがる複雑なネットワークであり、主にニューロン、希突起膠細胞、星状細胞、ミクログリアなど、多くの細胞型で構成されています1。各細胞は、CNS 9,10,11の恒常性を維持し、課題に対する適切な応答を生成する上で重要な役割を果たすため、これらすべての細胞タイプを含む培養システムは、脳が刺激にどのように反応するかを調べるための有用で用途の広いツールです。これらの細胞とその相互作用をin vitroの状況で研究できることは、さまざまな実験上の質問を簡単に調査するために多種多様な技術を使用できることを意味します。我々は、成体マウス脳の個々の細胞集団を模倣することができる出生前脳から主要なCNS細胞型を取得して培養するための迅速かつ効率的な方法を概説した12。
CNS培養を生成するために以前に確立されたプロトコルは、E13.5脊髄4,5を使用します。脊髄に適したモデルを持つことに加えて、脳を再現するモデルを持つことは非常に関連性があります。したがって、これらのE13.5マウスの脳は、もともと同じプロトコルを使用して、ここに記載されているCNS培養を生成するために使用されました。しかし、DIV14の後、細胞は密集した神経細胞体と大きな凝集体を形成し始めました。星状細胞が存在する間、それらが均等に分布していたかどうかは明らかではない。これらの細胞体の中心にある細胞が、外側の細胞と同じように培養液から十分な栄養素と酸素を受け取るかどうかは不明です。酸素と栄養素の欠乏を経験すると、ニューロンはアポトーシスを経てグリア細胞13にストレスシグナルを放出しやすくなり、炎症誘発性の表現型14につながる可能性があります。神経新生はこれらの密集した凝集体の原因である可能性が高いと考えられ、この段階はE1715までに治まります。E17マウス胚の脳を使用した場合、細胞は依然としてネットワークを形成していましたが、E13.5で見られる大きな凝集体にクラスター化しなかったため、脳培養の生成により適した年齢と見なされました。
現在の技術では、1回の妊娠から得られる細胞の数も多くなります(平均して1 x 10 7細胞/脳と比較して、3-4 x 106細胞/脊髄)7。8〜10個の胚を有する平均的な妊娠マウスの場合、これは6ウェルプレートフォーマットで最大54の異なる実験条件、または顕微鏡検査で150の実験条件(脊髄からそれぞれ19および64と比較して)と相関する。このように、これらのCNS培養物は、マウス16の必要数を減らすための優れたツールである。特に、96ウェルフォーマットは、動物での試験前に薬剤候補のスクリーニングを可能にするなど、ハイスループットアッセイに簡単に使用でき、そのような研究に必要な動物の数を大幅に削減します。これにより、動物でのCNS薬のテストの成功率が低くなり、ヒトでの臨床試験への翻訳が改善されることを願っています17,18。
培養物はDIV21までにピーク成熟に達する。細胞数はこの時点まで増加し、その後、細胞は各タイプの細胞の数が減少するにつれて退化し始めます。これは、定量化された細胞数(図2N)とピクノティック核(高密度DAPI染色)の数(図2M)の両方を調べることによって測定されました。発生マーカーのネスチンとNG2は依然としてDIV14(図2G)とDIV21(図2J)に発現していますが、これは、一部の星状細胞がアストログリオーシスを経てネスチン19をアップレギュレートするのに対し、一部の希突起膠細胞は完全に成熟していないため、NG220を発現しているためです。顕微鏡による検証に基づくと、DIV21による完全に成熟した細胞と比較して、細胞のごく一部のみが依然として発生マーカーを発現しています(図2I、L)。したがって、文化はこの時までに大部分が成熟しています。注目すべきことに、 インビボでは、ミクログリアの密度はマウスCNS全体にわたって非常に変動する。顕微鏡を用いたIba1発現によって定義されるミクログリアのレベルは、我々の培養におけるこの密度の上限にある12。フローサイトメトリー手順で生存するミクログリアの割合が高いのは、ミクログリアが他のCNS細胞よりも頑健であり、一般的に微妙な伸展を有し、したがってフローサイトメトリー調製中に損傷を受ける可能性が高いためである可能性が高い。
細胞が実験の準備が整うまで、解剖後わずか3週間しかかからず、オルガノイドや人工多能性幹細胞由来モデルなどのほとんどのヒトベースのin vitro法よりも短い21。新しい治療法の安全性を確保するためにin vivo研究が必要である限り、私たちのようなin vitro細胞培養法を使用すると、動物で試験する前に毒性と有効性を効率的に試験し、動物の必要性を減らし、in vitroからin vivoへの研究の翻訳を強化するのに役立ちます。 うまくいけば、これは最終的にヒトベースの臨床試験へのより効率的な翻訳にもつながるでしょう。最終的に、これらの文化はCNSの研究を可能にするために作成されました。in vitroシステムはCNSの複雑さを完全に表現することはできませんが、初代細胞由来の培養物はin vivoCNSの特性をより正確に表しています22,23。インビトロアプローチは、浸潤免疫細胞24および血液脳関門完全性25の非存在下でCNSを調査するためのより還元的なアプローチを可能にすることができる。この複雑さの層を取り除くことで、メカニズムを解明しやすくなります。このように、本培養システムは、in vivo動物研究を補完する研究課題に答えるための有用なツールである。
CNS細胞を採取、単離、および培養する能力は、先天性CNS16の理解をすでに大きく前進させています。この記事では、E17マウスの脳を解剖し、その結果として細胞を粉砕および培養して、CNSのすべての主要な細胞タイプを含む細胞培養システムを生成する方法を示します。これらの培養には複数の分子技術が採用されており、これらの培養物がCNSの調査に有効であることを示しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
エドガーとリニントンの研究室のメンバー、特にクリス・リニントン教授、ダイアナ・アルセニ博士、カティア・ミュックリッシュ博士のアドバイス、有益なコメント、そして私たちがこれらの文化を立ち上げる際の文化への供給の支援に感謝します。特に、Cell Profiler パイプラインの出発点を提供してくださった Muecklisch 博士に感謝します。この作業は、MSソサエティ(助成金122)とユーリとローナチェルナヨフスキー財団によってMPに支援されました。グラスゴー大学がJCとMPに資金を提供する。ウェルカムトラスト(217093 / Z / 19 / Z)および医学研究評議会(MRV0109721)をGJGに譲渡します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al.
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A.
