Summary
Här presenteras en ny version av expansionsmikroskopi (ExM), Magnify, som är modifierad för upp till 11-faldig expansion, bevarar ett omfattande utbud av biomolekylklasser och är kompatibel med ett brett spektrum av vävnadstyper. Det möjliggör undersökning av nanoskala konfiguration av biomolekyler med hjälp av konventionella diffraktionsbegränsade mikroskop.
Abstract
Nanoskala avbildning av biologiska prover kan förbättra förståelsen av sjukdomspatogenes. Under de senaste åren har expansionsmikroskopi (ExM) visat sig vara ett effektivt och billigt alternativ till optisk superupplösningsmikroskopi. Det har dock begränsats av behovet av specifika och ofta anpassade förankringsmedel för att behålla olika biomolekylklasser i gelén och av svårigheter med att expandera kliniska standardprovformat, såsom formalinfixerad paraffininbäddad vävnad, särskilt om större expansionsfaktorer eller konserverade proteinepitoper önskas. Här beskriver vi Magnify, en ny ExM-metod för robust expansion upp till 11 gånger i ett brett spektrum av vävnadstyper. Genom att använda metakrolein som kemiskt ankare mellan vävnaden och gelen behåller Magnify flera biomolekyler, såsom proteiner, lipider och nukleinsyror, i gelén, vilket möjliggör en bred nanoskala avbildning av vävnader på konventionella optiska mikroskop. Detta protokoll beskriver bästa praxis för att säkerställa robust och sprickfri vävnadsexpansion, samt tips för hantering och avbildning av mycket expanderade geler.
Introduction
Biologiska system uppvisar strukturell heterogenitet, från lemmarna och organen ner till nivåerna av proteiner på nanoskalan. Därför kräver en fullständig förståelse av driften av dessa system visuell undersökning över dessa storleksskalor. Diffraktionsgränsen för ljus orsakar dock utmaningar vid visualisering av strukturer mindre än ~ 200-300 nm på ett konventionellt fluorescensmikroskop. Dessutom presenterar optiska superupplösningsmetoder 1,2,3, såsom stimulerad emissionsutarmning (STED), fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM), stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM) och strukturerad belysningsmikroskopi (SIM), även om de är kraftfulla, sina egna utmaningar, eftersom de kräver dyr hårdvara och reagens och ofta har långsamma förvärvstider och dålig förmåga att avbilda stora volymer i 3D.
Expansionsmikroskopi4 (ExM) ger ett alternativt sätt att kringgå diffraktionsgränsen för ljus genom att kovalent förankra biomolekyler i en vattensvällbar polymergel och fysiskt dra isär dem, vilket gör dem lösbara på konventionella optiska mikroskop. En mängd ExM-protokollvarianter har utvecklats sedan den ursprungliga publiceringen av ExM för mindre än ett decennium sedan, och dessa protokoll tillåter direkt införlivande av proteiner 5,6,7, RNA 8,9,10 eller lipider11,12,13 in i gelnätverket genom att ändra det kemiska ankaret eller expandera provet ytterligare (vilket förbättrar den effektiva upplösningen) antingen i ett enda steg14 eller flera iterativa steg15,16. Fram till nyligen kunde inget enda ExM-protokoll behålla dessa tre biomolekylklasser med ett enda kommersiellt tillgängligt kemiskt ankare samtidigt som det gav en mekaniskt robust gel som kunde expandera ~ 10 gånger i en enda expansionsrunda.
Här presenterar vi Magnify17, ett nytt tillskott till ExM-arsenalen som använder metakrolein som biomolekylankare. Metakrolein bildar kovalenta bindningar med vävnad som paraformaldehyd, vilket säkerställer att flera klasser av biomolekyler kan behållas inom gelnätverket utan att kräva olika specifika eller anpassade förankringsmedel. Dessutom kan denna teknik expandera ett brett spektrum av vävnader upp till 11 gånger, inklusive notoriskt utmanande prover såsom formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) kliniska prover. Tidigare metoder för att expandera sådana mekaniskt styva prover krävde hård proteassmältning, vilket gjorde antikroppsmärkning av proteiner av intresse omöjlig efter att provet hade expanderats. Däremot uppnår denna teknik expansionen av FFPE-kliniska prover med användning av en het denatureringslösning, vilket bevarar hela proteinepitoper i gelén, som kan riktas mot bildbehandling efter expansion (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella förfaranden med djur utfördes i enlighet med National Institutes of Health (NIH) riktlinjer och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Carnegie Mellon University. Mänskliga vävnadsprover erhölls kommersiellt.
1. Beredning av lagerreagenser och lösningar
OBS: Se materialförteckningen för en lista över de reagenser som används.
- Förbered gelningslösningarna. Dessa kommer att kombineras omedelbart före gelningssteget.
- Bered monomerstamlösningen (4 g/100 ml N,N-dimetylakrylamidsyra [DMAA], 50 g/100 ml natriumakrylat [SA], 66,7 g/100 ml akrylamid [AA], 0,10 g/100 ml N,N′-metylenbisakrylamid [Bis], 33 g/100 ml natriumklorid [NaCl], 1x fosfatbuffrad saltlösning. PBS) med användning av de komponenter som anges i tabell 1. Lös upp eller späd alla stamlösningar i vatten. Monomerstamlösningen kan förvaras vid 4 °C i minst 3 månader.
- Gör följande stamlösningar separat i vatten: 0,5% (vikt/vikt) 4-hydroxi-TEMPO (4HT), som hämmar gelering under monomerdiffusion i vävnaderna, och 10% (vikt/vikt) tetrametyletylendiamin (TEMED), som påskyndar den radikala generering som initieras av ammoniumpersulfat (APS) och framställs vid 10% (w/w).
OBS: Stamlösningarna kan fördelas i 1-2 ml alikvoter och lagras vid 4 ° C i upp till 3 månader; APS görs emellertid omedelbart före beredning av gelningslösningen.
- Bered homogeniseringsbufferten (1% w/v S.D.S., 8 M urea, 25 mM EDTA, 2x PBS, pH 8, vid rumstemperatur [R.T.]) genom att kombinera 1 g SDS, 48,048 g urea, 5 ml EDTA (0,5M, pH 8), 20 ml 10x PBS, 25 ml Tris (2 M) och 0,75 g glycin. Tillsätt vatten för en total volym på 100 ml. Lösningen kan skalas upp eller ner efter behov och kan lagras hos R.T.
2. Vävnadsberedning för arkiverade och nyberedda kliniska vävnadsglas
OBS: Förbehandlingsstegen för vävnad skiljer sig åt beroende på hur proverna bereds.
- För formaldehydfixerade paraffininbäddade (FFPE) kliniska prover, följ stegen nedan.
- Placera proverna i en sekventiell serie lösningar (en glasfärgningsburk eller 50 ml koniskt rör kan användas): xylen, 95% etanol, 70% etanol och 50% etanol, följt av dubbelt avjoniserat vatten. Använd varje lösning två gånger i minst 3 minuter varje gång. Använd pincett för att placera glaset i behållaren och tillsätt 15 ml av respektive lösning (tillräckligt för att täcka provet). Placera det täckta koniska röret horisontellt på en skakapparat vid rumstemperatur.
- För prover färgade och monterade på permanenta objektglas, följ stegen nedan.
- Placera glaset kort i xylen och ta försiktigt bort täckglasen med ett lämpligt verktyg, t.ex. ett rakblad. Om täckglaset sitter kvar, sätt tillbaka glasen i xylen till rumstemperatur tills täckglaset lossnar.
- Bearbeta sedan proverna som FFPE-prover (steg 2.1.1).
OBS: För hematoxylin och eosin (H &E) -färgade glas förloras hematoxylin och eosinfläcken under expansionsprocessen.
- För ofixerade frysta mjukpapper i optimal skärtemperaturlösning (OCT), fixera vävnaderna i aceton vid −20 °C i 10 minuter innan proverna tvättas med 1x PBS-lösning tre gånger i 10 minuter varje gång vid rumstemperatur.
- För tidigare fixerade frysta kliniska vävnadsglas, smält ULT genom att inkubera objektglasen i 2 minuter vid rumstemperatur och tvätta sedan med 1x PBS-lösning tre gånger i 5 minuter varje gång vid rumstemperatur.
3. Vävnadsberedning för paraformaldehydfixerad mushjärna
- Följ detta protokoll för mushjärnsektioner som är 30-50 μm tjocka.
OBS: Framgång kan hittas med större sektioner, men längre tider kan krävas för diffusion och homogenisering av monomerlösningar. - Om sektionerna för närvarande inte förvaras i en 1x PBS-lösning (till exempel i en 30% [v / v] glycerol och 30% [v / v] etylenglykollösning i 1x PBS), tvätta tre gånger i minst 10 minuter varje gång vid rumstemperatur i 1x PBS i en 6-till-24-brunnsplatta.
- Skaffa en obelagd glasmikroskopiglas. Om ena sidan av glasskivan är belagd, använd en våt pensel för att kontrollera den obelagda sidan (ofta kommer etiketten på den belagda sidan att vara gjord av slipat glas och blir mindre ogenomskinlig när den är våt).
- Använd en pensel för att blöta den obelagda bilden. Ta bort musens hjärnvävnad från brunnsplattan med penseln och placera den försiktigt på glaset med en rullande rörelse för att säkerställa att vävnaden är platt. Låt överflödigt PBS förbli på vävnaden tills alla sektioner är monterade.
OBS: Medan en enda glasskiva kan användas för flera vävnadssektioner, när fler vävnadssektioner gelas samtidigt (även på separata objektglas), måste mer försiktighet vidtas för att säkerställa att de inte torkar helt ut. - Använd en laboratoriepappersduk och ta bort majoriteten av överflödigt PBS från glaset. Lämna en liten vätskering runt varje vävnadssektion, men lämna resten av bilden mestadels torr. Denna återstående vätska kommer att täcka vävnaden medan gelmonomerlösningen framställs.
4. Gelning
OBS: Detta protokoll är lämpligt för alla vävnadstyper som är förberedda för användning med denna teknik.
- Applicera distanser på vardera sidan av vävnadssektionen (figur 2A) för att förhindra vävnadskompression. För att göra det, gör distanserna genom att tunt skära bitar av täckglas med en diamantspetsad penna och sedan fästa dem på bilden med små mängder vatten eller 1x PBS, eller fixa dem med en liten mängd superlim. Placera sedan försiktigt distanserna på vardera sidan av vävnaden.
- Förbered den slutliga gelningslösningen. I allmänhet är ~ 200 μL tillräckligt per vävnadssnitt, men volymen bör inte överstiga 800 μL per objektsglas. Någon mer gelningslösning kommer att resultera i spillover.
OBS: Metakrolein används för att förankra biomolekyler i gelén. Inget separat förankringssteg krävs dock och metakrolein kan tillsättas direkt till den slutliga geleringslösningen.- Kombinera följande per sektion i ordning: 200 μL monomerlösning, 0,5 μL 0,5% 4HT stamlösning (1:400 spädning), 0,2-0,5 μL metakrolein (1:400-1:1,000 spädning beroende på vävnadstyp; använd i allmänhet en 1:1 000 spädning för paraformaldehyd [PFA]-fixerade prover och 1:400 för FFPE kliniska prover), 2 μL 10% TEMED-stamlösning (1:100 utspädning), och 5 μl 10 % A.P.S.-stamlösning (spädning 1:40).
Bered den slutliga geleringslösningen omedelbart före användning. För att förhindra för tidig gelning, tillsätt APS-lösningen sist.
- Kombinera följande per sektion i ordning: 200 μL monomerlösning, 0,5 μL 0,5% 4HT stamlösning (1:400 spädning), 0,2-0,5 μL metakrolein (1:400-1:1,000 spädning beroende på vävnadstyp; använd i allmänhet en 1:1 000 spädning för paraformaldehyd [PFA]-fixerade prover och 1:400 för FFPE kliniska prover), 2 μL 10% TEMED-stamlösning (1:100 utspädning), och 5 μl 10 % A.P.S.-stamlösning (spädning 1:40).
- Ta bort överflödig lösning från vävnadssektionen och placera glaset i en petriskål. Tillsätt all nyberedd, kall geleringslösning till provet och inkubera blandningen på vävnaden i 30 minuter vid 4 °C så att den kan spridas in i vävnaden.
- Placera en andra obelagd glasskiva försiktigt över vävnads- och gellösningen. Luftbubblor bör undvikas (figur 2B).
OBS: Om luftbubblor fastnar över vävnaden kan glaslocket försiktigt lyftas och placeras ner igen. Dessutom kan någon monomerlösning som spills ut trimmas bort efter polymerisation och kommer inte att orsaka några problem för vävnaden. - Se till att polymerisationen är klar. Denna polymerisation kan göras på två sätt, var och en ger liknande resultat. Inkubera först proverna vid 37 °C i en fuktad miljö (t.ex. en sluten petriskål med en fuktig pappershandduk) över natten. Alternativt, för snabbare polymerisation, inkubera proverna i den fuktade atmosfären i 2 timmar vid 37 °C följt av 1 timme vid 60 °C.
5. Provsmältning och vävnadsexpansion
OBS: Detta protokoll är lämpligt för alla vävnadstyper.
- Använd ögonskydd, skjut ett rakblad mellan de två glasskivorna i gelningskammaren för att separera dem.
OBS: Glasskivorna ska separera mycket enkelt. Om olika delar av gelén sitter fast på båda objektglasen kan en pensel användas för att styra gelén till den ena eller den andra. Om gelén har blivit särskilt torr under polymerisation kan 1x PBS appliceras på utsidan av gelkammaren, men sänk inte ner gelén helt, eftersom detta kommer att få den att expandera innan vävnaden homogeniseras, vilket kommer att resultera i sprickbildning. - Trimma den tomma gelén runt vävnaden för att minimera volymen. Skärning av gelén asymmetriskt möjliggör spårning av gelens orientering efter homogenisering, eftersom provet blir helt transparent.
- Lyft försiktigt den vävnadsinnehållande gelén från glaset med ett rakblad och överför den försiktigt till ett 2 ml centrifugrör med en pensel.
- Fyll röret till toppen med homogeniseringsbuffert (tabell 2) förvärmd till 80 °C.
- Inkubera provet genom skakning vid 80 °C i 8 timmar (för PFA-fixerad mushjärna) eller 60 timmar (de flesta kliniska FFPE-prover; se tabell 3).
OBS: Homogeniseringstiden är beroende av vävnadstyp och fixeringsmetod. Många av dessa villkor har redan validerats, men för andra kan optimering vara nödvändig. - Häll innehållet i centrifugröret i en enda brunn på en 6-brunns plastcellodlingsplatta.
- Avlägsna denatureringsbufferten med en överföringspipett.
- För att fullständigt avlägsna återstående SDS från hydrogelen, tvätta provet i en 1% icke-jonisk ytaktiv lösning (C12E 10) enligt följande: minst tre gånger i10 minuter varje gång vid rumstemperatur; i 60 min vid 60 °C, och sedan ytterligare tre tvättar i 10 minuter varje gång vid rumstemperatur.
- Förvara provet i 1x PBS + 0,02% natriumazid vid 4 °C tills färgning och avbildning efter expansion måste utföras.
OBS: Vid denna tidpunkt bör provet vara ~ 3-4,5 gånger större i varje dimension, beroende på vävnadstyp.
6. Profilering av biomolekyler efter expansion
- Färgning av antikroppar
OBS: Detta följer ett typiskt immunofluorescens (IF) / immunohistokemi (I.H.C.) färgningsprotokoll. Mängden primära och sekundära antikroppar som används beror på de koncentrationer som föreslås av tillverkaren eller genom optimering för det specifika experimentet. Individuella buffertar kan ersättas efter användarens gottfinnande.- Med provet i en enda brunn på en 6-brunns cellodlingsplatta, tvätta de expanderade proverna tre gånger i 10 minuter varje gång i 1x PBS vid R.T., överför vätskan med en pipett.
- Utför ett valfritt blockeringssteg (t.ex. 3 % bovint serumalbumin/0,1 % Triton-X100 i 1x PBS) i minst 1 timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.
- Inkubera med de primära antikropparna i färgningsbuffert (t.ex. 0,1 % Triton-X100 1x PBS eller 9x PBS/1 % TritonX/10 mg/L heparin) över natten vid 37 °C. Beroende på provstorleken bör 0,5-2 ml täcka gelén tillräckligt.
- Tvätta provet tre gånger i minst 10 minuter varje gång i 1x PBS vid rumstemperatur.
- Inkubera i motsvarande sekundära antikroppar i 3 timmar vid 37 °C i valfri färgningsbuffert.
- Tvätta provet tre gånger i minst 10 minuter varje gång i 1x PBS vid rumstemperatur.
- NHS-ester pan-protein färgning
- Häll 1-2 ml polyetylenglykol (PEG 200) på provet med provet i en 6-brunnsplatta (tillräckligt för att täcka det helt).
OBS: Vävnaden ska krympa och återgå till sin ursprungliga storlek före expansionen (eller nära den). - Färga med fluoroforkonjugerad NHS-ester utspädd till 13,3-80 μg/ml i 3 timmar vid R.T. i 1-2 ml färgningsbuffert (t.ex. 1x PBS, 2x SSC eller 100 mM natriumbikarbonatlösning).
- Tvätta provet tre gånger i minst 10 minuter varje gång i 1x PBS vid rumstemperatur.
- Häll 1-2 ml polyetylenglykol (PEG 200) på provet med provet i en 6-brunnsplatta (tillräckligt för att täcka det helt).
- Lipidfärgning
OBS: Lipidfärgning efter expansion är inte effektiv på FFPE kliniska prover, eftersom lipider förloras under fixeringsprocessen.- Tvätta provet tre gånger i minst 10 minuter varje gång i 1x PBS vid rumstemperatur.
- Applicera ett konventionellt lipofilt färgämne (DiO, DiI eller DiD) utspätt 200 gånger i 2 ml 0,1% TritonX-100 / 1x PBS i 72-96 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta minst tre gånger med 1x PBS
- Fluorescens in situ hybridisering (FISH)
- Placera homogeniserade gelprover i hybridiseringsbuffert förvärmd till 60 °C i 30 minuter.
- Förbered hybridiseringsbufferten för FISH: Kombinera 2x SSC (300 mM NaCl, 30 mM natriumcitrat, pH 7,0), 10% (v / v) dextransulfat, 20% (v / v) etylenkarbonat och 0,1% (v / v) Tween20.
- Inkubera gelproverna med en hybridiseringsbuffert innehållande 10 pM (per oligo) FISH-sonder mot målgenen (minst 20 sonder per 10 kb) vid 45 °C över natten.
- Tvätta med stringenstvättbuffert (2x S.S.C. och 0,1% Tween20) två gånger i 15 minuter varje gång vid 45 °C.
- Tvätta med stringenstvättbuffert ytterligare två gånger i 10 min varje gång vid 37 °C.
- Slutligen tvätta med 1x PBS minst tre gånger i 10 minuter varje gång vid rumstemperatur.
- Proverna är klara för avbildning eller lagring i 1x PBS + 0,02% natriumazid vid 4 °C.
- Full vävnadsexpansion och fluorescensavbildning
OBS: Den expansionsfaktor som kan uppnås med Magnify varierar med vävnadstyp och expansionsmetod (en fullständig sammanfattning finns i tabell 3). Som en allmän uppskattning kommer ett förstoringsprov att expandera 3-4,5 gånger i 1x PBS, 5-7 gånger i PBS utspätt till 1:50 i ddH 2 O och 8-11gånger i ddH2O. Den optimala expansionsfaktorn för avbildning beror på varje experiments behov. Expansionsfaktorn är mycket avstämbar, så att ett enda prov kan expanderas och krympas många gånger för avbildning i olika skalor.- Flytta proverna expanderade 4 gånger i PBS till en glasbotten 6-brunns bildplatta med en pensel. Flytta ett prov som expanderas ytterligare genom att skära det i mindre bitar eller placera försiktigt i en stor bildplatta med glasbotten med en tunn bit flexibel plast.
- Utför fluorescensavbildning med hjälp av ett konventionellt bredfältsmikroskop, ett konfokalmikroskop eller ett annat bildsystem som du väljer. Avlägsnande av överflödig vätska runt gelén med en papperslaboratorieduk kan förhindra gelrörelse under avbildning. Gelerna kan också immobiliseras genom att applicera 0,1% poly-L-lysin på glasytan före avbildning.
OBS: Appliceringen av poly-L-lysin kommer att göra gelén helt orörlig vid kontakt. Av denna anledning måste försiktighet vidtas att gelén appliceras på glaset utan vikning eller sträckning. Dessutom bör gelén inte tillåtas torka helt på poly-L-lysinbelagt glas, eftersom detta kan göra borttagningen svår, och gelén bör inte krympas i PBS medan den fortfarande är fäst vid glaset med poly-L-lysin, eftersom detta kan orsaka gel- eller vävnadsskada. - Efter avbildning, krymp proverna i 1x PBS med minst tre tvättar i 10 minuter varje gång, eftersom det inte rekommenderas att lagra proverna långsiktigt i ddH2O på grund av nedbrytningen av fluorescenssignalen. I synnerhet bör helt expanderade prover färgade med lipofila färgämnen avbildas så nära expansionstiden som möjligt för att förhindra dissociation av färgämnet i vatten.
- Förvara proverna i 1x PBS + 0,02% natriumazid vid 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om protokollet har slutförts framgångsrikt (figur 1) kommer provet att se klart och plant ut efter värmedenaturering. Varje vikning eller skrynkling indikerar ofullständig homogenisering. Ett framgångsrikt expanderat prov kommer att vara 3-4,5 gånger större än före expansion i 1x PBS och 8-11 gånger större när det är fullt expanderat i ddH2O. Figur 3 visar exempel före och efter expansion bilder av 5 μm tjockt FFPE humant njurprov som bearbetats med detta protokoll och framgångsrikt expanderats över 8 gånger. Vävnaden färgades först med antikroppar mot ACTN4 tillsammans med DAPI för att visualisera kärn-DNA. Provet avbildades sedan med hjälp av ett konfokalmikroskop med snurrskiva (figur 3A). Vävnaden behandlades enligt ovanstående protokoll, inklusive färgning efter expansion av samma mål, och expanderades helt i vatten (figur 3B) före avbildning. Efter värmedenaturering kan även andra biomolekyler än proteiner färgas in och avbildas, såsom visas i figur 4. Lipofila färgämnen kan appliceras för att avslöja cell- och mitokondriernas membranstrukturer i mushjärnan (figur 4A). Dessutom kan nukleinsyror avbildas genom FISH, som i FFPE: s normala mänskliga lymfkörtelvävnad som visas i figur 4B, C.
Figur 5 visar ett sannolikt resultat om provet inte homogeniseras korrekt. Efter expansion färgades vävnaden med antikroppar mot ACTN4 och vimentin, tillsammans med DAPI för att visualisera kärn-DNA och vetegroddsagglutinin (WGA) för att märka kolhydraterna. Vävnaden expanderades 3,5 gånger i PBS innan den avbildades med hjälp av ett spinnskivkonfokalmikroskop. I en njursektion (figur 5A, C) kan den sprickfria expansionen av en glomerulus ses. I ett separat avsnitt (figur 5B, D) kan sprickbildning tydligt ses i vävnaden.
Bild 1: Schematisk bild av arbetsflödet Förstora. Förbehandlingen av kliniskt arkiverade vävnadsglas utförs först baserat på lagringsformatet. Fritt flytande paraformaldehydfixerade sektioner behöver endast tvättas i PBS. Proverna inkuberas sedan i en gelmonomerlösning, inklusive metakrolein för att förankra biomolekylerna till hydrogelen. In situ-polymerisation utförs före värmedenaturering med urea, SDS och EDTA. Proverna tvättas sedan noggrant och färgas med konventionella immunfärgningsprotokoll, FISH-protokoll eller lipofila färgämnen. Proverna expanderas sedan i rent vatten före avbildning. Denna siffra har modifierats från Klimas et al.17. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Geleringskammare för vävnadsprov . (A) På vardera sidan av vävnaden placeras två distanser, såsom två stycken # 1.0 täckglas, innan gelmonomerlösningen får diffundera vid 4 ° C. För att förhindra kompression bör distanserna vara tjockare än vävnadsskivorna. (B) Ett lock, t.ex. en andra glasskiva, används för att täcka provet före polymerisation vid 37 °C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Exempel på bilder före expansion av en mänsklig njurvävnadssektion. (A) En bild tagen med 60x förstoring (1,4 NA) jämfört med (B) en bild av samma synfält efter expansion med Magnify tagen med 40x förstoring (1,15 NA, expansionsfaktor: 8,15x). Magenta, DAPI; Gul, ACTN4. Den maximala intensiteten för efterexpansionsbilderna projiceras över 25 bildrutor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Alternativa biomolekylfärgningsstrategier med Magnify . (A) (i och iv) NHS-ester pan-protein märkning av fullt expanderad mus hjärnvävnad. (ii och v) Lipofilt färgämne (DiD) märkning av samma mus hjärnvävnad. (iii och vi) Kanalerna slogs samman. (B) DNA FISH med Magnify med FFPE normal human lymfkörtelvävnad. Expansionsfaktor: 3,5x i 1x PBS. Vit, DAPI; Magenta, serin/treoninkinas 1 gen; Blå, APC / C-aktivatorprotein CDH1-gen; Gul, mänsklig satellitsekvens S4. (C) Enskilda kanaler associerade med B. Alla bilder erhölls med hjälp av ett spinnskivkonfokalmikroskop vid 40x förstoring (1,15 NA). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Representativa resultat av 5 μm tjocka FFPE-njurprover. (A) Sprickfri expansion. Vit, DAPI; Gul, vimentin; Cyan, alfa-aktinin 4; Magenta, vetegroddsagglutinin. (B) Utvidgad njursektion som uppvisar sprickbildning. Sprickbildning, förvrängningar och förlust av märkta mål kan vara resultatet av otillräcklig förankring och/eller homogenisering. (C,D) Inzoomade bilder av de inramade områdena i A respektive B. Alla bilder erhölls med hjälp av ett spinnskivkonfokalmikroskop med 10x (A, B; 0,45 NA) eller 60x (C, D; 1,2 NA) förstoring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Gelmonomerlösningens sammansättning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Homogeniseringsbuffertens sammansättning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Sammanfattning av metakrolein och homogeniseringsbetingelser för validerade vävnader. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi Magnify-protokollet 17, en ExM-variant som kan behålla flera biomolekyler med ett enda kemiskt ankare och expandera utmanande FFPE-kliniska prover upp till11 gånger med värmedenaturering. De viktigaste förändringarna i detta protokoll som skiljer det från andra ExM-protokoll inkluderar användningen av en omformulerad gel som förblir mekaniskt robust även när den är helt expanderad, liksom användningen av metakrolein som biomolekylankare. De mest kritiska stegen i detta protokoll är följande: 1) sammansättningen av den slutliga gellösningen; 2) tidpunkten för geleringsstegen; 3) inställningen av geleringskammaren; 4) parametrarna för homogenisering av prover, och 5) tillräcklig tvättning av SDS från provet före färgning efter expansion.
Den mest kritiska parametern för detta protokoll är sammansättningen av den slutliga geleringslösningen, särskilt koncentrationen av biomolekylen ankare metakrolein. Olika metakroleinkoncentrationer krävs för att expandera olika vävnadstyper (tabell 3), och försiktighet måste iakttas för att säkerställa att detta värde är väl anpassat till provet som ska expanderas. Överförankring med metakrolein kan resultera i en minskad expansionsfaktor och en förlust av epitoper tillgängliga för färgning efter expansion, medan underförankring, särskilt i FFPE-kliniska prover, kan resultera i vävnadssprickor eller förvrängning. Därför måste metakroleinkoncentrationen optimeras för ovaliderade vävnadstyper, även om den optimala koncentrationen sannolikt kommer att falla nära eller inom det intervall som presenteras här. Medan vi förväntar oss att detta protokoll kommer att fungera för de flesta vävnadstyper, även de som vi ännu inte har validerat, är det känt att det inte fungerar för prover som innehåller ben.
Utöver metakrolein kan användning av en felaktig koncentration av en kritisk gelingrediens (4HT eller TEMED) resultera i fullständigt misslyckande av experimentet, antingen på grund av ofullständig eller ingen gelning (överdriven 4HT) eller för tidig gelering (överdriven TEMED, reducerad 4HT eller tillsats av APS före de andra komponenterna). För att förhindra för tidig gelering är det också nödvändigt att hålla provet och gelen vid 4 °C och exponera för luft i 30 minuter och att endast täcka provet och placera det vid 37 °C i en fuktad kammare efter att diffusionsprocessen är klar.
Vid konstruktion av gelkammaren är det viktigt att inkludera distanser mellan de två obelagda glasskivorna, särskilt för tjockare vävnadssektioner som PFA-fixerad mushjärna. Brist på distanser kan orsaka vävnadskompression, vilket resulterar i förvrängda bilder och felaktiga data.
Provhomogeniseringen beror på matsmältningstiden med matsmältningsbufferten, liksom matsmältningsbuffertens temperatur och sammansättning. Otillräcklig homogenisering kan orsaka snedvridningar och minskade expansionsfaktorer jämfört med det rapporterade värdet för en given vävnadstyp. Om ofullständig homogenisering misstänks kan matsmältningstiden ökas, särskilt vid tjockare vävnader.
Ett enkelt men avgörande steg är att säkerhetsdatabladet sköljs ut från provet på lämpligt sätt med ett icke-joniskt ytaktivt ämne (t.ex. C12E10) efter homogeniseringssteget. Överbliven SDS kan resultera i suboptimal eller helt hindrad antikroppsbindning. Lyckligtvis, om detta misstänks, kommer ytterligare tvättning och återanvändning av antikropparna ofta att vara en tillfredsställande lösning.
Protokollet ger ett kostnadseffektivt alternativ till nuvarande superupplösningsavbildning och elektronmikroskopitekniker för att undersöka nanoskala strukturer i olika vävnadsprover, inklusive i FFPE kliniska prover. Användningen av metakrolein och värmedenaturering möjliggör efterexpansionsprofilering av alla biomolekyler som bevaras under vävnadsfixering (detta utesluter till exempel avbildning av lipider i FFPE-prover). Vårt protokoll, som en förlängning av ExM-ramverket, är modulärt och sannolikt kompatibelt med andra tekniker som optiska superupplösningsmetoder (STED18, STORM 19) eller iterativ expansionsmikroskopi (iExM)15. Dessa har dock ännu inte testats med det presenterade protokollet, och de stora expansionsfaktorerna kan ge utmaningar, särskilt med fluoroforutspädning. Dessutom kräver provernas stora storlek efter full expansion i vatten försiktighet vid hantering (även om gelén som används här är mer motståndskraftig än tidigare ExM-gelformuleringar med hög expansionsfaktor, såsom tiofaldig robust expansionsmikroskopi (TREx), för att hantera missar17), och kreativa lösningar krävs ibland för att överföra och avbilda dessa helt expanderade geler. Till exempel att använda breda verktyg som ett tunt plastark för att överföra de helt expanderade gelerna snarare än en pensel, eller använda skräddarsydda stora bildplattor (i våra händer betyder detta laserskurna eller 3D-tryckta plattor med stora bitar av # 1.5 täckglas vidhäftade på botten; dessa kan ses i den medföljande videon). Viktigast av allt är att denna metod breddar tillämpligheten av avbildning i nanoskala genom att tillåta avbildning i nanoskala av vanliga biologiska och patologiska provpreparat på konventionella bredfälts- eller konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar följande konkurrerande ekonomiska intressen: Y.Z., A.K., Z.C. och B.R.G. uppfann flera uppfinningar relaterade till Magnify och ExM.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Carnegie Mellon University och D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. och X.R.), National Institutes of Health (N.I.H.) Director's New Innovator Award DP2 OD025926-01 och Kauffman Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W.
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M.
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -B., et al.
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
