Summary
ここでは、最大11倍の拡張に変更された拡張顕微鏡(ExM)の新しいバージョンであるMagnifyは、生体分子クラスの包括的な配列を保存し、幅広い組織タイプと互換性があります。これにより、従来の回折限界顕微鏡を使用して生体分子のナノスケール構造を調べることができます。
Abstract
生体試料のナノスケールイメージングは、疾患の病因の理解を深めることができます。近年、膨張顕微鏡(ExM)は、光学超解像顕微鏡法に代わる効果的で低コストの代替手段であることが実証されています。しかし、ゲル内で異なる生体分子クラスを保持するための特異的でしばしばカスタムのアンカー剤の必要性、および特により大きな拡張因子または保存されたタンパク質エピトープが望まれる場合、ホルマリン固定パラフィン包埋組織などの標準的な臨床サンプルフォーマットを拡張することの難しさによって制限されてきました。ここでは、幅広い組織タイプで最大11倍の堅牢な拡張を実現する新しいExMメソッドであるMagnifyについて説明します。組織とゲルの間の化学アンカーとしてメタクロレインを使用することにより、Magnifyはタンパク質、脂質、核酸などの複数の生体分子をゲル内に保持し、従来の光学顕微鏡で組織の広範なナノスケールイメージングを可能にします。このプロトコルでは、堅牢で亀裂のない組織拡張を確保するためのベストプラクティスと、高度に拡張されたゲルの取り扱いとイメージングのヒントについて説明します。
Introduction
生物学的システムは、手足や臓器からナノスケールのタンパク質レベルまで、構造的な不均一性を示します。したがって、これらのシステムの動作を完全に理解するには、これらのサイズスケール全体で目視検査が必要です。しかし、光の回折限界は、従来の蛍光顕微鏡で~200-300nmより小さい構造を可視化する際に課題を引き起こす。さらに、誘導放出空乏法(STED)、光活性化局在顕微鏡(PALM)、確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、構造化照明顕微鏡法(SIM)などの光学超解像法1,2,3は強力ですが、高価なハードウェアと試薬を必要とし、取得時間が遅く、大量の画像を3Dで画像化する能力が低いことが多いため、独自の課題があります。
膨張顕微鏡4(ExM)は、生体分子を水膨潤性ポリマーゲルに共有結合で固定し、物理的に引き離して従来の光学顕微鏡で分解できるようにすることで、光の回折限界を回避する代替手段を提供します。10年足らず前にExMが最初に発表されて以来、多数のExMプロトコルバリアントが開発されており、これらのプロトコルにより、タンパク質5、6、7、RNA8、9、10、または脂質11、12、13を直接組み込むことができます単一のステップ14または複数の反復ステップ15、16のいずれかで、化学的アンカーを変更するか、サンプルをさらに拡張する(したがって、有効分離を改善する)ことにより、ゲルネットワークに導入します。最近まで、単一のExMプロトコルは、単一の市販のケミカルアンカーでこれら3つの生体分子クラスを保持しながら、1回の拡張ラウンドで~10倍に拡張できる機械的に頑丈なゲルを提供することはできませんでした。
ここでは、メタクロレインを生体分子アンカーとして使用するExM兵器庫に最近追加されたMagnify17を紹介します。メタクロレインは、パラホルムアルデヒドのような組織と共有結合を形成し、さまざまな特異的またはカスタムのアンカー剤を必要とせずに、複数のクラスの生体分子をゲルネットワーク内に保持できるようにします。さらに、この手法は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)臨床サンプルなどの悪名高い困難なサンプルを含む、幅広い組織のスペクトルを最大11倍に拡張できます。このような機械的に硬いサンプルを増殖させる以前の方法では、過酷なプロテアーゼ消化が必要となり、サンプルが膨張した後は目的のタンパク質の抗体標識が不可能でした。対照的に、この手法では、高温変性溶液を使用してFFPE臨床サンプルの拡張を実現し、ゲル内の全タンパク質エピトープを保存し、拡張後のイメージングのターゲットにすることができます(図1)。
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Protocol
動物を含むすべての実験手順は、国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従って実施され、カーネギーメロン大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。ヒト組織サンプルを商業的に入手した。
1.ストック試薬および溶液の調製
注:使用する試薬のリストについては、 材料表 を参照してください。
- ゲル化原液を調製します。これらは、ゲル化工程の直前に組み合わされる。
- モノマーストック溶液(4 g / 100 mL N,N-ジメチルアクリルアミド酸[DMAA]、50 g / 100 mLアクリル酸ナトリウム[SA]、66.7 g / 100 mLアクリルアミド[AA]、0.10 g / 100 mL N、N'-メチレンビスアクリルアミド[ビス]、33 g / 100 mL塩化ナトリウム[NaCl]、1xリン酸緩衝生理食塩水;PBS)を 表1に列挙した成分を用いた。すべての原液を水に溶解または希釈します。モノマーストック溶液は、4°Cで少なくとも3ヶ月間保存することができる。
- 以下のストック溶液を水中で別々に調製する:0.5%(w/w)4-ヒドロキシ-TEMPO(4HT)は組織へのモノマー拡散中のゲル化を阻害し、10%(w/w)テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)は過硫酸アンモニウム(APS)によって開始されるラジカル生成を促進し、10%(w/w)で調製される。
注:ストック溶液は1〜2 mLのアリコートに分配し、4°Cで最大3か月間保存できます。しかしながら、APSはゲル化溶液を調製する直前に作られる。
- SDS 1 g、尿素48.048 g、EDTA 5 mL (0.5M、pH 8)、10x PBS 20 mL、トリス (2 M)、グリシン 0.75 g を組み合わせて、ホモジナイズバッファー (1% w/v S.D.S., 8 M 尿素, 25 mM EDTA, 25 mMP, pH 8, 室温 [R.T.]) を調製します。総容量100mLになるように水を加える。ソリューションは必要に応じてスケールアップまたはスケールダウンでき、R.T.に保存できます。
2.アーカイブおよび新たに調製された臨床組織スライドのための組織調製
注:組織の前処理手順は、標本の調製方法によって異なります。
- ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋(FFPE)臨床サンプルについては、以下の手順に従ってください。
- サンプルを連続した一連の溶液(スライドガラス染色ジャーまたは50 mLコニカルチューブを使用できます):キシレン、95%エタノール、70%エタノール、および50%エタノール、続いて二重脱イオン水に入れます。各溶液を毎回少なくとも3分間2回使用します。.鉗子を使用してスライドを容器に入れ、それぞれの溶液15 mL(サンプルを覆うのに十分)を追加します。キャップ付きの円錐形チューブを室温のシェーカーに水平に置きます。
- 染色され、永久スライドにマウントされたサンプルについては、以下の手順に従ってください。
- スライドをキシレンに短時間置き、かみそりの刃などの適切なツールを使用してカバーガラスを慎重に取り外します。カバーガラスが動かなくなったままの場合は、カバーガラスが緩むまでキシレンのスライドを室温に戻します。
- 次に、サンプルをFFPEサンプルとして処理します(手順2.1.1)。
注:ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色スライドの場合、ヘマトキシリンおよびエオジン染色は拡張プロセス中に失われます。
- 最適切断温度(OCT)溶液中で未固定の凍結組織スライドの場合は、組織をアセトン中で-20°Cで10分間固定してから、サンプルを1x PBS溶液で室温で毎回10分間3回洗浄します。
- 以前に固定した凍結臨床組織スライドについては、スライドを室温で2分間インキュベートしてOCTを溶かし、次に1x PBS溶液で室温で毎回5分間3回洗浄します。
3. パラホルムアルデヒド固定マウス脳の組織作製
- 厚さ30〜50μmのマウス脳切片については、このプロトコルに従ってください。
注:より大きなセクションで成功する可能性がありますが、モノマー溶液の拡散と均質化にはより長い時間が必要になる場合があります。 - 切片が現在1x PBS溶液(例えば、1x PBS中の30%[v/v]グリセロールおよび30%[v/v]エチレングリコール溶液)に保存されていない場合は、6〜24ウェルプレート中の1x PBSで室温で毎回少なくとも10分間3回洗浄します。
- コーティングされていないガラス顕微鏡スライドを入手します。スライドガラスの片面がコーティングされている場合は、濡れた絵筆を使用してコーティングされていない面を確認します(多くの場合、コーティングされた面のラベルはすりガラスでできており、濡れると不透明になります)。
- ペイントブラシを使用して、コーティングされていないスライドを濡らします。マウスの脳組織を絵筆でウェルプレートから取り出し、ローリングモーションを使用してスライド上に慎重に置き、組織が平らであることを確認します。すべての切片が取り付けられるまで、余分なPBSを組織に残します。
注:単一のスライドガラスを複数の組織切片に使用できますが、一度にさらに多くの組織切片をゲル化する場合は(別々のスライドであっても)、完全に乾かないようにさらに注意する必要があります。 - 実験用の紙布を使用して、スライドから余分なPBSの大部分を取り除きます。各組織セクションの周りに小さな液体リングを残しますが、スライドの残りの部分はほとんど乾いたままにします。この残りの液体は、ゲルモノマー溶液が調製されている間、組織を覆います。
4.ゲル化
注:このプロトコルは、この技術で使用するために準備されたすべての組織タイプに適しています。
- 組織切片の両側にスペーサーを塗布して(図2A)、組織の圧迫を防ぎます。そのためには、先端が菱形のペンでカバーガラスを薄く切ってスペーサーを作り、少量の水または1x PBSでスライドに固定するか、少量の瞬間接着剤で固定します。次に、スペーサーを組織の両側にそっと置きます。
- 最終的なゲル化溶液を調製する。一般に、組織切片あたり~200 μLで十分ですが、容量はスライドあたり800 μLを超えてはなりません。これ以上ゲル化する溶液は、波及効果をもたらします。
注:メタクロレインは、生体分子をゲルに固定するために使用されます。しかしながら、別個の固着工程は必要なく、メタクロレインを最終ゲル化溶液に直接添加してもよい。- セクションごとに、以下を順番に組み合わせます:200 μLのモノマー溶液、0.5 μLの0.5%4HTストック溶液(1:400希釈)、0.2〜0.5 μLのメタクロレイン(組織の種類に応じて1:400〜1:1,000希釈;通常、パラホルムアルデヒド[PFA]固定サンプルには1:1,000希釈、FFPE臨床検体には1:400希釈)、2 μLの10%TEMEDストック溶液(1:100希釈)、 5 μLの10%A.P.S.ストック溶液(1:40希釈)。
注意: 使用直前に最終的なゲル化溶液を調製してください。時期尚早のゲル化を防ぐために、APS溶液を最後に追加します。
- セクションごとに、以下を順番に組み合わせます:200 μLのモノマー溶液、0.5 μLの0.5%4HTストック溶液(1:400希釈)、0.2〜0.5 μLのメタクロレイン(組織の種類に応じて1:400〜1:1,000希釈;通常、パラホルムアルデヒド[PFA]固定サンプルには1:1,000希釈、FFPE臨床検体には1:400希釈)、2 μLの10%TEMEDストック溶液(1:100希釈)、 5 μLの10%A.P.S.ストック溶液(1:40希釈)。
- 組織切片から余分な溶液を取り除き、スライドをペトリ皿に入れます。調製したばかりのコールドゲル化溶液をすべてサンプルに加え、組織上で4°Cで30分間インキュベートして、組織への拡散を可能にします。
- 2枚目のコーティングされていないスライドガラスを組織とゲル溶液の上に注意深く置きます。気泡は避けてください(図2B)。
注意: 気泡がティッシュの上に閉じ込められた場合は、ガラスの蓋を慎重に持ち上げて元に戻すことができます。さらに、こぼれたモノマー溶液は重合後にトリミングすることができ、組織に問題を引き起こすことはありません。 - 重合が完了していることを確認します。この重合は2つの方法で行うことができ、それぞれが同様の結果をもたらす。まず、加湿環境(湿らせたペーパータオルで閉じたペトリ皿など)で37°Cでサンプルを一晩インキュベートします。あるいは、より迅速に重合するには、加湿雰囲気中でサンプルを37°Cで2時間インキュベートした後、60°Cで1時間インキュベートします。
5. サンプルの消化と組織拡張
注:このプロトコルは、すべての組織タイプに適しています。
- 目の保護具を着用し、ゲル化チャンバーの2つのスライドガラスの間にかみそりの刃をスライドさせて分離します。
注意: スライドガラスは非常に簡単に分離するはずです。ゲルの異なる部分が両方のスライドに付着している場合は、絵筆を使用してゲルを一方または他方に導くことができます。重合中にゲルが特に乾燥している場合は、1x PBSをゲルチャンバーの外側に塗布できますが、組織が均質化される前にゲルが膨張し、ひび割れが発生するため、ゲルを完全に沈めないでください。 - ボリュームを最小限に抑えるために、組織の周りのブランクジェルをトリミングします。ゲルを非対称に切断すると、サンプルが完全に透明になるため、均質化後のゲルの配向を追跡できます。
- 組織を含むゲルをかみそりの刃でスライドからそっと持ち上げ、絵筆で2 mLの遠沈管にそっと移します。
- 80°Cに予熱したホモジナイズバッファー(表2)でチューブの上部を満たします。
- サンプルを振とうしながら80°Cで8時間(PFA固定マウス脳の場合)または60時間(ほとんどのFFPE臨床サンプル; 表3を参照)インキュベートします。
注:均質化時間は、組織の種類と固定方法によって異なります。これらの条件の多くはすでに検証されていますが、他の条件については最適化が必要な場合があります。 - 遠心チューブの内容物を6ウェルプラスチック細胞培養プレートのシングルウェルに注ぎます。
- トランスファーピペットで変性バッファーを除去します。
- ヒドロゲルから残りのSDSを完全に除去するには、以下のように1%非イオン性界面活性剤(C12E10)溶液でサンプルを洗浄します:室温で毎回10分間少なくとも3回;60°Cで60分間;その後、室温で毎回10分間さらに3回洗浄します。
- サンプルを1x PBS + 0.02%アジ化ナトリウムに4°Cで保存し、膨張後の染色とイメージングを行う必要があります。
注:この時点で、サンプルは組織の種類に応じて、各次元で~3-4.5倍大きくする必要があります。
6. 拡張後の生体分子プロファイリング
- 抗体染色
注:これは、一般的な免疫蛍光(IF)/免疫組織化学(I.H.C.)染色プロトコルに従います。使用される一次抗体および二次抗体の量は、製造業者が提案する濃度、または特定の実験のための最適化によって異なります。個々のバッファーは、ユーザーの裁量で置き換えることができます。- サンプルを6ウェル細胞培養プレートの単一ウェルに入れ、膨張したサンプルをR.T.の1x PBSで毎回10分間3回洗浄し、液体をピペットで移す。
- オプションのブロッキングステップ(例えば、1x PBS中の3%ウシ血清アルブミン/0.1%Triton-X100)を室温で少なくとも1時間、または4°Cで一晩実行します。
- 一次抗体を染色バッファー(例えば、0.1% Triton-X100 1x PBS または 9x PBS/1% TritonX/10 mg/L ヘパリン)中で、37 °Cで一晩インキュベートします。 サンプルサイズに応じて、0.5〜2 mLがゲルを適切に覆う必要があります。
- サンプルを室温の1x PBSで毎回少なくとも10分間3回洗浄します。
- 対応する二次抗体を、選択した染色バッファー中で37°Cで3時間インキュベートします。
- サンプルを室温の1x PBSで毎回少なくとも10分間3回洗浄します。
- NHSエステル汎タンパク質染色
- サンプルを6ウェルプレートに入れて、1〜2 mLのポリエチレングリコール(PEG 200)をサンプルに注ぎます(完全に覆うのに十分です)。
注意: 組織は収縮し、元の拡張前のサイズ(またはそれに近いサイズ)に戻る必要があります。 - 13.3-80 μg/mLに希釈した蛍光色素結合NHSエステルで、1-2 mLの染色バッファー(例えば、1x PBS、2x S.S.C.、または100 mM重炭酸ナトリウム溶液)中でR.T.で3時間染色します。
- サンプルを室温の1x PBSで毎回少なくとも10分間3回洗浄します。
- サンプルを6ウェルプレートに入れて、1〜2 mLのポリエチレングリコール(PEG 200)をサンプルに注ぎます(完全に覆うのに十分です)。
- 脂質染色
注:拡張後脂質染色は、固定プロセス中に脂質が失われるため、FFPE臨床サンプルには有効ではありません。- サンプルを室温の1x PBSで毎回少なくとも10分間3回洗浄します。
- 2 mLの0.1%TritonX-100/1x PBSで200倍に希釈した従来の親油性色素(DiO、DiI、またはDiD)を室温で72〜96時間塗布します。
- 1x PBSで少なくとも3回洗ってください
- 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)
- ホモジナイズしたゲルサンプルを、60°Cに30分間予熱したハイブリダイゼーションバッファーに入れます。
- FISH用のハイブリダイゼーションバッファーを調製します:2x S.S.C. (300 mM NaCl、30 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.0)、10%(v/v)デキストラン硫酸塩、20%(v/v)エチレンカーボネート、および0.1%(v/v)Tween20を組み合わせます。
- ゲルサンプルを、標的遺伝子に対する10 pM(オリゴあたり)のFISHプローブを含むハイブリダイゼーションバッファー(10 kbあたり少なくとも20プローブ)で45°Cで一晩インキュベートします。
- ストリンジェンシーウォッシュバッファー(2x S.S.C.および0.1%Tween20)で2回、45°Cで毎回15分間洗浄します。
- ストリンジェンシーウォッシュバッファーでさらに2回、37°Cで毎回10分間洗浄します。
- 最後に、1x PBSで少なくとも3回、室温で毎回10分間洗浄します。
- サンプルは、1x PBS + 0.02%アジ化ナトリウム(4°C)でイメージングまたは保存する準備ができています。
- 完全な組織拡張と蛍光イメージング
注:Magnifyで達成可能な拡張係数は、組織の種類と拡張方法によって異なります(完全な要約は 表3にあります)。ただし、一般的な推定値として、Magnifyサンプルは、1x PBSで3〜4.5倍、ddH2Oで1:50に希釈されたPBSで5〜7倍、ddH2Oで8〜11倍に拡大します。イメージングに最適な拡張係数は、各実験のニーズによって異なります。膨張係数は非常に調整可能であり、さまざまなスケールでのイメージングのために、単一のサンプルを何度も拡大および縮小できます。- PBSで4倍に拡大したサンプルを、ペイントブラシを使用してガラス底の6ウェルイメージングプレートに移動します。さらに拡大したサンプルを細かく切るか、柔軟なプラスチックの薄い部分で大きなガラス底のイメージングプレートにそっと入れて移動します。
- 従来の広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡、または選択した別のイメージングシステムを使用して蛍光イメージングを実行します。紙の実験布でゲルの周りの余分な液体を取り除くと、イメージング中のゲルの動きを防ぐことができます。ゲルは、イメージング前にガラス表面に0.1%ポリ-L-リジンを塗布することによって固定化することもできます。
注:ポリ-L-リジンを適用すると、接触時にゲルが完全に動かなくなります。このため、ゲルを折りたたんだり伸ばしたりせずにガラスに塗布するように注意する必要があります。さらに、ポリ-L-リジンでコーティングされたガラス上でゲルを完全に乾燥させると、除去が困難になる可能性があるため、ゲルを完全に乾燥させたり、ポリ-L-リジンでガラスに付着したままゲルをPBSで収縮させたりしないでください。 - イメージング後、蛍光シグナルの劣化によりサンプルをddH2Oに長期間保存することは推奨されないため、毎回少なくとも3回の洗浄で1x PBSでサンプルを収縮させます。特に、親油性色素で染色された完全に膨張したサンプルは、水中での色素の解離を防ぐために、できるだけ膨張時間の近くに画像化する必要があります。
- サンプルを1x PBS + 0.02%アジ化ナトリウム中、4°Cで保存します。
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Representative Results
プロトコルが正常に完了すると(図1)、サンプルは熱変性後に透明で平らに見えます。折り畳みやしわは、均質化が不完全であることを示しています。正常に拡張されたサンプルは、1x PBSで拡張する前よりも3〜4.5倍大きくなり、ddH2Oで完全に拡張すると8〜11倍大きくなります。 図 3 は、このプロトコルを使用して処理され、8倍以上に拡大することに成功した厚さ5μmのFFPEヒト腎臓サンプルの膨張前および膨張後の画像の例を示しています。最初に組織をDAPIとともにACTN4の抗体で染色し、核DNAを視覚化しました。次に、標本をスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して画像化しました(図3A)。組織は、同じ標的の拡大後染色を含む上記のプロトコルに従って処理され、再イメージングの前に水中で完全に拡張されました(図3B)。熱変性後、 図4に示すように、タンパク質以外の生体分子も染色して画像化することができます。親油性色素は、マウス脳内の細胞およびミトコンドリア膜構造を明らかにするために適用することができる(図4A)。さらに、核酸は、 図4B、Cに示されるFFPE正常ヒトリンパ節組織におけるように、FISHを介して画像化され得る。
図5 は、サンプルが適切に均質化されていない場合に起こりうる結果を示しています。拡大後、組織をACTN4およびビメンチンの抗体で染色し、DAPIとともに核DNAを視覚化し、小麦胚芽凝集素(WGA)を視覚化して炭水化物を標識した。組織をPBSで3.5倍に拡大させた後、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いてイメージングした。1つの腎臓切片(図5A、C)では、糸球体の亀裂のない拡張が見られます。別のセクション(図5B、D)では、組織に亀裂がはっきりと見られます。
図1:拡大ワークフローの概略図。臨床的にアーカイブされた組織スライドの前処理は、最初に保存フォーマットに基づいて実行されます。フリーフローティングパラホルムアルデヒド固定切片は、PBSで洗浄するだけで済みます。次に、サンプルをメタクロレインを含むゲルモノマー溶液中でインキュベートして、生体分子をヒドロゲルに固定します。その場重合は、尿素、SDS、およびEDTAによる熱変性の前に行われます。次に、サンプルを徹底的に洗浄し、従来の免疫染色プロトコル、FISHプロトコル、または親油性色素を使用して染色します。次に、サンプルを純水中で膨張させてからイメージングします。この図はKlimas et al.17から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:組織サンプルゲル化チャンバー 。 (A)組織の両側に、ゲルモノマー溶液を4°Cで拡散させる前に、2枚の#1.0カバーガラスなどの2つのスペーサーを配置します。 圧縮を防ぐために、スペーサーは組織スライスよりも厚くする必要があります。(b)2番目のスライドガラスなどの蓋を使用して、37°Cで重合する前にサンプルを覆います。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ヒト腎臓組織切片の拡張前画像の例。 (A)60倍の倍率(1.4 NA)で撮影した画像と、(B)40倍の倍率で撮影したMagnifyを使用した拡張後の同じ視野の画像(1.15 NA、拡大倍率:8.15倍)。マゼンタ、ダピ;黄色、ACTN4。拡張後の画像の最大強度は、25フレームにわたって投影されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:Magnifyによる代替生体分子染色戦略 。 (a)(i および iv)完全に拡張されたマウス脳組織のNHSエステル汎タンパク質標識。(ii および v)同じマウス脳組織の親油性色素(DiD)標識。(iii および vi)チャネルがマージされました。(b)DNA FISHを用いたFFPE正常ヒトリンパ節組織を拡大する。膨張係数:1x PBSで3.5倍。ホワイト、ダピ;マゼンタ、セリン/スレオニンキナーゼ1遺伝子;青色、APC / Cアクチベータータンパク質CDH1遺伝子;黄色、有人衛星シーケンスS4。(C) Bに関連付けられた個々のチャネル。すべての画像は、40倍の倍率(1.15 NA)のスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して取得されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:厚さ5μmのFFPE腎臓サンプルの代表的な結果。 (A)亀裂のない膨張。ホワイト、ダピ;黄色、ビメンチン;シアン、α-アクチニン4;マゼンタ、小麦胚芽凝集素。(B)ひび割れを呈する拡張腎臓切片。クラッキング、歪み、およびラベル付きターゲットの損失は、不十分なアンカーおよび/または均質化の結果である可能性があります。(C,D)それぞれ A と B のボックス化された領域の拡大画像。すべての画像は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して、10倍(A、B、0.45 NA)または60倍(C、D、1.2 NA)の倍率で取得しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:ゲルモノマー溶液組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:ホモジナイズバッファー組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:検証された組織のメタクロレインおよびホモジナイズ条件の要約。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、単一の化学的アンカーで複数の生体分子を保持し、熱変性により困難なFFPE臨床検体を最大11倍まで拡張できるExMバリアントであるMagnifyプロトコル17を紹介します。このプロトコルを他のExMプロトコルと区別する主な変更点には、完全に拡張しても機械的に堅牢なままである再製剤化ゲルの使用、および生体分子アンカーとしてのメタクロレインの使用が含まれます。このプロトコルの最も重要なステップは次のとおりです:1)最終的なゲル溶液の組成。2)ゲル化工程のタイミング;3)ゲル化チャンバーのセットアップ。4)サンプル均質化のパラメータ。5)膨張後染色前のサンプルからのSDSの十分な洗浄。
このプロトコルの最も重要なパラメータは、最終的なゲル化溶液の組成、特に生体分子アンカーメタクロレインの濃度です。異なる組織タイプを拡張するには、異なるメタクロレイン濃度が必要であり(表3)、この値が拡張されるサンプルによく一致するように注意する必要があります。メタクロレインによるオーバーアンカーは、拡張因子の減少と拡張後染色に利用可能なエピトープの損失をもたらす可能性がありますが、特にFFPE臨床サンプルでのアンダーアンカーは、組織の亀裂や歪みを引き起こす可能性があります。したがって、メタクロレイン濃度は、未検証の組織タイプに対して最適化する必要がありますが、最適な濃度は、ここに示されている範囲に近いか、範囲内にある可能性があります。このプロトコルは、まだ検証されていない組織であっても、ほとんどの組織タイプで機能すると予想されますが、骨を含むサンプルでは機能しないことが知られています。
メタクロレイン以外にも、重要なゲル成分(4HTまたはTEMED)の濃度を誤ると、ゲル化が不完全またはまったくない(過剰な4HT)か、早期のゲル化(過剰なTEMED、4HTの低下、または他の成分の前にAPSを添加する)のいずれかが原因で、実験が完全に失敗する可能性があります。早期ゲル化を防ぐために、サンプルとゲルを4°Cに保ち、30分間空気にさらし、拡散プロセスが完了した後、サンプルのみを覆い、加湿チャンバーに37°Cで配置する必要があります。
ゲルチャンバーを構築する場合、2つのコーティングされていないスライドガラスの間にスペーサーを含めることは、特にPFA固定マウス脳などのより厚い組織切片にとって重要である。スペーサーが不足すると、組織が圧迫され、画像が歪んだり、データが不正確になったりする可能性があります。
サンプルの均質化は、消化バッファーによる消化時間、消化バッファーの温度、組成によって異なります。不十分な均質化は、特定の組織タイプについて報告された値と比較して、歪みおよび拡張係数の低下を引き起こす可能性があります。不完全な均質化が疑われる場合、特により厚い組織の場合には、消化時間が長くなる可能性があります。
単純でありながら重要なステップは、ホモジナイズステップ後に非イオン性界面活性剤(C12E10など)でサンプルからSDSを適切に洗い流すことです。SDSが残っていると、抗体結合が最適ではないか、完全に妨げられる可能性があります。幸いなことに、これが疑われる場合、抗体のさらなる洗浄と再適用が満足のいく解決策になることがよくあります。
このプロトコルは、FFPE臨床検体を含むさまざまな組織サンプルのナノスケール構造を調べるための、現在の超解像イメージングおよび電子顕微鏡技術に代わる費用効果の高い代替手段を提供します。メタクロレインと熱変性を使用することで、組織固定中に保存された生体分子の拡張後のプロファイリングが可能になります(これにより、たとえばFFPEサンプル中の脂質のイメージングができなくなります)。ExMフレームワークの拡張としての私たちのプロトコルはモジュール式であり、光学超解像法(STED18、STORM 19)や反復膨張顕微鏡(iExM)15などの他の技術と互換性がある可能性があります。しかし、これらは提示されたプロトコルではまだテストされておらず、大きな膨張因子は、特に蛍光色素の希釈で課題を提示する可能性があります。さらに、水中で完全に膨張した後のサンプルのサイズが大きいため、取り扱いに注意が必要であり(ただし、ここで使用されるゲルは、10倍の堅牢な膨張顕微鏡(TREx)などの以前の高膨張係数ExMゲル製剤よりも弾力性があり、ミスキュー17を処理するために、これらの完全に膨張したゲルを転写して画像化するために創造的なソリューションが必要になる場合があります。たとえば、絵筆ではなく、薄いプラスチックシートなどの幅の広い道具を使用して完全に拡張されたゲルを転写したり、カスタムメイドの大きなイメージングプレートを使用したりします(私たちの手では、これはレーザーカットまたは3Dプリントされたプレートを意味し、大きな#1.5カバーガラスが底に接着されています;これらは添付のビデオで見ることができます)。最も重要なことは、この方法は、従来の広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡で一般的な生物学的および病理学的サンプル調製物のナノスケールイメージングを可能にすることにより、ナノスケールイメージングの適用可能性を広げることです。
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Disclosures
著者らは、次の競合する金銭的利益を宣言します:Y.Z.、A.K.、Z.C.、およびB.R.G.は、MagnifyとExMに関連するいくつかの発明を発明しました。
Acknowledgments
この研究は、カーネギーメロン大学とD.S.F.慈善財団(Y.Z.およびX.R.)、国立衛生研究所(N.I.H.)の支援を受けました。ディレクターズニューイノベーターアワードDP2 OD025926-01、およびカウフマン財団。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
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