Artigo de método

Modelo de Parada Cardíaca em Camundongos para Monitoramento por Imagem e Fisiologia Cerebral durante Isquemia e Ressuscitação

DOI:

10.3791/65340

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14 de abril de 2023

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1Multidisciplinary Brain Protection Program, Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Anesthesiology and Pain Management, UT Southwestern University Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo demonstra um modelo único de parada cardíaca por asfixia em camundongos que não requer compressão torácica para ressuscitação. Esse modelo é útil para monitorar e obter imagens da dinâmica da fisiologia cerebral durante a parada cardíaca e a ressuscitação.

Resumo

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A maioria dos sobreviventes de parada cardíaca (PCR) experimenta graus variados de déficits neurológicos. Para entender os mecanismos que sustentam a lesão cerebral induzida por CA e, posteriormente, desenvolver tratamentos eficazes, a pesquisa experimental de CA é essencial. Para este fim, alguns modelos de AC de mouse foram estabelecidos. Na maioria desses modelos, os camundongos são colocados em decúbito dorsal para realizar compressão torácica para ressuscitação cardiopulmonar (RCP). No entanto, esse procedimento de ressuscitação torna desafiador o imaginário/monitoramento em tempo real da fisiologia cerebral durante a AC e a ressuscitação. Para obter esse conhecimento crítico, o presente protocolo apresenta um modelo de AC por asfixia em camundongos que dispensa a etapa de RCP por compressão torácica. Esse modelo permite o estudo de alterações dinâmicas no fluxo sanguíneo, estrutura vascular, potenciais elétricos e oxigênio do tecido cerebral desde a linha de base pré-AC até a reperfusão precoce pós-AC. É importante ressaltar que esse modelo se aplica a camundongos envelhecidos. Assim, espera-se que este modelo de CA em camundongos seja uma ferramenta crítica para decifrar o impacto da AC na fisiologia cerebral.

Introdução

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A parada cardíaca (PCR) continua sendo uma crise de saúde pública mundial1. Mais de 356.000 casos de CA fora do hospital e 290.000 casos de CA intra-hospitalar são relatados anualmente apenas nos EUA, e a maioria das vítimas de CA tem mais de 60 anos. Notadamente, os comprometimentos neurológicos pós-PCR são comuns entre os sobreviventes, e representam um grande desafio para o manejo da PCR2,3,4,5. Para entender as alterações patológicas cerebrais pós-PCR e seus efeitos nos desfechos neurológicos, várias técnicas de monitorização neurofisiológica e de tecido cerebral têm sido aplicadas em pacientes 6,7,8,9,10,11,12. Usando espectroscopia no infravermelho próximo, o monitoramento cerebral em tempo real também foi realizado em ratos CA para predizer desfechos neurológicos13.

No entanto, em modelos murinos de AC, esta abordagem de imagem tem sido complicada pela necessidade de compressões torácicas para restaurar a circulação espontânea, o que sempre envolve movimentação física substancial e, portanto, dificulta procedimentos de imagem delicados. Além disso, os modelos de AC são normalmente realizados com camundongos em decúbito dorsal, enquanto os camundongos devem ser voltados para a posição prona para muitas modalidades de imagem cerebral. Assim, um modelo de camundongo com movimento corporal mínimo durante a cirurgia é necessário em muitos casos para realizar imagens/monitoramento em tempo real do cérebro durante todo o procedimento de PCR, desde o pré-AC até o pós-ressuscitação.

Zhang e col. relataram um modelo de AC em camundongos que poderia ser útil para imagens cerebrais14. Em seu modelo, a AC foi induzida por injeções em bolus de vecurônio e esmolol seguidas pela interrupção da ventilação mecânica. Eles mostraram que, após 5 minutos de AC, a ressuscitação poderia ser obtida pela infusão de uma mistura de ressuscitação. Notavelmente, no entanto, a parada circulatória em seu modelo ocorreu apenas cerca de 10 s após a injeção de esmolol. Assim, esse modelo não recapitula a progressão da AC induzida por asfixia em pacientes, incluindo hipercapnia e hipóxia tecidual durante o período pré-parada.

O objetivo geral do procedimento cirúrgico atual é modelar a asfixia clínica CA em camundongos seguida de ressuscitação sem compressões torácicas. Esse modelo de AC, portanto, permite o uso de técnicas complexas de imagem para estudar a fisiologia cerebral emcamundongos15.

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Protocolo

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Todos os procedimentos aqui descritos foram conduzidos de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) para o cuidado e uso de animais em pesquisa, e o protocolo foi aprovado pelo Duke Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC). Camundongos machos e fêmeas C57BL/6 com idades entre 8-10 semanas de idade foram utilizados para o presente estudo.

1. Preparo cirúrgico

  1. Pese um mouse em uma balança digital e coloque-o em uma caixa de indução de anestesia de plexiglass 4 x 4 x 7.
  2. Ajustar o vaporizador de anestesia para isoflurano a 5%, o medidor de fluxo de oxigênio para 30 e o medidor de fluxo de nitrogênio para 70 (ver Tabela de Materiais).
  3. Retirar o animal da caixa de indução e colocá-lo em decúbito dorsal no banco cirúrgico quando sua frequência respiratória tiver diminuído para 30-40 respirações por minuto.
  4. Puxe a língua com pinça romba e segure-a com a mão não dominante. Use a mão dominante para inserir um laringoscópio (ver Tabela de Materiais) na boca do mouse e visualizar a corda vocal.
  5. Use a mão não dominante para inserir um fio-guia e cateter intravenoso 20G na boca. Introduza suavemente o fio-guia na traqueia.
  6. Empurre o cateter para dentro da traqueia até que a parte da asa do cateter esteja uniforme com a ponta do nariz.
    NOTA: Não intubar um camundongo que não esteja totalmente anestesiado, pois isso pode lesionar a traqueia e causar sangramento nas vias aéreas.
  7. Conecte o camundongo intubado a um ventilador de pequenos animais (ver Tabela de Materiais) e reduza o isoflurano para 1,5%.
  8. Insira o peso corporal do mouse no painel de controle do ventilador para determinar o volume corrente e a frequência respiratória.
  9. Mantenha o rato numa posição supina sob uma lâmpada de calor e mantenha a temperatura retal a 37 °C com um controlador de temperatura.
  10. Raspar as áreas inguinais, desinfetar a área cirúrgica pelo menos três vezes com iodo e álcool (ver Tabela de Materiais) e cobrir a área com um campo cirúrgico estéril.
  11. Aplicar pomada ocular em ambos os olhos e administrar 5 mg/kg de carprofeno por via subcutânea antes da cirurgia.
  12. Abra o pacote de instrumentos estéreis para cirurgia. Faça uma incisão cutânea de 1 cm com tesoura cirúrgica para acessar as artérias femorais de ambos os lados. Dissecar e ligar a artéria femoral distal com um único fio de fio de fio de seda 4-0 (ver Tabela de Materiais) e aplicar uma gota de lidocaína.
  13. Aplicar um clipe de aneurisma na artéria femoral proximal e fazer um pequeno corte na artéria distal ao clipe. Insira um cateter de polietileno 10 (PE-10, ver Tabela de Materiais) nas artérias femorais esquerda e direita.
    NOTA: A linha arterial esquerda é usada para monitoramento da pressão arterial, enquanto a direita é usada para retirada de sangue e infusão de mistura de ressuscitação.
  14. Injetar 50 μL de solução salina heparinizada 1:10 em cada linha arterial para evitar a coagulação na linha.
  15. Vire o mouse para a posição prona e monte-o em uma estrutura de cabeça estereotáxica.
  16. Conecte três eletrodos de agulha (vermelho, verde e preto) ao braço esquerdo, à perna esquerda e ao braço direito para monitoramento do eletrocardiograma (ECG, consulte Tabela de Materiais).
  17. Cole uma sonda de fibra plástica flexível sobre o crânio temporal intacto através de uma incisão cutânea de 0,5 cm para monitoramento do fluxo sanguíneo cerebral. Esta etapa é opcional.
  18. Faça a barba no topo da cabeça, desinfete a área cirúrgica pelo menos três vezes com iodo e álcool e cubra a área com um recalque cirúrgico estéril.
  19. Corte uma incisão de pele mediana de 2,5 cm e use quatro pequenos afastadores para expor toda a superfície do crânio para imagens cerebrais.
  20. Coloque um imageador de monitoramento (por exemplo, um imageador de contraste de manchas a laser, consulte Tabela de Materiais) acima da cabeça.
    NOTA: Algumas gotas de soro fisiológico podem ser adicionadas à superfície do crânio para facilitar a imagem de contraste com manchas a laser.

2. Indução de parada cardíaca

  1. Encha uma seringa de plástico de 1 ml com 26 μL da solução-mãe do cocktail de reanimação.
    NOTA: Cada mililitro desta solução contém 400 μL de 1 mg/ml de epinefrina, 500 μL de bicarbonato de sódio a 8,4%, 50 μL de 1.000 U/ml de heparina e 50 μL de cloreto de sódio a 0,9% (ver Tabela de Materiais).
  2. Aguarde até que a temperatura corporal atinja 37 °C. Ajuste o medidor de oxigênio a 100% para oxigenar o sangue por 2 min.
  3. Retirar o sangue arterial oxigenado até 200 μL através da artéria femoral direita para a seringa de plástico preparada contendo 26 μL de solução de coquetel de ressuscitação.
  4. Desligue o oxigênio e aumente o nitrogênio para 100% para induzir a anóxia.
    NOTA: Após aproximadamente 45 s, o coração deixará de funcionar e a frequência cardíaca diminuirá rapidamente, indicando o início da AC. Após cerca de 2 min de privação de oxigênio, a monitorização do ECG indicará uma assistolia, e não haverá pressão arterial sistêmica mensurável e fluxo sanguíneo cerebral desprezível.
  5. Desligue o ventilador, o vaporizador de isoflurano, o controlador de temperatura e o medidor de vazão de nitrogênio. Ajustar o oxigênio a 100% na preparação para a ressuscitação.

3. Procedimento de ressuscitação

  1. Ligue o ventilador 8 minutos após o início da AC.
  2. Iniciar imediatamente a infusão do sangue oxigenado retirado misturado com o cocktail de ressuscitação na circulação sanguínea através da artéria femoral direita em 1 minuto.
    NOTA: A infusão leva a um aumento gradual da frequência cardíaca e à restauração da perfusão sanguínea; eventualmente, o retorno da circulação espontânea (ROSC) é alcançado.

4. Recuperação pós-AC

  1. Coloque o mouse em decúbito dorsal após removê-lo do quadro estereotáxico e remova os cateteres PE-10 das artérias femorais.
  2. Aplicar bupivacaína a 0,25% na incisão da pele e suturar as incisões cutâneas com fio de náilon 6-0 (ver Tabela de Materiais). Aplique pomada antibiótica na superfície da incisão da pele.
  3. Desconecte o ventilador do mouse quando a respiração espontânea for restaurada.
  4. Transfira o rato para uma câmara de recuperação com uma temperatura controlada de 32 °C.
  5. Após 2 h de recuperação, extubar o rato e retornar à gaiola de casa. Injetar 0,5 mL de soro fisiológico por via subcutânea para evitar a desidratação.

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Resultados

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Para induzir AC, o camundongo foi anestesiado com isoflurano a 1,5% e ventilado com nitrogênio a 100%. Essa condição levou a bradicardia grave em 45 s (Figura 1). Após 2 min de anóxia, a frequência cardíaca reduziu drasticamente (Figura 2), a pressão arterial diminuiu abaixo de 20 mmHg e o fluxo sanguíneo cerebral cessou completamente (Figura 1). Com o desligamento do isoflurano, a temperatura corporal deixou de ser controlada e cai...

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Discussão

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Em estudos experimentais de AC, asfixia, injeções de cloreto de potássio ou fibrilação ventricular derivada de corrente elétrica têm sido usadas para induzir CA 16,17,18,19,20,21,22,23. Normalmente, a RCP é necessária para ressuscitação nesses modelos de AC...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Os autores agradecem a Kathy Gage por seu apoio editorial. Este estudo foi financiado pelo Departamento de Anestesiologia (Duke University Medical Center), bolsa da American Heart Association (18CSA34080277) e subsídios do National Institutes of Health (NIH) (NS099590, HL157354, NS117973 e NS127163).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AdrenalinaPar PharmaceuticalNDC 42023-159-01
Cotonetes de álcoolBD326895
Animal Bio AmpADInstrumentsFE232
BP transdutorADInstrumentsMLT0699
Bridge AmpADInstrumentsFE117
Injeção de heparina sódica, USPFresenius KabiNDC 63323-540-05
IsofluranoCovetrusNDC 11695-6777-2
Monitor de perfusão Doppler a laserMoor InstrumentsmoorVMS-LDF1
Sistema de imagem de manchas a laserRWDRFLSI III
Pomada lubrificante para os olhosBausch + Lomb339081
Micro clipeRobozRS-5431
Sonda retal de ratoPhysitempRET-3
Eléctrodo de agulhaADInstrumentsMLA121329 Ga, soquete de 1,5 mm
NitrogénioAirgasUN1066
Fibra plástica ópticaMoor InstrumentsPOF500
OtoscópioWelchallyn7282,5 mm Espéculo
OxigénioAirgasUN1072
Tubo PE-10BD427401Tubo de polietileno
IodopovidonaCVS955338
PowerLab 8/35ADInstruments
Rimadyl (carprofeno)Zoetis6100701Injetável 50 mg/ml
Ventilador para pequenos animaisKent ScientificRoVent Jr.
Controlador de temperaturaPhysitempTCAT-2DF
Triplo antibiórico e alívio da dorCVSNDC 59770-823-56
VaporizadorRWDR583S
0,25% bupivacaínaHospiraNDC 0409-1159-18
0,9% de crirido de sódioUTI MédicaNDC 0990-7983-03
1 mL de plástico seringaBD309659
4-0 sutura de sedaLookSP116Sutura de nylon 6-0 de seda trançada preta
Ethilon1698G
8,4% bicarbonato de sódio Inj., USPHospiraNDC 0409-6625-02
Cateter IV 20 GBD38153420GA 1,6 IN
30 G Agulha PrecisionGlideBD30510630 G X 1/2

Referências

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