Modelo de Oclusão Transcraniana da Artéria Cerebral Média Modificada para Estudo de Resultados de Acidente Vascular Cerebral em Camundongos Idosos

Resumo

Este protocolo demonstra um modelo único de acidente vascular cerebral em camundongo com um infarto de tamanho médio e uma excelente taxa de sobrevida. Esse modelo permite que os pesquisadores pré-clínicos do AVC estendam a duração da isquemia, usem camundongos envelhecidos e avaliem os resultados funcionais a longo prazo.

Resumo

Na pesquisa experimental de AVC, a oclusão da artéria cerebral média (ACM) com um filamento intraluminal é amplamente utilizada para modelar o acidente vascular cerebral isquêmico em camundongos. O modelo de MCAO filamentar tipicamente exibe um infarto cerebral maciço em camundongos C57Bl/6 que às vezes inclui tecido cerebral no território suprido pela artéria cerebral posterior, o que é em grande parte devido a uma alta incidência de atresia da artéria comunicante posterior. Este fenômeno é considerado um dos principais contribuintes para a alta taxa de mortalidade observada em camundongos C57Bl/6 durante a recuperação de AVC a longo prazo após MCAO filamentar. Assim, muitos estudos de AVC crônico exploram modelos de MCAO distais. No entanto, esses modelos geralmente produzem infarto apenas na área do córtex e, consequentemente, a avaliação de déficits neurológicos pós-AVC poderia ser um desafio. Este estudo estabeleceu um modelo de MCAO transcraniana modificada no qual a MCA no tronco é parcialmente ocluída permanente ou transitoriamente através de uma pequena janela craniana. Como o local de oclusão é relativamente próximo à origem da ACM, esse modelo gera dano cerebral tanto no córtex quanto no estriado. A extensa caracterização deste modelo demonstrou uma excelente taxa de sobrevida a longo prazo, mesmo em camundongos envelhecidos, bem como déficits neurológicos prontamente detectáveis. Portanto, o modelo de camundongo MCAO descrito aqui representa uma ferramenta valiosa para a pesquisa experimental de AVC.

Introdução

Quase 800.000 pessoas sofrem um acidente vascular cerebral nos EUA a cada ano, e a maioria desses acidentes vasculares cerebrais é de natureza isquêmica¹. A restauração oportuna do fluxo sanguíneo cerebral com ativador do plasminogênio tecidual (tPA) e/ou trombectomia é atualmente o tratamento mais eficaz para pacientes com AVC; entretanto, a recuperação completa das funções neurológicas em longo prazo é rara ^2,3. Assim, a busca por novas terapias para AVC que visem a melhora funcional é uma área intensa de pesquisa que requer modelos animais clinicamente relevantes de AVC.

O modelo de AVC isquêmico mais comum em roedores utiliza a oclusão intraluminal da artéria cerebral média (ACM) para induzir acidente vascular cerebral. Nesse modelo, desenvolvido inicialmente por Zea Longa em 1989, um filamento de náilon é introduzido na artéria carótida interna (ACI) para bloquear o fluxo sanguíneo para a artéria cerebral média (ACM)⁴. No entanto, esse modelo apresenta limitações. Primeiro, quando o filamento é inserido na ACI, o fluxo sanguíneo para a artéria cerebral posterior (ACP) também pode ser parcialmente bloqueado, especialmente em camundongos. Criticamente, a artéria comunicante posterior (PcomA), uma pequena artéria que conecta a circulação cerebral anterior e posterior, é frequentemente subdesenvolvida em algumas cepas de camundongos, como a C57Bl/6, a cepa predominantemente usada em pesquisas experimentais de AVC. Acredita-se que essa patência do PComA contribua para a variabilidade no tamanho da lesão em camundongos após^AVE5. De fato, quando o fluxo sanguíneo para a ACP cai vertiginosamente durante a ACM, e a PcomA é incapaz de fornecer fluxo sanguíneo colateral suficiente, o infarto do AVC pode se expandir para o território da ACP. Além disso, nesse modelo, uma longa duração de isquemia leva a uma maior chance de mortalidade em camundongos. Consequentemente, uma curta duração MCAO de 30-60 min é tipicamente usada em camundongos. No entanto, a maioria dos pacientes com AVC experimenta algumas horas de isquemia antes do tratamento de reperfusão. Assim, um modelo de AVC em camundongo com duração prolongada de isquemia é de alta relevância clínica.

O objetivo geral deste procedimento é modelar o acidente vascular cerebral isquêmico em camundongos com infarto de tamanho médio e excelente taxa de sobrevida. Este modelo transcraniano de MCAO aborda atributos críticos do AVC clínico, uma vez que isquemia prolongada pode ser realizada, e camundongos idosos toleram bem esse modelo, permitindo a avaliação em longo prazo da recuperação funcional.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste trabalho são conduzidos de acordo com as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais em pesquisa, e o protocolo foi aprovado pelo Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). Camundongos C57Bl/6 machos jovens (8-10 semanas de idade) e com idade (22 meses) foram utilizados para o presente estudo. Uma visão geral desse protocolo é ilustrada na Figura 1.

1. Preparo cirúrgico

1. Examine o rato em busca de anormalidades grosseiras e déficits comportamentais.
   OBS: Antes da cirurgia, é importante que os cirurgiões usem EPIs (equipamentos de proteção individual) adequados, incluindo máscara cirúrgica, touca, luvas e avental.
2. Pese o rato; programar o ventilador (ver Tabela de Materiais) com base no peso corporal.
3. Coloque o mouse em uma caixa de indução de anestesia 4 x 4 x 4 pol. Ligue o medidor de fluxo de oxigênio (consulte Tabela de Materiais), definido em 30, e o medidor de fluxo de óxido nitroso, definido em 70. Ligue o vaporizador com isoflurano a 5%.
4. Insira o fio-guia no cateter intravenoso (IV) de 20 G.
5. Retire o rato da caixa de indução quando a sua frequência respiratória for reduzida para 30-40 respirações por minuto.
6. Coloque o mouse sobre a bancada cirúrgica em decúbito dorsal. Puxe a língua do mouse para fora e segure-a com os dedos da mão esquerda. Insira um laringoscópio (ver Tabela de Materiais) na boca do animal para visualizar a corda vocal.
7. Estabilize o queixo do rato no laringoscópio utilizando o dedo médio direito. Libere a mão esquerda para segurar o cateter IV de 20 G.
8. Insira o fio-guia levemente na corda vocal e, em seguida, empurre lentamente o cateter IV de 20 G para dentro da traqueia até que a parte da asa do cateter fique uniforme com a ponta do nariz.
   Observação : se o mouse estiver se movendo, não insira o fio. Isso pode causar trauma na traqueia e sangramento.
9. Ligue o ventilador (ver Tabela de Materiais) e conecte-o ao cateter IV de 20 G intubado no mouse. Reduzir o isoflurano para 1,5% e garantir que ambos os pulmões sejam ventilados mecanicamente.
   NOTA: Não se esqueça de reduzir a concentração de isoflurano. Caso contrário, o rato receberá uma overdose de anestesia.
10. Aplique pomada ocular em ambos os olhos e injete 5 mg/kg de carprofeno por via subcutânea.
11. Mantenha o mouse em posição lateral com a área temporal direita voltada para cima. Manter a temperatura retal a 37 °C utilizando uma almofada de aquecimento (35 °C) e uma lâmpada de calor controlada por um regulador de temperatura (ver Tabela de Materiais).
12. Raspar a área de superfície entre o olho direito e a orelha e desinfetar a área cirúrgica pelo menos três vezes com cotonetes de iodo e álcool.

2. Cirurgia MCAO

1. Abra o pacote de instrumentos estéreis para cirurgia MCAO. Usar luvas estéreis e fazer uma incisão de pele de 1 cm entre o olho direito e a orelha direita usando tesoura cirúrgica.
   NOTA: Monitore a cor da pele, a temperatura corporal e a resposta à pinça dos dedos dos pés a cada 15 min.
2. Dissecar a fáscia subjacente com pinça para expor os músculos temporal e masseter.
   NOTA: Tenha cuidado para não danificar a glândula parótida.
3. Use pinça para tocar a parte inferior do músculo temporal e detectar a localização do arco zigomático. Puxe cuidadosamente os ramos do nervo facial.
4. Use a ponta de uma alça de cautério de alta temperatura (ver Tabela de Materiais) para cortar uma incisão transversal de 5 mm no músculo temporal.
5. Utilizar duas pinças para dissecar o arco zigomático subjacente e expor a articulação entre os ossos maxilar e zigomático.
6. Use uma tesoura para cortar uma porção de 3 mm do arco zigomático e removê-lo. Separe o músculo masseter da base do crânio.
   NOTA: Cuidado para não fraturar o seio retro-orbital e a veia temporal superficial.
7. Aplicar quatro pequenos afastadores posicionados em direções diferentes para expor a base do crânio, com os ramos do nervo trigêmeo tracionados lateralmente por um afastador.
   NOTA: Um sulco na superfície externa da base do crânio marca a localização da fissura lateral entre os lobos frontal e temporal. A ACM encontra-se aqui (Figura 2A), e seu tronco e ramos são visíveis através do crânio fino e transparente (Figura 2B). A relação dessa artéria com outras artérias cerebrais maiores é mostrada na Figura 2A.
8. Aplicar uma gota de soro fisiológico 0,9% no crânio acima do tronco da ACM e proximal ao ramo do córtex rinal. Use um moedor elétrico para afinar o crânio até que uma pequena fratura seja visível.
   NOTA: Não empurre o moedor contra o crânio, pois ele pode penetrar no crânio e lesionar a artéria subjacente.
9. Use a ponta da pinça para levantar o crânio afinado e removê-lo. Para ratos falsos, pare aqui e não ligue a artéria.
   Observação : uma pequena janela retangular através do tronco MCA é formada.
10. Coloque um laço de fio único de seda trançada preta sobre o MCA (Figura 2C). Inserir um 8-0 agulha microcirúrgica para levantar o tronco da ACM e amarrar a sutura (ver Tabela de Materiais) sob a agulha, deixando ambas as extremidades da agulha no topo do nó da alça do fio de seda (Figura 2D).
11. Para a ACM transitória, aperte o nó do fio de seda ligeiramente sob a agulha para bloquear o fluxo sanguíneo arterial (Figura 2E), representando o início da OMC.
12. Use a pinça para segurar a sutura e remova lentamente a agulha no final da isquemia (por exemplo, 60 min ou mais).
    NOTA: Quando a agulha é removida, o nó do fio de seda é escorregado, e o cérebro é reperfundido (Figura 2F).
13. Para MCAO permanente, aperte firmemente o laço do fio de seda ao redor da artéria e remova a agulha. Cortar e remover o excesso de materiais de sutura.
14. Aplicar uma gota de bupivacaína a 0,25% na incisão cutânea e suturar o músculo e a pele separadamente com pontos de náilon 6-0 de forma intermitente (ver Tabela de Materiais). Aplique pomada antibiótica na superfície da incisão da pele.
    NOTA: A incisão da pele também pode ser fechada com grampos estéreis ou cola.

3. Cuidados pós-cirúrgicos

1. Desligue o isoflurano para despertar o rato. Desconecte o ventilador quando a respiração espontânea for restaurada.
2. Transfira o mouse para uma câmara de recuperação (consulte Tabela de Materiais) com temperatura controlada.
3. Extubar o rato quando o seu reflexo de retificação for restaurado ou ele começar a se mover.
4. Monitore de perto o mouse em uma câmara com temperatura e umidade controladas. Volte o rato para a gaiola de casa depois de ganhar consciência plena (período de recuperação ~2 h). Administrar 5 mg/kg de Carprofeno por via subcutânea diariamente durante 3 dias.

4. Imagem de contraste speckle laser (LSCI)

1. Seis e 24 h pós-MCAO, montar o mouse anestesiado sobre o quadro estereotáxico. Faça a barba no topo da cabeça e limpe-a com três cotonetes alternados de iodo e álcool.
   OBS: A anestesia foi realizada conforme mencionado na etapa 1.3. O LSCI também é realizado antes da MCAO.
2. Faça uma incisão cutânea mediana de 3 cm e disseque a pele do crânio. Aplique quatro pequenos afastadores de agulha para expor a parte superior do crânio.
3. Mova a câmera pontilhada a laser (consulte Tabela de Materiais) acima da cabeça e ajuste o foco da câmera. Imagem do fluxo sanguíneo cerebral.

5. Coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC)

1. Anestesiar profundamente o camundongo com isoflurano a 5% no final do experimento, tipicamente no dia 1, 3 ou 28 após o AVC. Aperte a cauda para garantir que não haja resposta à dor.
2. Decapitar o rato usando uma tesoura cirúrgica e colher o cérebro. Incubar o cérebro em soro fisiológico gelado por 20 min.
3. Coloque o cérebro em uma matriz de fatiamento cerebral no gelo e solte soro fisiológico frio no cérebro. Corte o cérebro em fatias de 1 mm usando lâminas de barbear finas.
4. Mergulhe as fatias cerebrais na mesma orientação em um prato de solução TTC a 2% (consulte a Tabela de Materiais). Mantenha o prato no escuro em temperatura ambiente por 15 min.
   NOTA: O tecido cerebral normal torna-se vermelho e o tecido isquêmico permanece branco.
5. Transfira as fatias cerebrais para formalina a 10% por 24 h de fixação. Imagem do cérebro fatias e medir a área de infarto.

Resultados

Com uma visão direta sob um microscópio cirúrgico, pode-se confirmar visualmente que o fluxo sanguíneo da ACM está bloqueado durante a isquemia. Nosso estudo prévio demonstrou redução de >80% do fluxo sanguíneo na área isquêmica com o uso do monitor laser^Doppler6. Para determinar as alterações do fluxo sanguíneo pós-MCAO, o LSCI pode ser usado para confirmar ainda mais o insulto isquêmico e a reperfusão (Figura 1). De fato, na Figura 3A

Discussão

O primeiro modelo de oclusão transcraniana da ACM foi estabelecido em ratos em 1981 ^11,12 e substituído pelo modelo de MCAO sem craniectomia em^{1989 4}. A oclusão transcraniana inicial da ACM tinha um campo cirúrgico amplo, de modo que todo o arco zigomático foi removido e os músculos tracionados lateralmente. Os tecidos locais ficaram inchados após a cirurgia, causando estresse e diminuição da ingestão alimentar dos animais. Em nosso modelo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% de bupivacaína	Hospira	NDC 0409-1159-18
0,9% cloreto de sódio	ICU Medical	NDC 0990-7983-03
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma ou qualquer fornecedor
20 G IV cateter	BD	381534	20 GA 1.6 IN
30 G agulha	BD	305106
4-0 sutura de seda	Look	SP116	Sutura de seda trançada preta
8-0 com agulha	Ethilon	2822G
Cotonetes com álcool	BD	326895
Caixa de indução	de anestesia Qualquer fornecedor		Marca Pexiglass
Moedor elétrico	JSDA	JD 700
Ponta de laço de cautério de alta temperatura	Bovie	AA03
Isoflurano	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Monitor de perfusão doppler a laser	Moor Instruments	moorVMS-LDF1
Pomada lubrificante para os olhos	Bausch + Lomb	339081
Sonda	retal de camundongoPhysitemp	RET-3
Nitrous Oxide	Airgas	UN1070
Otoscópio	Welchallyn	728	2.5 mm Espéculo Otoscópio serviu como laringoscópio para visualizar cordas vocais em camundongos
Oxigênio	Airgas	UN1072
Povidona-iodo	CVS	955338
Caixa de recuperação	Brinsea	TLC eco
Rimadyl (carprofeno)	Zoetis	6100701	Injetável 50 mg/mL
Ventilador para roedores	Kent Scientific	Rodent Jr.
Controlador de temperatura	Physitemp	TCAT-2DF
Triplo antibiórico e alívio da dor	CVS	NDC 59770-823-56
Vaporizador	RWD	R583S

disponível adequado