Artigo de método

Um procedimento de estimulação cardíaca controlada para avaliação das funções diastólicas dependentes da frequência cardíaca em modelos murinos de insuficiência cardíaca

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DOI:

10.3791/65384

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21 de julho de 2023

 , 
1Department of Cardiovascular Medicine, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Therapeutic Strategy for Heart Failure, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Division of Cardiology, Department of Medicine, The Johns Hopkins Medical Institutions

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve a obtenção da relação pressão-volume por meio da estimulação transesofágica, que serve como uma ferramenta valiosa na avaliação da função diastólica em modelos murinos de insuficiência cardíaca.

Resumo

A insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP) é uma condição caracterizada por disfunção diastólica e intolerância ao exercício. Embora testes hemodinâmicos ou ressonância magnética possam ser usados para detectar disfunção diastólica e diagnosticar ICFEP em humanos, tais modalidades são limitadas na pesquisa básica usando modelos de camundongos. Um teste ergométrico em esteira é comumente usado para esse fim em camundongos, mas seus resultados podem ser influenciados pelo peso corporal, força muscular esquelética e estado mental. Aqui, descrevemos um protocolo de estimulação atrial para detectar alterações no desempenho diastólico dependentes da frequência cardíaca (FC) e validar sua utilidade em um modelo de ICFEP em camundongos. O método envolve anestesia, intubação e análise de alça pressão-volume (PV) concomitante à estimulação atrial. Neste trabalho, um cateter de condutância foi inserido por via apical do ventrículo esquerdo e um cateter de estimulação atrial foi colocado no esôfago. Alças PV basais foram coletadas antes que a FC fosse retardada com ivabradina. As alças PV foram coletadas e analisadas em incrementos de FC variando de 400 bpm a 700 bpm via estimulação atrial. Usando esse protocolo, demonstramos claramente o comprometimento diastólico dependente da FC em um modelo de ICFEP metabolicamente induzida. Tanto a constante de tempo de relaxamento (Tau) quanto a relação pressão-volume diastólico final (EDPVR) pioraram à medida que a FC aumentou em comparação com camundongos controle. Em conclusão, este protocolo de estimulação atrial controlada é útil para detectar disfunções cardíacas dependentes de FC. Ele fornece uma nova maneira de estudar os mecanismos subjacentes da disfunção diastólica em modelos de camundongos com ICFEP e pode ajudar a desenvolver novos tratamentos para essa condição.

Introdução

A insuficiência cardíaca representa uma das principais causas de hospitalização e morte em todo o mundo, e a insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP) é responsável por cerca de 50% de todos os diagnósticos de insuficiência cardíaca. A ICFEP é caracterizada por disfunção diastólica e intolerância ao exercício, e as anormalidades hemodinâmicas associadas, como disfunção diastólica, podem ser claramente detectadas por meio de testes hemodinâmicos com estresse físico ou ressonância magnética 1,2.

Em modelos experimentais, entretanto, as modalidades disponíveis para avaliar as anormalidades fisiológicas relacionadas à ICFEP são limitadas 3,4. O teste ergométrico em esteira (TMT) é utilizado para determinar o tempo e a distância de corrida, o que pode refletir a hemodinâmica cardíaca do esforço-esforço; no entanto, esse método é suscetível à interferência de variáveis estranhas, como peso corporal, força muscular esquelética e estado mental.

Para contornar essas limitações, desenvolvemos um protocolo de estimulação atrial que detecta mudanças sutis, mas cruciais, no desempenho diastólico com base na frequência cardíaca (FC) e validamos sua utilidade em um modelo de ICFEPem camundongos5. Vários fatores fisiológicos contribuem para a função cardíaca relacionada ao exercício, incluindo a resposta nervosa simpática e catecolamina, a vasodilatação periférica, a resposta endotelial e a frequência cardíaca6. Dentre estes, entretanto, a relação FC-pressão (também chamada de efeito Bowditch) é conhecida como determinante críticodas características fisiológicas cardíacas7,8,9.

O protocolo envolve a realização de uma análise convencional pressão-volume no início do estudo para avaliar a função sistólica e diastólica, incluindo parâmetros como a taxa de desenvolvimento pressórico (dp/dt), a relação pressão-volume sistólico final (ESPVR) e a relação pressão-volume diastólica final (EDPVR). No entanto, deve-se ressaltar que esses parâmetros são influenciados pela FC, que pode variar entre os animais devido a diferenças em sua frequência cardíaca intrínseca. Além disso, os efeitos da anestesia sobre a FC também devem ser considerados. Para resolver isso, a FC foi padronizada pela aplicação de estimulação atrial concomitante à ivabradina, e as medidas dos parâmetros cardíacos foram realizadas em frequências cardíacas incrementais. Notavelmente, a resposta cardíaca HR-dependente distinguiu os camundongos ICFEP dos camundongos do grupo controle, enquanto não foram observadas diferenças significativas nas medidas basais da alça PV (usando a frequência cardíaca intrínseca)5.

Embora esse protocolo de estimulação possa parecer relativamente complicado, sua taxa de sucesso excede 90% quando bem compreendido. Esse protocolo forneceria uma maneira útil de estudar os mecanismos subjacentes da disfunção diastólica em modelos de ICFEP em camundongos e ajudar no desenvolvimento de novos tratamentos para essa condição.

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Protocolo

Este protocolo animal foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e seguiu as normas para experimentação animal e atividades relacionadas da Universidade de Tóquio. Para o presente estudo, foram utilizados camundongos machos C57/Bl6J com 8-12 semanas de idade. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Um modelo de ICFEP foi estabelecido administrando-se uma dieta hiperlipídica por 15 semanas em conjunto com o éster metílico de NG-nitro-L-arginina, conforme descrito anteriormente10.

1. Preparo do cateter e calibração da pressão/volume

  1. Coloque um cateter de condutância em soro fisiológico normal e conecte-o a um módulo composto pelo PowerLab 8/35 e uma unidade de pressão-volume (módulo MPVS, consulte a Tabela de Materiais).
  2. Calibrar eletronicamente a pressão e o volume através do registro de parâmetros pré-determinados de pressão (0 mmHg e 100 mmHg) e volume (estes variam entre os módulos MPVS) no módulo MPVS 3,11 (ver também as instruções do fabricante).

2. Preparar um animal para o cateterismo

  1. Anestesia e ventilação
    1. Administrar uma injeção intraperitoneal de 5 mg/kg de etomidato e 500 mg/kg de uretano (ver Tabela de Materiais) 5-10 minutos antes da intubação.
      NOTA: Suspeita-se que o uretano, embora eficaz como agente anestésico em estudos com animais, seja cancerígeno para os seres humanos. Portanto, quando o uretano é necessário para o alcance dos objetivos experimentais e nenhum agente alternativo é suficiente, ele deve ser manuseado com cautela. Medidas de proteção adequadas, como o uso de luvas e máscaras e o uso de um exaustor durante o preparo, são obrigatórias. Como possível alternativa, a cetamina (80 mg/kg, ip) pode ser empregada.
    2. Colocar o camundongo em uma câmara de anestesia previamente saturada com isoflurano a 2% e transferir o animal para uma bolsa térmica pré-aquecida mantida entre 38 °C e 40 °C após a indução anestésica.
    3. Faça a raspagem da área cirúrgica. Em seguida, desinfete o local cirúrgico com três rodadas alternadas de betadina e álcool.
    4. Faça uma incisão horizontal (1-2 cm) no pescoço, extire o músculo traqueal e exponha a traqueia. Passar uma sutura cirúrgica de seda 2-0 sob a traqueia, elevá-la e fazer uma pequena incisão (1-2 mm) para abri-la.
    5. Insira um tubo endotraqueal na traqueia e conecte-o a um ventilador que forneça uma mistura de oxigênio a 100% e isoflurano a 2% (reduzido para 0,5% a 1% mais tarde).
  2. Inserção de cateter venoso central (CV) e injeção de fluidos
    1. Localizar a veia jugular interna abaixo do músculo esternocleidomastoideo3.
    2. Insira o cateter venoso central, composto por tubo de silicone PE-10 (ver Tabela de Materiais) acoplado a uma agulha de 30 G, na veia jugular.
    3. Administrar uma infusão em bolus de 5-6 μL/g de peso corporal de albumina a 10%/NaCl durante 3 minutos, seguida de uma taxa de perfusão constante de 5-10 μL/min.
      OBS: Esta etapa é fundamental para prevenir a hipotensão arterial decorrente da vasodilatação periférica causada pela anestesia. A veia jugular interna está localizada entre o músculo esternocleidomastoideo e a artéria carótida, e parece de cor mais escura que a artéria.

3. Procedimento cirúrgico para cateterização do ventrículo esquerdo (abordagem torácica aberta)

  1. Raspar a área cirúrgica do camundongo anestesiado. Em seguida, desinfete o local cirúrgico com três rodadas alternadas de betadina e álcool.
  2. Confirme a profundidade da anestesia realizando uma pinça do dedo do pé. Em seguida, fazer uma incisão horizontal (2-3 cm) abaixo do processo xifoide e separar a pele da parede torácica com tesoura romba.
  3. Cortar lateralmente a parede torácica em ambos os lados usando cautério elétrico (ver Tabela de Materiais).
  4. Exponha o coração cortando o diafragma e remova o pericárdio suavemente do coração usando pinças.
  5. Insira uma agulha 27G no ápice do ventrículo esquerdo (VE) e insira retrogradamente um cateter de condutância no VE através do orifício de punção.
  6. Ajuste a posição do cateter para que se obtenha uma alça pressão-volume em forma de quadrado.
  7. Verificar se o cateter não entra em contato com o músculo papilar quando ocorrem mudanças nas condições de carga, verificando a forma da alça PV durante a oclusão da veia cava inferior (VCI).
    NOTA: A exposição adequada do coração facilita o procedimento e ajuda a obter uma visão clara.

4. Registro dos dados da alça PV e determinação da relação pressão-volume sistólico final (ESPVR) e da relação pressão-volume diastólica final (EDPVR)

NOTA: A redução da pré-carga por oclusão da VCI permite a determinação da ESPVR e EDPVR.

  1. Registre e analise o loop pressão-volume (PV) basal com o software LabChart (consulte a Tabela de Materiais), o PowerLab e o módulo MPVS após a estabilização do sinal (5-10 min após a canulação).
  2. Realizar a oclusão da VCI comprimindo a VCI com pinça e registrar a alça do PV por pelo menos 20 ciclos cardíacos durante a oclusão da VCI. Determine a ESPVR ajustando uma linha de regressão linear através dos pontos sistólicos finais da alça PV e a EDPVR ajustando uma linha curvilínea através dos pontos diastólicos finais da alça PV usando o software LabChart.
    NOTA: Pare o ventilador durante a oclusão da VCI para evitar artefatos de movimento pulmonar. Um agente paralítico como o pancurônio (0,5-1 mg/kg) pode ser útil quando o movimento pulmonar é excessivo e deve ser usado somente após a confirmação de um plano anestésico estável.

5. Estimulação transesofágica

  1. Insira um cateter de eletrodo tetrapolar de 2 Fr no esôfago, conecte o cateter a um estimulador de pulso (consulte a Tabela de Materiais) e determine o limiar de captura atrial (normalmente, a amplitude do estímulo é de 3 mA e a largura de pulso é de 1 ms).
  2. Diminuir a FC abaixo de 400 batimentos/min utilizando 20 mg/kg de ivabradina (ver Tabela de Materiais) administrada por via intraperitoneal.
  3. Após a estabilização, adquirir 20 ciclos cardíacos contínuos de alças de PV em diferentes taxas de estimulação de 400 batimentos/min a 700 batimentos/min, com um incremento de 100 batimentos/min; adquirir os ciclos ao longo de 5 min a cada taxa de ritmo.

6. Calibração salina e calibração do fluxo aórtico

  1. Inativar o ventilador e administrar 5-10 μL de solução salina hipertônica por via intravenosa através do cateter CV.
  2. Documente as flutuações de pressão e volume durante a injeção de soro fisiológico e calcule o valor de Vp usando o PowerLab 3,11.
  3. Repita a calibração do soro fisiológico para aumentar a precisão e a reprodutibilidade.
  4. Vire o mouse para o lado esquerdo para não atrapalhar o sinal de volume.
  5. Realizar toracotomia lateral entre Th3 a Th5 em direção à coluna vertebral e dissecar suavemente uma pequena parte da aorta descendente com pinças.
  6. Coloque uma sonda de fluxo vascular (ver Tabela de Materiais) sobre a aorta para medir o débito cardíaco.
    NOTA: O cálculo preciso do volume absoluto requer o uso de dois tipos de calibração: calibração salina e calibração do fluxo aórtico. É importante reconhecer os riscos potenciais associados a uma infusão de solução salina hipertônica em animais, pois a carga excessiva de sal pode resultar em um declínio na contratilidade.

7. Eutanásia

  1. Após o estudo, eutanasiar os camundongos sob uma overdose de anestésico via luxação cervical.
    NOTA: Para garantir a cessação completa da função vital, um método secundário de eutanásia é empregado, como a exsanguinação sob anestesia com subsequente coleta de tecido cardíaco.

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Resultados

Os dados basais da alça PV são exibidos na Figura 1 e na Tabela 1. No início do estudo (na ausência de estimulação), não houve diferenças significativas em parâmetros diastólicos, como a constante de tempo de relaxamento (Tau), a taxa mínima de mudança de pressão (dP/dt min) e EDPVR entre os camundongos controle e HFpFEP. No entanto, os camundongos HFpEF exibiram pressão arterial e pressão arterial (Ea) mais elevadas, como mostrado na Figura 1, ...

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Discussão

Apresentamos uma metodologia para avaliar as relações pressão-volume com a aplicação da estimulação transesofágica. A intolerância ao exercício é uma das principais características da ICFEP, porém não existem técnicas disponíveis para a avaliação da função cardíaca em camundongos durante o exercício. Nosso protocolo de estimulação artificial oferece uma ferramenta valiosa para detectar disfunção diastólica, que pode não ser aparente em condições de repouso.

Para obter uma alça fotovoltaica de ...

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Divulgações

Não há interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por bolsas de pesquisa da Fundação Fukuda para Tecnologia Médica (para E.T. e G. N.) e do JSPS KAKENHI Scientific Research Grant-in-Aid 21K08047 (para E.T.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sutura de seda 2-0, sterlieAlfresa Pharma Corporation, Osaka, Japão62-9965-57Suprimentos cirúrgicos
Cateter de eletrodo tetrapolar 2-FrFukuda Denshi, Japão e UNIQUE MEDICAL, JapãoSuprimentos cirúrgicosfeitos sob medida
Albumina Soro bovinoNacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japão01859-47
Diversos C57 / BI6J mouseJackson Laboratoryanimais
Cateter de condutânciaMillar Instruments, Houston, TXPVR 1035
Cautério elétrico, Kit de faca de eletrocautérioellman-Japão, Osaka, Japão1-1861-21Suprimentos cirúrgicos
EtomidateTokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tóquio JapãoE0897anestésica
S44G Estimulador de pulso quadradoAstro-Med, Oeste Warwick, RIEquipamento de estimulação
IsofluraneViatris Inc., Tóquio, Japão8803998Anestésico
IvabradinaTokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tóquio JapãoI0847
Software LabChartADInstruments, Sydney, AustráliaLabChart 7Equipamento hemodinâmico
MPVS UltraMillar Instruments, Houston, TXPL3516B49Equipamento hemodinâmico
Brometo de pancroniumSigma Aldrich Co., St. Louis, MO15500-66-0PE10 anestésico
Research Center  Co. Ltd., Tóquio, Japão62101010Suprimentos Cirúrgicos
PowerLab 8/35ADInstruments, Sydney, AustráliaPL3508/PEquipamento hemodinâmico
PVR 1035Millar Instruments, Houston, TX842-0002Equipamento hemodinâmico
Uretano (carbamato de etila)Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japão050-05821anestésica
transônica, Ithaca, NYMA1PRBSuprimentos cirúrgicos
Instrumento de grama Diversos Tubo de polietileno Bio Sonda de fluxo vascular

Referências

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