Este trabalho apresenta um modelo animal de fibrose induzida pela transição endotelial-mesenquimal, como visto em defeitos cardíacos congênitos, como estenose aórtica crítica ou síndrome do coração esquerdo hipoplásico, que permite a avaliação histológica detalhada do tecido, a identificação de vias de sinalização regulatórias e o teste de opções de tratamento.
A fibroelastose endocárdica (EFE), definida pelo acúmulo de tecido subendocárdico, tem grande impacto no desenvolvimento do ventrículo esquerdo (VE) e impede que pacientes com estenose aórtica crítica congênita e síndrome do coração esquerdo hipoplásico (SHCE) façam reparo cirúrgico biventricular anatômico curativo. A ressecção cirúrgica é atualmente a única opção terapêutica disponível, mas a EFE frequentemente se repete, às vezes com um padrão de crescimento ainda mais infiltrativo no miocárdio adjacente.
Para entender melhor os mecanismos subjacentes da EFE e explorar estratégias terapêuticas, um modelo animal adequado para testes pré-clínicos foi desenvolvido. O modelo animal leva em consideração que a EFE é uma doença do coração imaturo e está associada a distúrbios de fluxo, como sustentado por observações clínicas. Assim, o transplante cardíaco heterotópico de corações de ratos doados neonatais é a base para esse modelo.
Um coração de rato neonatal é transplantado para o abdômen de um rato adolescente e conectado à aorta infrarrenal e à veia cava inferior do receptor. Enquanto a perfusão das artérias coronárias preserva a viabilidade do coração doador, a estagnação do fluxo dentro do VE induz o crescimento da EFE no coração muito imaturo. O mecanismo subjacente da formação do EFE é a transição das células endoteliais endocárdicas para as células mesenquimais (EndMT), que é um mecanismo bem descrito de desenvolvimento embrionário precoce das valvas e septos, mas também a principal causa de fibrose na insuficiência cardíaca. A formação de EFE pode ser observada macroscopicamente dentro de dias após o transplante. A ecocardiografia transabdominal é usada para monitorar a viabilidade do enxerto, a contratilidade e a patência das anastomoses. Após a eutanásia, o tecido da EFE é retirado, e apresenta as mesmas características histopatológicas que o tecido da EFE humana de pacientes com SHCE.
Este modelo in vivo permite estudar os mecanismos de desenvolvimento de EFE no coração e testar opções de tratamento para prevenir a formação desse tecido patológico e fornece a oportunidade para um exame mais generalizado da fibrose induzida por EndMT.
A fibroelastose endocárdica (EFE), definida pelo acúmulo de fibras colágenas e elásticas no tecido subendocárdico, apresenta-se como um endocárdio espessado perolado ou opaco; A EFE sofre crescimento mais ativo durante o período fetal e início da infância1. Em um estudo de autópsia, 70% dos casos com síndrome de hipoplasia do coração esquerdo (SHCE) estavam associados à presença de EFE2.
As células que expressam marcadores para fibroblastos são a principal população celular na EFE, mas essas células também expressam concomitantemente marcadores endoteliais endocárdicos, o que é uma indicação da origem dessas células EFE. Nosso grupo estabeleceu anteriormente que o mecanismo subjacente da formação da EFE envolve uma mudança fenotípica de células endoteliais endocárdicas para fibroblastos através da transição endotelial-mesenquimal (EndMT)3. A EndMT pode ser detectada usando dupla coloração imunoistoquímica para marcadores endoteliais, como cluster de diferenciação (CD) 31 ou endotelial vascular (VE)-caderina (CD144) e marcadores de fibroblastos (por exemplo, alfa-actina de músculo liso, α-SMA). Além disso, também estabelecemos previamente o papel regulatório da via do TGF-ß nesse processo com ativação dos fatores de transcrição SLUG, SNAIL e TWIST3.
A EndMT é um processo fisiológico que ocorre durante o desenvolvimento cardíaco embrionário e leva à formação de septos e valvas a partir de coxins endocárdicos4, mas também causa fibrose orgânica na insuficiência cardíaca, fibrose renal ou câncer e desempenha um papel fundamental na aterosclerose vascular 5,6,7,8. A EndMT na fibrose cardíaca é regulada principalmente pela via do TGF-β, como relatamos nós e outros 3,9. Vários estímulos têm sido descritos para induzir EndMT: inflamação10, hipóxia11, alterações mecânicas 12 e distúrbios de fluxo, incluindo alterações do fluxo sanguíneo intracavitário 13, e EndMT também pode ser consequência de uma doença genética 14.
Esse modelo animal foi desenvolvido utilizando os principais componentes do desenvolvimento da EFE cardíaca, que são a imaturidade e as alterações do fluxo sanguíneo intracavitário, especificamente a estagnação do fluxo. A imaturidade foi completada com o uso de corações de ratos neonatais como doadores, uma vez que os ratos neonatais são conhecidos por serem imaturos em termos de desenvolvimento imediatamente após o nascimento. O transplante cardíaco heterotópico ofereceu restrição de fluxo intracavitário15.
Do ponto de vista clínico, esse modelo animal permite investigar melhor o impacto da EndMT no ventrículo esquerdo (VE) em crescimento. A restrição de crescimento imposta ao coração fetal e neonatal pela formação de EFE induzida por EndMT16 impede que pacientes com obstruções da via de saída do ventrículo esquerdo (ODVE), como estenose aórtica crítica congênita e síndrome do coração esquerdo hipoplásico (SHCE), façam reparo cirúrgico biventricular anatômico curativo17. Esse modelo animal facilita o estudo dos mecanismos celulares e a regulação da formação tecidual por meio da EndMT e permite testar opções de tratamento farmacológico 3,18.
A ecocardiografia transabdominal é usada para monitorar a viabilidade do enxerto, a contratilidade e a patência das anastomoses. Após a eutanásia, a formação de EFE pode ser observada macroscopicamente dentro de 3 dias após o transplante. O tecido da EFE apresenta as mesmas características histopatológicas do tecido da EFE humana de pacientes com ODVE.
Assim, este modelo animal, embora desenvolvido para uso pediátrico no espectro da SHCE, pode ser aplicado no estudo de várias doenças com base no mecanismo molecular da EndMT.
Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Conselho Nacional de Pesquisa. 2011. Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório: Oitava Edição. Os protocolos dos animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Boston Children’s Hospital.
Antes da cirurgia, todos os instrumentais cirúrgicos são autoclavados a vapor, e o tampão Krebs-Henseleit modificado, com concentração final de 22 mmol/L de KCl, é preparado como solução cardioplégica (Tabela 1). A solução é esterilizada por filtro e armazenada a 4 °C durante a noite. Um microscópio cirúrgico (12,5x) é necessário para o procedimento de transplante cardíaco neonatal heterotópico em ratos.
1. Preparo e anestesia
2. Preparo cirúrgico e transplante heterotópico do coração de doador neonatal no rato receptor
3. Captação do coração do doador neonatal
4. Recuperação do receptor e monitorização do enxerto
Este modelo animal de transplante heterotópico de um coração de rato doador neonatal no abdome do receptor cria a possibilidade de estudar a fibrose derivada de EndMT por meio de avaliação histológica detalhada do tecido, identificar vias de sinalização regulatórias e testar opções de tratamento. Uma vez que EndMT é o mecanismo subjacente para doenças fibróticas do coração, este modelo tem grande valor no campo da cirurgia cardíaca pediátrica e além. Nesse modelo, muitos fatores podem influenciar negativamente o resultado do procedimento. Assim, o manuseio adequado do tecido muito frágil devido à imaturidade do coração doador, o manuseio adequado do animal durante a anestesia e habilidades microcirúrgicas de alto nível são requisitos básicos para o sucesso desse modelo. Uma configuração técnica ideal, incluindo um microscópio cirúrgico, ventilador para pequenos animais e instrumentos microcirúrgicos, deve ser usada ao realizar esses experimentos. Embora não seja essencial, a monitorização básica da frequência cardíaca ou da temperatura corporal pode ser benéfica, especialmente para cirurgiões inexperientes, a fim de monitorar a hemodinâmica e a profundidade da anestesia.
Aspectos cirúrgicos importantes a serem considerados incluem a imaturidade dos corações neonatais doados, o que torna o tecido muito frágil e deixa a aorta ascendente e o tronco pulmonar vulneráveis a rupturas. Assim, qualquer manuseio deve ser realizado com muito cuidado. Devido aos pequenos vasos utilizados para a anastomose, recomenda-se a realização de anastomose arterial com pontos interrompidos e lavagem intermitente do local da anastomose com soro fisiológico heparinizado, o que ajuda a evitar a formação de trombos. A seleção de ratos neonatais adequadamente envelhecidos é necessária para superar a questão do uso de corações muito imaturos e, portanto, altamente suscetíveis à ruptura da anastomose. Por outro lado, após uma certa idade de cerca de 7 dias, a EndMT não pode mais ser mostrada de forma reprodutível neste modelo animal15.
A EndMT tem sido identificada como o mecanismo central para vários tipos de fibrose cardíaca e aterosclerose, mas a pesquisa tem sido dificultada devido à falta de modelos in vivo8. Os principais desenvolvimentos no campo da pesquisa em EndMT restringem-se aos modelos de cultura celular, que apresentam limitações inerentes 3,8,9. Além disso, os estudos com células endoteliais endocárdicas são ainda mais restritos. Como alternativa, as células endoteliais das artérias coronárias são frequentemente utilizadas como substitutas, pois há relatos de que se originam em parte de célulasendocárdicas21. Assim, este modelo animal pode ser usado não apenas para fibrose cardíaca, mas para estudar importantes patomecanismos de EndMT induzida por fluxo na aterosclerose. Para cardiopatia congênita, demonstramos a capacidade de reproduzir a transição do endocárdio saudável para o tecido EFE através do EndMT em nosso modelo de rato, com EFE que se assemelha estruturalmente ao tecido humano da EFE. Há controvérsias quanto à origem celular das células mesenquimais no tecido da EFE. Clark et al.22 relataram que as células epicárdicas contribuem para a AFE, mas nossos dados indicaram que a maioria do tecido da EFE é derivada através de células endoteliais endocárdicas submetidas à EndMT3. Experimentos em nível de célula única estão atualmente em andamento para determinar a origem celular do tecido EFE.
Através deste modelo in vivo, as vias regulatórias da EndMT podem ser estudadas. Um desequilíbrio, especificamente um aumento na via do TGF-ß e a sinalização prejudicada da proteína morfogenética óssea (BMP), tem demonstrado desempenhar um papel importante em células endocárdicas que expressam fatores de transcrição que regulam a EndMT. Alternativamente, a sinalização Jagged/NOTCH e Wnt/ß-catenina também foram relatadas como indutoras de EndMT 3,23. A via TGF-ß induz a ativação de fatores de transcrição como SLUG, SNAIL e TWIST via proteínas SMAD, regulando assim a EndMT20,24. Neste modelo animal, conseguimos recapitular esses mecanismos, que foram confirmados pela coloração imunohistoquímica.
Os fatores estimuladores da fibrose induzida por EndMT nesse modelo animal são a imaturidade e a estagnação do fluxo, enquanto outros modelos são projetados para induzir EndMT por meio de modificações genéticas, hipertensão ou restrições alimentares 9,25. Em comparação com outras espécies, os ratos neonatais são muito imaturos ao nascimento e, portanto, são particularmente suscetíveis a serem submetidos à EndMT.
Nós e outros usamos camundongos para estudar melhor as origens da EFE via rastreamento de linhagem transgênica, mas várias limitações precisam ser discutidas 3,22. Primeiro, devido à complexidade do modelo, as taxas de mortalidade são maiores em camundongos em comparação com ratos, e a apresentação da EFE é mais heterogênea; Portanto, o modelo de rato é mais confiável e reprodutível. Medidas ecocardiográficas são cruciais para avaliar a função do enxerto durante todo o período de estudo, e mostramos que com essas medidas, assim como a avaliação da pulsatilidade e patência das anastomoses, a função do enxerto e a contratilidade também podem ser estudadas. Com mais experiência, análises ainda mais avançadas do coração transplantado, como a análise de strain do VE, poderiam ser realizadas em modelos de ratos. Atualmente, não está claro se a mesma condição fisiopatológica pode ser induzida em animais maiores que não roedores, o que requer mais investigação.
Em conclusão, este modelo animal pediátrico mimetiza a doença humana de EndMT e pode ser útil para determinar a regulação de EndMT e estudar intervenções farmacológicas para inibir este processo patológico.
The authors have nothing to disclose.
Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |