Perfil Genético e Triagem de Abandono em Escala Genômica para Identificar Alvos Terapêuticos em Modelos Murinos de Tumor Maligno de Bainha de Nervo Periférico

Summary

Desenvolvemos uma abordagem oncogenômica comparativa entre espécies utilizando análises genômicas e telas genômicas funcionais para identificar e comparar alvos terapêuticos em tumores surgidos em modelos de camundongos geneticamente modificados e o tipo de tumor humano correspondente.

Abstract

Os Tumores Malignos de Bainha de Nervo Periférico (MPNSTs) são derivados das células de Schwann ou de seus precursores. Em pacientes com a síndrome de suscetibilidade tumoral neurofibromatose tipo 1 (NF1), os MPNSTs são a neoplasia maligna mais comum e a principal causa de morte. Esses sarcomas de partes moles raros e agressivos oferecem um futuro promissor, com taxas de sobrevida livre de doença em 5 anos de 34-60%. As opções de tratamento para indivíduos com MPNSTs são decepcionantemente limitadas, sendo a cirurgia desfigurante a principal opção de tratamento. Muitas terapias outrora promissoras, como o tipifarnibe, um inibidor da sinalização de Ras, falharam clinicamente. Da mesma forma, ensaios clínicos de fase II com erlotinib, que tem como alvo o fator de crescimento epidérmico (EFGR), e sorafenib, que tem como alvo o receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), o receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e o Raf, em combinação com a quimioterapia padrão, também falharam em produzir resposta nos pacientes.

Nos últimos anos, métodos de triagem genômica funcional combinados com o perfil genético de linhagens de células cancerosas têm se mostrado úteis para a identificação de vias essenciais de sinalização citoplasmática e o desenvolvimento de terapias alvo-específicas. No caso de tipos raros de tumores, uma variação dessa abordagem conhecida como oncogenômica comparativa entre espécies está sendo cada vez mais usada para identificar novos alvos terapêuticos. Na oncogenômica comparativa entre espécies, o perfil genético e a genômica funcional são realizados em modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) e os resultados são validados em espécimes humanos raros e linhagens celulares disponíveis.

Este artigo descreve como identificar mutações no gene driver candidato em células MPNST humanas e de camundongos usando o sequenciamento completo do exoma (WES). Em seguida, descrevemos como realizar telas de shRNA em escala genômica para identificar e comparar vias críticas de sinalização em células MPNST humanas e de camundongos e identificar alvos farmacológicos nessas vias. Essas metodologias fornecem uma abordagem eficaz para identificar novos alvos terapêuticos em uma variedade de tipos de câncer humano.

Introduction

Os tumores malignos da bainha dos nervos periféricos (MPNSTs) são neoplasias de células fusiformes altamente agressivas que surgem em associação com a síndrome de suscetibilidade tumoral neurofibromatose tipo 1 (NF1), esporadicamente na população geral e em locais de radioterapia ^prévia1,2,3. Os pacientes com NF1 nascem com uma cópia selvagem do gene supressor de tumor NF1 e um segundo alelo NF1 com uma mutação de perda de função. Esse estado de haploinsuficiência torna os pacientes com NF1 suscetíveis a uma segunda mutação de perda de função em seu gene

Protocol

Antes do início dos estudos, os procedimentos e protocolos em animais para manejo de vetores virais foram revisados e aprovados pela Comissão Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e pela Comissão Institucional de Biossegurança (CIB). Os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelos Conselhos IACUC e IBC da Universidade Médica da Carolina do Sul e foram realizados por pessoal devidamente treinado, de acordo com o NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals e as diretrizes institucionais de cuidados com animais do MUSC.

1. Análises WES-Seq e Identificação de Variantes Patogênicas

1. Isolar o DNA ....

Results

Os gráficos da Figura 5 mostram escores de depleção de genes essenciais centrais (CEGs) rotulados como TRUE em comparação com não-CEGs (rotulados como FALSE) em cada linhagem celular humana que foi triada. Os pontos representam log2 dos escores de depleção de dobras para genes individuais, que são plotados sobre uma representação boxplot da distribuição geral do estrofe. O teste t de Student foi utilizado para testar a diferença significativa na média dos escores de depleção entre o.......

Discussion

Os métodos detalhados aqui apresentados foram desenvolvidos para estudar a neoplasia do sistema nervoso periférico e a patogênese do MPNST. Embora tenhamos encontrado esses métodos como eficazes, deve-se reconhecer que existem algumas limitações potenciais para os métodos que descrevemos aqui. A seguir, discutimos algumas dessas limitações e possíveis estratégias para superá-las em outros sistemas modelo.

Descobrimos que o sequenciamento completo do exoma efetivamente identifica mutações de in.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de Sonicação Bioruptor	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Citômetro de imagem Celigo	Nexcelom	N/A
Cellecta Analisador de código de barras e software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Microplaca preta de 96 poços Corning	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml tubos cônicos	Diagenode
mistura dNTP	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Tampão de eluição	Qiagen	19086
Etanol (200 Provas)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3'
FWDHTS 5'-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3'
GexSeqS (5' AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3'			GraphPad
Harris Hematoxilina	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldeído (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Reagente de Transfecção	Thermo Scientific	11514015
Reagente de Transfecção Polybrene	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	Qiagen 19051
	Qiagen	28704
RevGEX 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3'
RevHTS1 5'-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3'
Titanium Taq polimerase	Clontech	639210
Trimmomatic software		www.usadellab.org