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Reação em cadeia da polimerase e hibridização de ponto-blot para detecção de Leptospira em amostras de água

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DOI:

10.3791/65435

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14 de junho de 2024

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1Department of Molecular Biology and Histocompatibility, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”, 2Diagnostic Laboratory-Bacteriology, Leptospira Section, Department of Microbiology and Immunology, Veterinary Medicine Faculty, UNAM, 3Department of Ecology of Pathogens, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”

Neste artigo

Resumo

Neste estudo, uma aplicação de dot-blot foi projetada para detectar Leptospira dos três clados principais em amostras de água. Este método permite a identificação de quantidades mínimas de DNA especificamente direcionadas por uma sonda marcada com digoxigenina, facilmente detectada por um anticorpo anti-digoxigenina. Essa abordagem é uma ferramenta valiosa e satisfatória para fins de triagem.

Resumo

O dot-blot é uma técnica simples, rápida, sensível e versátil que permite a identificação de quantidades mínimas de DNA especificamente direcionadas pela hibridização da sonda na presença de DNA transportador. Baseia-se na transferência de uma quantidade conhecida de DNA para um suporte sólido inerte, como uma membrana de náilon, utilizando o aparelho de dot-blot e sem separação eletroforética. As membranas de nylon têm a vantagem de alta capacidade de ligação de ácidos nucleicos (400 μg/cm2), alta resistência e são carregadas positiva ou neutramente. A sonda usada é um fragmento de ssDNA altamente específico de 18 a 20 bases marcadas com digoxigenina (DIG). A sonda se conjugará com o DNA da Leptospira . Uma vez que a sonda tenha hibridizado com o DNA alvo, ela é detectada por um anticorpo anti-digoxigenina, permitindo sua fácil detecção por meio de suas emissões reveladas em um filme de raios-X. Os pontos com uma emissão corresponderão aos fragmentos de DNA de interesse. Este método emprega a marcação não isotópica da sonda, que pode ter uma meia-vida muito longa. A desvantagem deste imunomarcador padrão é uma sensibilidade mais baixa do que as sondas isotópicas. No entanto, é mitigado pelo acoplamento da reação em cadeia da polimerase (PCR) e ensaios de dot-blot. Essa abordagem permite o enriquecimento da sequência alvo e sua detecção. Além disso, pode ser usado como uma aplicação quantitativa quando comparado com uma diluição em série de um padrão bem conhecido. Uma aplicação de dot-blot para detectar Leptospira dos três clados principais em amostras de água é apresentada aqui. Esta metodologia pode ser aplicada a grandes quantidades de água, uma vez que tenham sido concentradas por centrifugação para fornecer evidências da presença de DNA de Leptospira. Esta é uma ferramenta valiosa e satisfatória para fins gerais de triagem, podendo ser utilizada para outras bactérias não cultiváveis que possam estar presentes na água, melhorando a compreensão do ecossistema.

Introdução

A leptospirose em humanos tem origem principalmente em fontes ambientais 1,2. A presença de Leptospira em lagos, rios e córregos é um indicador de transmissão de leptospirose entre animais silvestres e animais domésticos e de produção que podem eventualmente entrar em contato com esses corpos d'água 1,3,4. Além disso, Leptospira foi identificada em fontes não naturais, incluindo esgoto, água estagnada e água da torneira 5,6.

Leptospira é uma bactéria distribuída mundialmente 7,8, e o papel do ambiente em sua preservação e transmissão tem sido bem reconhecido. Leptospira pode sobreviver em água potável sob pH e minerais variáveis9 e em corpos d'água naturais1. Também pode sobreviver por longos períodos em água destilada10 e, sob pH constante (7,8), pode sobreviver até 152 dias11. Além disso, Leptospira pode interagir em consórcios bacterianos para sobreviver a condições adversas12,13. Pode fazer parte de biofilmes em água doce com Azospirillum e Sphingomonas e é capaz de crescer e suportar temperaturas superiores a 49 °C14,15. Também pode se multiplicar em solo encharcado e permanecer viável por até 379 dias16, preservando sua capacidade de causar a doença por até um ano17,18. No entanto, pouco se sabe sobre a ecologia dentro dos corpos d'água e como ela se distribui dentro deles.

Desde sua descoberta, o estudo do gênero Leptospira foi baseado em testes sorológicos. Não foi até o século atual que as técnicas moleculares se tornaram mais prevalentes no estudo deste espiroqueta. O dot-blot tem sido pouco utilizado para sua identificação usando (1) uma sonda isotópica baseada no 16S rRNA e em uma repetição de sequência inter-simples (ISSR) 19 , 20 , (2) como um imunoensaio baseado em nanoouro para leptospirose humana aplicada à urina21, ou (3) como um ensaio baseado em anticorpos para amostras de urina bovina22. A técnica caiu em desuso porque foi originalmente baseada em sondas isotópicas. No entanto, é uma técnica bem conhecida que, juntamente com a PCR, produz resultados aprimorados, sendo considerada segura devido ao uso de sondas não isotópicas. A PCR desempenha um papel crucial no enriquecimento do DNA de Leptospira, amplificando um fragmento de DNA específico que pode ser encontrado em pequenas quantidades em uma amostra. Durante cada ciclo de PCR, a quantidade do fragmento de DNA alvo é dobrada na reação. No final da reação, o amplicon foi multiplicado por um fator de mais de um milhão23. O produto amplificado por PCR, muitas vezes não visível na eletroforese de agarose, torna-se visível por hibridização específica com uma sonda marcada com DIG no ponto-blot 24,25,26.

A técnica dot-blot é simples, robusta e adequada para inúmeras amostras, tornando-a acessível a laboratórios com recursos limitados. Tem sido empregado em uma variedade de estudos de bactérias, incluindo (1) bactérias orais27, (2) outros tipos de amostras, como alimentos e fezes28, e (3) a identificação de bactérias não cultiváveis29, muitas vezes de acordo com outras técnicas moleculares. Entre as vantagens oferecidas pela técnica dot-blot estão: (1) A membrana possui alta capacidade de ligação, capaz de ligar mais de 200 μg/cm2 de ácidos nucléicos e até 400 μg/cm2; (2) Os resultados do dot-blot podem ser interpretados visualmente sem a necessidade de equipamento especial e (3) podem ser convenientemente armazenados por anos em temperatura ambiente (RT).

O gênero Leptospira foi classificado em clados patogênicos, intermediários e saprófitos30,31. A distinção entre esses clados pode ser alcançada com base em genes específicos, como lipL41, lipL32 e 16S rRNA. LipL32 está presente nos clados patogênicos e exibe alta sensibilidade em várias ferramentas sorológicas e moleculares, enquanto está ausente em espécies saprófitas21. O gene housekeeping lipL41 é conhecido por sua expressão estável e utilizado em técnicas moleculares32, enquanto o gene16 S rRNA é utilizado para sua classificação.

Esta metodologia pode ser aplicada a grandes volumes de água, uma vez que tenham sido concentrados por centrifugação. Ele permite a avaliação de vários pontos e profundidades dentro de um corpo d'água para detectar a presença de DNA leptospira e o clado ao qual ele pertence. Esta ferramenta é valiosa para fins de triagem ecológica e geral e também pode ser empregada para detectar outras bactérias não cultiváveis que possam estar presentes na água.

Além disso, os ensaios de PCR e dot-blot são técnica e economicamente acessíveis a uma ampla gama de laboratórios, mesmo aqueles que não possuem equipamentos sofisticados ou caros. Este estudo tem como objetivo aplicar o dot-blot à base de digoxigenina para a identificação dos três clados de Leptospira em amostras de água coletadas de corpos d'água naturais.

Cepas bacterianas
Doze sorovares de Leptospira (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi e Wolffi) foram incluídos neste estudo. Esses sorovares fazem parte da coleção do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Nacional Autônoma do México, e atualmente são utilizados no teste de microaglutinação (SAM).

Todos os sorovares de Leptospira foram cultivados em MCEM e seu DNA foi extraído usando um kit comercial de extração de DNA (ver Tabela de Materiais). Uma mistura de DNA genômico dos doze sorovares foi usada como controle positivo para o clado patogênico Leptospira . Como controle positivo do clado intermediário Leptospira , foi incluído o DNA genômico do sorovar Leptospira fainei Hurstbridge cepa BUT6, e como controle positivo para o clado saprófito Leptospira , o DNA genômico do sorovar Leptospira biflexa Patoc cepa Patoc I.

Os controles negativos consistiram em um plasmídeo vazio, DNA de bactérias não relacionadas (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii e Escherichia coli) e água de grau PCR, que serviu como controle não modelo.

Amostras de água
Doze amostras experimentais foram coletadas usando um método de amostragem estratificada aleatória do Centro de Pesquisa Biológica e Aquacultural de Cuemanco (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). Essas amostras foram obtidas em três profundidades: superficial, 10 e 30 cm (Figura 1A, B). Os procedimentos de coleta de água não afetaram nenhuma espécie ameaçada ou protegida. Cada amostra foi coletada em um tubo de microcentrífuga estéril de 15 mL. Para coletar a amostra, cada tubo foi submerso suavemente na água, preenchido na profundidade selecionada e depois selado. As amostras foram mantidas a 22 °C e prontamente transportadas para o laboratório para processamento.

Cada amostra foi concentrada por centrifugação em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mL a 8000 x g por 20 min à temperatura ambiente. Essa etapa foi repetida até que todas as amostras estivessem concentradas em um tubo, que foi então usado para extração de DNA (Figura 1C).

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Figura 1: Concentração de amostras de água por centrifugação. (A) Lagoas de amostragem de água e (B) Córregos naturais. (C) Processamento de amostras de água baseado em centrifugação em etapas repetidas quantas vezes forem necessárias (n). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Extração de DNA
O DNA total foi isolado usando um kit comercial de DNA genômico de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). As extrações de DNA foram eluídas em 20 μL de tampão de eluição, e a concentração de DNA foi determinada por um espectrofotômetro UV a 260-280 nm e armazenada a 4 °C até o uso.

amplificação por PCR
Os alvos da PCR foram os 16 genesS rRNA, lipL41 e lipL32, que identificam o DNA do gênero Leptospira e permitem a distinção entre os três clados: patogênico, saprófito e intermediário. Tanto os primers quanto os designs de sondas foram baseados nos trabalhos anteriores de Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. e Branger et al.33,34,35,36,37. A sequência de cada sonda, primer e fragmento amplificado é descrita na Tabela 1, e seu alinhamento com as sequências de referência é fornecido no Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2, Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4 e Arquivo Suplementar 5. Os reagentes de PCR e as condições de termociclagem são descritos na seção de protocolo.

Os produtos de amplificação foram visualizados por separação eletroforética em um gel de agarose a 1% em TAE (40 mM de base Tris, 20 mM de ácido acético e 1 mM de EDTA; pH 8,3), a 60 V por 45 min com detecção de brometo de etídio, conforme mostrado na Figura Suplementar 1. O DNA genômico obtido de cada sorovar foi usado com concentrações variando de 6 x 106 a 1 x 104 cópias equivalentes genômicas (GEq) em cada reação de PCR, com base no tamanho do genoma de L. interrogans (4, 691, 184 pb)38 para Leptospira patogênica, o tamanho do genoma de L. biflexa (3, 956, 088 pb)39 para Leptospira saprófita, e o tamanho do genoma de L. fainei sorovar Hurstbridge cepa BUT6 (4, 267, 324 pb) com número de acesso AKWZ00000000.2.

A sensibilidade das sondas foi avaliada com DNA de cada sorovar patogênico, sorovar L. biflexa Patoc cepa Patoc I e L. fainei sorovar Hurstbridge cepa BUT6 em cada experimento. Para avaliar a especificidade do ensaio de PCR e hibridização dot-blot, foi incluído DNA de bactérias não relacionadas.

Tabela 1: Primers e sondas de PCR para amplificar produtos para identificar os clados patogênicos, saprófitos e intermediários de Leptospira. Clique aqui para baixar esta tabela.

Ensaio de hibridização de ponto-borrão
A técnica é chamada de dot-blot porque os orifícios nos quais a amostra de DNA é colocada têm a forma de um ponto e, quando são sugados para serem fixados no lugar por sucção a vácuo, adquirem essa forma. Essa técnica foi desenvolvida por Kafatos et al.40. A técnica permite a semiquantificação de Leptospira em cada amostra positiva para PCR. O protocolo consiste em uma desnaturação com NaOH 0,4 M à temperatura ambiente, amostras com DNA de Leptospira de 30 ng a 0,05 ng, correspondendo a 6 x 106 a 1 x 104 leptospiras, são borradas em uma membrana de náilon com um aparelho de dot-blot de 96 poços. Após a imobilização, o DNA é ligado à membrana por exposição à luz UV de 120 mJ. Cada sonda de DNA é conjugada com digoxigenina-11 dUTP por uma etapa de catálise de transferase terminal na extremidade 3 '(Digoxigenina é um esteróide vegetal obtido de Digitalis purpurea, usado como repórter41). Após a hibridização rigorosa da sonda de DNA marcada (50 pmol) na temperatura específica no DNA alvo, os híbridos de DNA são visualizados pela reação de quimioluminescência com o anticorpo anti-fosfatase alcalina antidigoxigenina conjugado covalentemente com seu substrato CSPD. A luminescência é capturada pela exposição a um filme de raios-X (Figura 2).

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Figura 2: Etapas do procedimento para o ensaio PCR-dot-blot. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Preparação da amostra

  1. Concentre cada amostra de água em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL por centrifugação a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C. Repita esta etapa, quantas vezes forem necessárias, para concentrar a amostra em um volume de 250 μL.
  2. Use o kit de extração de DNA de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Realize a PCR específica de acordo com a sonda dot-blot que será utilizada (Tabela 1).
    1. Realizar as amplificações em tubos de PCR com o volume final de 25 μL contendo 1 tampão X, 2,5 unidades de Taq polimerase, 1 μM de cada primer, 0,2 mM de cada dNTP, 1,5 mM MgCl2 e 100 ng de DNA alvo de cada amostra de água ou DNA genômico de referência.
    2. Programe a reação de PCR em um termociclador de acordo com as condições de termociclagem (Tabela 2).
    3. Conservar as reacções a 4 °C até à utilização.
  4. Coloque 10 μL de cada produto de PCR a ser blotted em um poço separado de uma placa de 96 poços.
  5. Adicione 40 μL de TE a cada poço e misture por pipetagem.
    NOTA: A placa de 96 poços pode ser selada e armazenada a 4 °C durante a noite. Siga as instruções fornecidas no Arquivo Suplementar 6 para preparar buffers e soluções para o protocolo. A Figura 3 mostra as etapas de preparo da amostra.

Tabela 2: Condições de termociclagem de PCR para os genes 16S, lipL41 e lipL32. Clique aqui para baixar esta tabela.

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Figura 3: PCR e preparo de amostras. Aplicando o protocolo de PCR específico, o produto da PCR foi transferido para uma placa de microtitulação e 40 μL de TE foram adicionados a cada poço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Montagem do aparelho de dot-blot

NOTA: A montagem do aparelho de dot-blot é mostrada na Figura 4. Durante o procedimento, use luvas para manusear as soluções alcalinas e proteja a membrana de náilon contra contaminação.

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Figura 4: Montagem do aparelho de dot-blot. O papel de filtro e a membrana de nylon (previamente umedecida em 10 X SSPE) devem ser dispostos na ordem correta. O conjunto deve ser fixado com os parafusos firmemente antes de aplicar o vácuo. Cada poço precisa ser lavado com TE e os produtos de PCR são carregados em seus respectivos poços. Após a transferência do produto de PCR através da membrana, cada poço é lavado novamente com TE e deixado secar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Corte a membrana de náilon (consulte a Tabela de Materiais) e o papel de filtro em folhas de tamanho 12 x 8,5 cm.
  2. Marque a membrana com um marcador permanente.
  3. Faça um entalhe com uma tesoura em uma das bordas para indicar a orientação correta. Use a marca para lembrar o pedido da amostra.
  4. Umedeça a membrana e o papel de filtro com 10 X tampão de fosfato de sódio salino-EDTA (SSPE; 3 M NaCl, 0.2 M NaH2PO4 e 0.02 M EDTA, pH 7.4) (Arquivo Suplementar 6). Manuseie a membrana com uma pinça limpa e sem corte.
  5. Monte a câmara de mancha de pontos; Primeiro, o papel de filtro, seguido pela membrana sobre o selo de plástico. Prenda a tampa com os parafusos transversalmente.
  6. Conecte a câmara ao vácuo, coloque 100 μL de TE em cada poço, mantenha o vácuo por 1 min e depois pare-o.
  7. Ligue o vácuo em baixa velocidade e carregue 50 μL de cada amostra no poço correspondente na membrana do aparelho de dot-blot (seguindo a distribuição de membrana pré-decidida).
    NOTA: Homogeneizar cada amostra na placa de hemaglutinação de 96 poços antes de colocá-la na câmara de mancha de pontos.
  8. Deixe o vácuo secar a membrana. Se necessário, bata suavemente na câmara para liberar as bolhas na amostra.
  9. Lave cada poço colocando 100 μL de TE nele com um vácuo contínuo e deixando-o secar.
    NOTA: Depois de concluir a transferência, é crucial primeiro desligar a bomba e desconectá-la. Não fazer isso pode resultar em refluxo entrando no aparelho. O DNA não precisa de uma etapa de desnaturação se uma membrana de náilon carregada positivamente for usada, mas se estiver usando outro suporte inerte, uma etapa de pré-desnaturação e desnaturação à base de álcalis pode ser necessária41.

3. Desnaturação e fixação do ADN

NOTA: A Figura 5 ilustra o procedimento de fixação da membrana de DNA.

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Figura 5: Procedimento de fixação da membrana de DNA. O DNA é desnaturado em uma solução alcalina. Em seguida, é neutralizado com 10 X SSPE e a membrana é seca. Em seguida, a membrana é transiluminada. A membrana é reidratada com 2 X SSPE e pré-hibridizada durante a noite. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Incube a membrana com NaOH 0,4 M por 10 min em temperatura ambiente.
  2. Equilibre a membrana com 10 X SSPE por 10 min em temperatura ambiente.
  3. Secar a membrana a 80 °C durante 2 h.
  4. Transilumine com luz UV de 120 mJ por 3 min. Certifique-se de que as amostras estejam orientadas para baixo em direção à fonte de luz UV. Se estiver usando um reticulador UV, confirme se as amostras estão voltadas para cima e repita esta etapa duas vezes.
    NOTA: A membrana deve estar completamente seca antes da reticulação UV. O DNA será imobilizado por uma ligação covalente com a membrana de náilon. Cada reticulação leva cerca de 18 '' a 1 '' com uma dose ideal de irradiação UV, para a maioria dos experimentos de hibridização, de aproximadamente 0,6-0,8 kJ / m2.
    A exposição à irradiação UV é prejudicial aos olhos e à pele. Use equipamento de proteção adequado e evite a exposição à pele nua.
  5. Lave a membrana com 2 X SSPE por 10 min.
  6. Dobre cuidadosamente a membrana e insira-a no tubo de hibridização (use um tubo de microcentrífuga de 15 mL).
  7. Adicionar 10 ml da solução de pré-hibridização (lima suplementar 6) ao tubo e incubar a 42 °C durante a noite. Certifique-se de que o tubo foi devidamente vedado para evitar qualquer vazamento.

4. Hibridização

  1. Remova 5 mL da solução de pré-hibridização do tubo de hibridização. Para utilizar os 5 ml pela segunda vez, mantenha-os noutro tubo e guarde-os a -4 °C.
  2. Adicione 15 μL da sonda marcada (Tabela 1) ao tubo de hibridização. Enxágue a ponta na solução para garantir que a sonda rotulada foi completamente instilada na diluição.
    NOTA: A ligação da sonda de DNA não é tão forte quanto a ligação antígeno-anticorpo. Portanto, mudanças na concentração da sonda ou DNA na amostra podem influenciar a intensidade da fluorescência emitida. As sondas de DNA são estequiométricas, o que significa que o número de moléculas de sonda ligadas ao DNA é equivalente ao número de moléculas de DNA presentes na solução. A Figura 6 mostra a hibridização da sonda.
  3. Incubar a 42 °C durante a noite.
  4. Execute a marcação DIG da sonda de DNA. Siga as instruções especificadas na Tabela 3 para misturar os reagentes e, em seguida, incubar a mistura a 37 °C por 1 h. Em seguida, adicione 80 μL de água destilada e armazene a sonda de cauda a 4 °C.

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Figura 6: Hibridização da sonda. O volume do tampão de hibridização é ajustado e a sonda marcada com digoxigenina é incorporada para permitir a hibridização da sonda durante a noite. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 3: Reagentes para a marcação das sondas com digoxigenina (DIG). Clique aqui para baixar esta tabela.

5. Quimioluminescência (marcação anti-DIG)

  1. Lave a membrana duas vezes com 2 X SSPE/0.1% SDS em temperatura ambiente por 10 min.
  2. Incube a membrana com 5 X SSPE/0,1% SDS na temperatura de recozimento da sonda por 15 min.
    NOTA: Nesta etapa, use um recipiente com tampa para manter a temperatura o maior tempo possível. Garanta uma temperatura uniforme e constante em toda a membrana. O volume aproximado em cada lavagem é de 100 mL da solução indicada.
  3. Lave a membrana uma vez com o Tampão 1 (Arquivo Suplementar 6) em temperatura ambiente por 5 min.
  4. Lave a membrana uma vez com o Tampão 2 (Arquivo Suplementar 6) em temperatura ambiente por 30 min.
  5. Lave a membrana com o tampão 2 e adicione o anticorpo anti-digoxigenina (15 μL) (consulte a Tabela de Materiais) e incube por 45 min (o tempo de incubação pode variar de 30 a 60 min). Este anticorpo secundário marca a sonda para detecção.
    NOTA: A membrana pode ser armazenada no tampão 2 com o anticorpo anti-digoxigenina durante a noite a 4-8 °C. A marcação anti-DIG do processo de quimioluminescência é representada na Figura 7.

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Figura 7: Marcação anti-DIG do processo de quimioluminescência. Os ácidos nucléicos não ligados são removidos com soluções tampão. A sonda é alinhada com o DNA alvo e o excesso é removido. A membrana é bloqueada com o tampão 1 X de bloqueio e o anticorpo anti-DIG é adicionado (1:10000). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Quimioluminescência (aplicação de substrato)

  1. Lave a membrana duas vezes no tampão 1 em temperatura ambiente por 15 min.
  2. Lave uma vez no tampão 3 (consulte o arquivo suplementar 6) em temperatura ambiente por 5 min, permitindo que a membrana drene a maior parte do tampão, deixando-o quase seco.
  3. Adicione CSPD pronto para uso (3-(4-metoxispiro dissódico {1,2-dioxetano-3,2′-(5′-cloro) triciclo-[3.3.1.13,7] decanto}-4-il) fenilfosfato, consulte a Tabela de Materiais) e deixe descansar por 5 min (com os dedos umedecidos homogeneizar o CSPD de um lado para o outro).
  4. Coloque a membrana em um saco plástico transparente (12,5 x 9 cm) que se ajuste à dimensão da membrana. Remova cuidadosamente as bolhas de ar, distribua uniformemente o CSPD e sele o saco a quente.
  5. Incubar a membrana em banho-maria a 37 °C durante 15 min (pode ser até 30 min) e assegurar que a membrana com as amostras é colocada para baixo de modo a ficar bem submersa. Certifique-se de que a temperatura permaneça constante e bem distribuída sobre a membrana.
  6. Seque o saco plástico e fixe-o com fita adesiva em um filme radiográfico já usado. Isso permitirá um manuseio fácil durante o procedimento de exposição.
    NOTA: A Figura 8 mostra a aplicação do substrato do processo de quimioluminescência.

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Figura 8: Aplicação do substrato do processo de quimioluminescência. O anticorpo livre é removido e o substrato CSPD (1:250) é adicionado à membrana. A reação é ativada por incubação a 37 °C e a membrana é disposta para registrar a quimioluminescência em um filme de raios-X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Quimioluminescência (detecção)

  1. Execute o procedimento de exposição. Na câmara escura, prepare as soluções de revelador e fixador (ver Tabela de Materiais) nas respectivas bandejas.
  2. No escuro, coloque cuidadosamente a membrana fixa voltada para um novo filme radiográfico e insira-a em um radiográfico (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Registre o tempo de exposição. O tempo de exposição pode variar de 1 min a 30 min ou mais. Comece com 5 min e ajuste o tempo de acordo.
  4. Umedeça o filme de raios-X na solução reveladora por 1-3 min e enxágue suavemente com água da torneira (15-45 s).
  5. Umedeça o filme de raios-X em solução fixadora por 1-3 min e enxágue suavemente com água da torneira (45 s).
  6. Deixe o filme de raios-X secar ao ar e documente o ensaio em uma caixa de luz branca visível.
    NOTA: Evite agitar a membrana durante o tempo de exposição aos raios X. O processo de detecção é representado na Figura 9.
  7. Prossiga para a interpretação do resultado. No filme de raios-X exposto, os pontos com emissão podem ser localizados visualmente e correspondem aos fragmentos de DNA com a hibridização da sonda. A intensidade do sinal emitido depende da luminescência e da duração da exposição.
    NOTA: As membranas podem ser armazenadas secas entre o papel de filtro por vários meses em temperatura ambiente.

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Figura 9: Detecção do processo de quimioluminescência. Em condições escuras, a membrana é exposta a um filme de raios-X dentro de um de raios-X. Em seguida, foi permitido permanecer durante o tempo de exposição e, em seguida, o filme de raios-X foi revelado e fixado. Finalmente, foi seco ao ar e interpretado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Procedimento de deshibridização por membrana

  1. Lave a membrana duas vezes por 10 min com água destilada.
  2. Lave a membrana por 20 min com NaOH 0,4 M a 53 °C (duas vezes).
  3. Lave duas vezes a membrana por 10 min com 2 X SSPE.
  4. Deixe a membrana secar à temperatura ambiente.
  5. Guarde a membrana e retorne à etapa 3.5 do protocolo.
    NOTA: A membrana pode ser armazenada no tampão de pré-hibridização durante a noite a 4-8 °C. No dia seguinte, reiniciar com uma incubação a 42 °C durante 1 h, permitindo que o tampão de pré-hibridização atinja a temperatura. Em seguida, prossiga para a etapa 3.5 do protocolo.

Resultados

Para avaliar a eficácia da técnica, foi utilizado DNA genômico de culturas puras de cada sorovar de Leptospira , juntamente com a sonda específica do clado. As membranas foram preparadas com 100 ng de DNA genômico por reação de PCR para cada sorovar, seguido por oito DNA genômico de bactérias não relacionadas e concentrações variáveis de DNA genômico dos sorovares ad hoc de Leptospira . Cada ensaio incluiu controle positivo, negativo e sem modelo. Esses DNAs genômicos não relacionados não mostraram afinidade com as sondas dot-blot. A distribuição da membrana e as membranas de dot-blot são mostradas na Figura Suplementar 2, Figura Suplementar 3, Figura Suplementar 4, Figura Suplementar 5, Figura Suplementar 6, Figura Suplementar 7. Em relação ao clado saprófito, utilizando-se o DB_Saproprobe com o produto de PCR de 1059 pb amplificado com os primers DB_16SPathoREV e DB_16SPathoFWD, e o produto de PCR de 517 pb amplificado com os primers DB_16SSapREV e DB_16SSapFWD com DNA genômico de Leptospira biflexa sorovar Patoc cepa Patoc I, foi possível detectar entre 0,05-0,1 ng de DNA saprófito (Figura Suplementar 2 e Figura Suplementar 3). Da mesma forma, para a detecção do clado intermediário, usando o DB_Interprobe com o produto de PCR de 1059 pb amplificado com os primers DB_16SPathoREV e DB_16SPathoFWD, e o produto de PCR de 299-301 pb amplificado com os primers DB_16SInterREV e DB_16SInterFWD com DNA genômico de Leptospira fainei sorovar Hurstbridge cepa BUT6 (Figura Suplementar 4 e Figura Suplementar 5), foi possível detectar cerca de 0,1 ng do DNA intermediário. Da mesma forma, para o clado patogênico usando a sonda patogênica DB_16Scom o produto de PCR de 1059 pb amplificado pelos primers DB_16SPathoREV e DB_16SPathoFWD, ou a sonda DBlipL41 com o produto de PCR de 479 pb amplificado por primers DB_lipL41REV e DB_lipL41FWD com mistura de DNA genômico de sorovares patogênicos de Leptospira , foi possível detectar concentrações de DNA variando de 0,3 a 0,6 ng de DNA patogênico (Figura Suplementar 6 e Figura Suplementar 7).

Os ensaios projetados para identificar os três clados podem ser usados individualmente para cada clado. No entanto, no caso de amostras valiosas e escassas, uma única membrana pode ser preparada com primers DB_16SPathoREV e DB_16S PathoFWD, que amplificam um produto de 1058-1069 pb. Este produto pode então ser hibridizado com o DB_Interprobe, o DB_Saproprobe e o DB_16SPathoprobe individualmente, com a etapa de deshibridização (etapa 8) antes de cada um deles. Essa abordagem permite a identificação de todos os clados na mesma membrana.

Nas amostras de água de campo, foi aplicado o protocolo de sonda lipL32. O DNA de cada amostra de água foi usado na concentração de 100 ng por reação de PCR. Além disso, foi incluído um protocolo de controle de extração de DNA, que consistia em cravar 100 ng de DNA genômico de Leptospira em uma amostra de água destilada de 15 mL. Controles negativos e positivos também foram incluídos (Figura 10).

Tabela 4: Descrição e profundidade das amostras de água. Clique aqui para baixar esta tabela.

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Figura 10: Ensaio de dot-blot de cada amostra de água. (A) Distribuição de membrana e (B) dot-blot do DB_lipL32probe e do produto (262 bp) dos primers DB_lipL32REV e DB_lipL32FWD das amostras de água de campo. A superfície da Lagoa 3 mostra um resultado positivo, e tanto o controle do protocolo de extração quanto os controles positivos têm um sinal intenso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A descrição da amostra de água é mostrada na Tabela 4, e a distribuição e a imagem da membrana de dot-blot são mostradas na Figura 9. O ponto A7 mostra que o DNA da Leptospira estava presente na superfície da lagoa 3. Para determinar a concentração de DNA presente na lagoa 3, foi realizado um ensaio de dot-blot com concentrações conhecidas de DNA de uma mistura de sorovares de Leptospira e a sonda lipL32 (Figura 11). A membrana foi preparada com DNA genômico distribuído de 100 ng a 1 x 10-13 ng em cada ponto. A concentração mínima que pode ser detectada sem dúvida foi de aproximadamente 0,3 ng, correspondendo a 6 x 105 GEq nas amostras de água.

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Figura 11: Ensaio de dot-blot com concentrações conhecidas de DNA de uma mistura de sorovares de Leptospira e a sonda lipL32. (A) Distribuição de membrana e (B) dot-blot do DB_lipL32probe e do produto (262 pb) dos primers DB_lipL32REV e DB_lipL32FWD com diluições (1:2) de uma mistura de DNA genômico de sorovares patogênicos de Leptospira . O sinal da sonda pode ser facilmente detectado até 3,91 x 10-1 ng de mistura de DNA de Leptospira . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Produtos de amplificação de PCR visualizados por separação eletroforética. Pista 1. Marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder. Pista 2. PCR baseado no gene lipL32 com mistura de DNA patogênico de Leptospira como molde; Pista 3. PCR baseado no gene lipL41 com mistura de DNA patogênico de Leptospira como molde; Pista 4. PCR baseado no gene 16S rRNA com mistura de DNA patogênico de Leptospira como modelo; Pista 5. PCR baseado no gene 16S rRNA com primers DB_16SSapREV e DB_16SSapFWD, e Leptospira biflexa sorovar Patoc cepa Patoc I DNA como molde; Pista 6. PCR baseado no gene 16S rRNA com primers DB_16SPathoREV e DB_16SPathoFWD, e Leptospira biflexa sorovar Patoc cepa Patoc I DNA como molde; Pista 7. PCR baseado no gene 16S rRNA com primers DB_16SInterREV e DB_16SInterFWD, e Leptospira fainei, sorovar Hurstbridge cepa BUT6 DNA como molde; Pista 8. PCR baseado no gene 16S rRNA com primers DB_16SPathoREV e DB_16SPathoFWD, e Leptospira fainei, sorovar Hurstbridge cepa BUT6 DNA como modelo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: (A) Distribuição da membrana e (B) dot-blot do DB_Saproprobe e do produto (1059 pb) dos primers DB_16SPathoREV e DB_16SPathoFWD do DNA genômico de Leptospira biflexa sorovar Patoc, Patoc I. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: (A) Distribuição de membrana e (B) dot-blot do DB_Saproprobe com o produto (517 pb) dos primers DB_16SSapREV e DB_16SSapFWD do DNA genômico de Leptospira biflexa sorovar Patoc, Patoc I. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: (A) Distribuição da membrana e (B) dot-blot do DB_Interprobe com o produto (1059 pb) dos primers DB_16SPathoREV e DB_16SPathoFWD e DNA genômico de Leptospira fainei sorovar Hurstbridge cepa BUT6. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 5: (A) Distribuição de membrana e B) dot-blot do DB_Interprobe e do produto (299-301 pb) dos primers DB_16SInterREV e DB_16SInterFWD com DNA genômico de Leptospira fainei sorovar Hurstbridge cepa BUT6. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 6: (A) Distribuição de membrana e (B) dot-blot da DB_16SPathoprobe e o produto (1059 bp) dos primers DB_16SPathoREV e DB_16SPathoFWD com mistura de DNA genômico de sorovares patogênicos de Leptospira . Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 7 suplementar: (A) Distribuição de membrana e (B) dot-blot do DB_lipL41probe com o produto (479 pb) de primers DB_lipL41REV e DB_lipL41FWD com mistura de DNA genômico de sorovares patogênicos de Leptospira . Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Alinhamento da espécie saprófita de Leptospira com os primers e sonda com base na sequência de RNA ribossômico 16S . Os primers são destacados em negrito e preto para sua identificação, com sua direção indicada por setas pretas. A sonda é indicada em negrito e destacada em cinza, e sua posição é marcada com uma linha cinza. As sequências alinhadas são destacadas em cinza claro, enquanto as sequências não correspondentes estão em preto e branco. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Alinhamento de espécies intermediárias de Leptospira com os primers e sonda com base na sequência de RNA ribossômico 16S . Os primers são destacados em negrito e preto para sua identificação, com sua direção indicada por setas pretas. A sonda é indicada em negrito e destacada em cinza, e sua posição é marcada com uma linha cinza. As sequências alinhadas estão em cinza claro, enquanto as sequências não correspondentes são mostradas em preto e branco. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Alinhamento de espécies patogênicas de Leptospira com os primers e sonda com base na sequência do gene lipL32. Os primers são destacados em negrito e preto para sua identificação, com sua direção indicada por setas pretas. A sonda é indicada em negrito e destacada em cinza, e sua posição é marcada com uma linha cinza. As sequências alinhadas estão em cinza claro, enquanto as sequências não correspondentes são mostradas em preto e branco. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Alinhamento de espécies patogênicas de Leptospira com os primers e sonda com base na sequência do gene lipL41. Para sua identificação, os primers estão em negrito e destacados em preto, com sua direção indicada por setas pretas. A sonda é indicada em negrito e destacada em cinza escuro, e sua posição é marcada com uma linha cinza. As sequências alinhadas estão em cinza claro, enquanto as sequências não correspondentes estão em preto e branco. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 5: Alinhamento de espécies de Leptospira com os primers direcionados à sequência de RNA ribossômico 16S e as sondas para espécies saprófitas, intermediárias e patogênicas. Para sua identificação, os primers são indicados em negrito e destacados em preto, com sua direção marcada por setas pretas. As sondas são indicadas em negrito e destacadas em cinza, com suas posições representadas por linhas cinza. As sequências alinhadas estão em cinza claro e as sequências não correspondentes estão em branco e preto. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 6: Tampões e soluções para o ensaio de dot-blot. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

As etapas críticas da técnica de dot-blot incluem (1) imobilização de DNA, (2) bloqueio dos locais de ligação livres na membrana com DNA não homólogo, (3) a complementaridade entre a sonda e o fragmento alvo sob condições de recozimento, (4) remoção da sonda não hibridizada e (5) a detecção da molécula repórter41.

O PCR-Dot-blot tem certas limitações, como a técnica não fornece informações sobre o tamanho do fragmento hibridizado37, requer deshibridização de uma única membrana antes da rehibridização com uma segunda ou terceira sonda e requer tempo e esforço consideráveis para o resultado final.

Essa técnica tem mostrado consistência com outras técnicas moleculares42,43 e suas aplicações. Dot-blot reverso, nanogold dot-blot21 e dot-ELISA42 têm sido empregados para a detecção de genes específicos em organismos como Treponema44, Borrelia burgdorferi45, E. coli46, Helicobacter pylori47 e Mycobacterium tuberculosis48,49 com base no16 S rRNA29,43, e para a detecção de DNA ou RNA de plantas vírus41. O limite de detecção (LOD) definido como a menor concentração do microrganismo que pode ser medida de forma consistente e confiável por esta técnica50, variou de 100 pg (5 x 104 bactérias) para H. pylori47, a uma única célula de B. burgdorferi em amostras clínicas45, e um fg, que é menor que uma célula, de M. tuberculosis48,49.

Um aspecto valioso dessa metodologia combinada é sua capacidade de estender o limite de detecção em uma ordem, superando resultados falsos negativos devido a duas condições de amostra que podem levar a resultados inconsistentes: (1) amostras com DNA insuficiente ou (2) contaminação da amostra, permitindo 100% de detecção de amostras positivas 25,45,47,48,49. O PCR-Dot-blot tem a capacidade de detectar quantidades menores de produtos amplificados do que aqueles que podem ser detectados na eletroforese em gel de agarose, e evita a contaminação como consequência de segundas etapas de amplificação, como na PCR aninhada e semi-aninhada. Essas vantagens são particularmente críticas ao trabalhar com amostras ambientais contendo baixa carga bacteriana, que podem conter uma gama mais ampla de inibidores e DNA de fontes não relacionadas que podem interferir nas técnicas moleculares.

Trabalhos anteriores sugerem que as leptospiras podem ser identificadas por sondas de DNA marcadas com fotobiotina, atingindo um LOD de 5 pg (5 x 103 leptospiras) 51 . As sondas marcadas com DIG detectam 0,1-1 pg (102 leptospiras), enquanto 32sondas marcadas com P detectam 1-5 pg (750 a 1000 leptospiras) 51 e as sondas marcadas com biotina detectam 5 pg (2500 leptospiras) 52 . Além disso, 32sondas marcadas com P para a saprófita Leptospira atingiram um LOD de 1,95 ng e para a patogênica Leptospira, 3,9 ng53. Neste estudo, LODs semelhantes foram estabelecidos para os três clados. O LOD para espécies patogênicas foi de aproximadamente 0,3 ng de DNA genômico (6-8 x 104 GEq) (Figura 11), e para as espécies saprófitas e intermediárias, caiu para 0,1 ng (2 x 104 GEq). Notavelmente, pesquisas anteriores foram conduzidas usando culturas puras de Leptospira 51 e soros de hamsters dourados infectados experimentalmente, com o objetivo de detectar Leptospira patogênica 54,55 e aplicar hibridização de DNA com 32P rotulado como uma ferramenta para a identificação e classificação de Leptospira56. Essas sondas exibem alta especificidade e não mostram hibridização cruzada com DNA não homólogo de outros microrganismos 19,51,54,55,56,57, e podem distinguir mesmo entre espécies intimamente relacionadas, como Leptonema57. Da mesma forma, neste trabalho, não foi observada hibridização com DNA não homólogo. Embora as sondas não isotópicas não sejam tão sensíveis quanto as sondas isotópicas58 ou outras técnicas43, pode-se esperar que a combinação PCR-Dot-blot permita um aumento de até dez vezes na sensibilidade em comparação com outras técnicas baseadas em PCR, como visto na detecção de Leishmania e do herpesvírus bovino 4 (BHV4)24,26.

Por outro lado, o ensaio de dot-blot para identificação de Leptospira tem sido mais frequentemente empregado com anticorpos e, ultimamente, com anticorpos monoclonais como alternativa para o diagnóstico de humanos e animais em amostras de urina 59,60,61,62. Nesses estudos, a amostra é processada diretamente na membrana sem etapas anteriores, e os anticorpos têm como alvo proteínas de superfície específicas de Leptospira associadas à patogênese. O ELISA Mab-Dot-blot, por exemplo, mostra alta sensibilidade e especificidade, detectando apenas 1 μg de homogeneizado bacteriano62. Os resultados obtidos no ensaio Mab-Dot-blot podem ser comparáveis aos ensaios de PCR, que normalmente têm LOD em torno de 103 leptospiras/ml de urina ou 9,3 ng de homogeneizado de Leptospira 63. A quantidade de DNA genômico que pode ser amplificada por PCR é de 100 células (500 fg de DNA)61. Esses estudos anteriores utilizaram culturas puras ou amostras clínicas sem procedimentos de enriquecimento e foram orientados para melhor diagnóstico. Dado que os ratos infectados podem excretar até 107 leptospiras / mL de urina64, e os cães podem excretar entre 102 a 106 leptospiras / mL de urina65, servindo como fontes de contaminação para corpos d'água, as amostras ambientais requerem enriquecimento da leptospira. A amplificação in vitro do DNA alvo por PCR antes do blotting permite uma melhora na sensibilidade do procedimento de até dez vezes52,55. Normalmente, o produto amplificado por uma PCR de ponto final não seria visualizado em uma eletroforese em gel de agarose; no entanto, torna-se evidente através da hibridização específica da sonda marcada com DIG no ponto-blot.

Embora muitas pesquisas sobre Leptospira e leptospirose tenham se concentrado no diagnóstico de doenças, pouco se sabe sobre sua ecologia em corpos d'água e sua distribuição dentro deles. A técnica de PCR-Dot-blot aumenta a caixa de ferramentas para o estudo de Leptospira e leptospirose, oferecendo a vantagem de rastrear um grande número de amostras e agilizar os resultados e a interpretação. PCR-Dot-blot é uma técnica relativamente barata, simples e não radioativa que pode acomodar várias sondas em uma única membrana. Além disso, elimina a necessidade de equipamentos sofisticados e fluxos de trabalho complexos, que podem ser desafiadores em ambientes com recursos limitados.

O impacto deste estudo reside em sua aplicação futura para estudar grandes massas de água em diferentes profundidades, bem como outros nichos ecológicos e tipos de amostras, incluindo solo, água estagnada, fezes, sangue e tecidos.

Em conclusão, este trabalho demonstra a aplicação da técnica de PCR-Dot-blot, baseada na marcação de digoxigenina de sondas de DNA para a identificação dos três clados dentro do gênero Leptospira. Este método agiliza o processo de identificação, reduzindo-o a uma única etapa de amplificação e permite três hibridizações simultâneas ou três hibridizações consecutivas usando uma única membrana. Os limites de detecção alcançados com esta técnica são semelhantes aos alcançados com sondas radioativas53, tornando-a uma ferramenta valiosa para identificar Leptospira em amostras de água de fontes naturais. Consequentemente, essa técnica oferece maior sensibilidade e fornece resultados precisos e consistentes ao avaliar amostras com quantidades mínimas de DNA bacteriano. Serve como uma abordagem alternativa para o estudo da dinâmica de Leptospira em corpos d'água e pode auxiliar na avaliação e vigilância de amostras ambientais mais amplas, auxiliando na implementação de medidas preventivas contra a transmissão desse microrganismo.

Em caso de dificuldades com a técnica, considere os seguintes destaques de solução de problemas: (1) Se os pontos tiverem formas irregulares, verifique se o sistema de vácuo está bem fechado transversalmente e repita a transferência. (2) Caso o tubo de hibridização se rompa durante o procedimento noturno, fazendo com que a membrana perca o tampão de hibridização, consulte a seção "Procedimento de deshibridização" e reinicie o processo. (3) Se nenhum ponto estiver visível, não descarte a membrana; prossiga para a seção "Procedimento de deshibridização" para repetir as etapas de hibridização. (3) Se forem observadas áreas brancas irregulares no filme de raios-X revelado, certifique-se de que nenhuma bolha de ar fique presa durante o processo de vedação do saco. (5) Se forem observadas áreas pretas irregulares no filme de raios-X revelado, confirme se o CSPD foi completamente distribuído usando dampdedos amortecidos. (6) Se o filme de raios-X mostrar sombras dos pontos, certifique-se de que o filme não seja movido durante o tempo de exposição.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Estamos em dívida com a coleção Leptospira do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Nacional Autônoma do México. Agradecemos a generosa doação das cepas de referência de Leptospira ; Leptospira fainei sorovar Hurstbridge cepa BUT6 e Leptospira biflexa sorovar Patoc cepa Patoc I para o Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Agradecemos ao Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, Coordenador do CIBAC, e ao pessoal pelo apoio logístico. A EDT estava no âmbito do programa Terminal Project para alunos de graduação da Universidade Autônoma Metropolitana-Campus Cuajimalpa. Reconhecemos o Biorender.com software para a criação das figuras 1 e 3 a 9.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
REAGENTES
Kit de extração de DNA PurelinkInvitrogenK182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (kit de polimerase Taq de PCR de ponto final)PromegaM3001
Whatman, grau 1,membranas de nylon MerkWHA1001325
, carregado positivamente Rolo 30cm x 3 mRoche
Anti-Digoxigenina-AP, fragmentos Fab Ovino Policlonal Anticorpo primárioRoche11093274910
Base Média EMJHDifcoS1368JAA
Leptospira Enriquecimento EMJHDifcoBD 279510
Reagente de bloqueioRoche11096176001
CSPD pronto para uso 3-(4-metoxispiro {1,2-dioxetano-3,2′-(5′-cloro) triciclo-[3.3.1.13,7] decanto}8-4-il) fenil fosfatoMerk11755633001
Ácido desoxirribonucléico do esperma do arenqueSigma AldrichD3159
Desenvolvedor CarestreamCarestream Health IncGBX5158621
Digoxigenina-11-ddUTPRoche11363905910
EDTA, Sal Dissódico (Di-hidratado)PromegaH5032
Ficoll 400Sigma AldrichF8016
Fixador Carestream CarestreamHealth IncGBX 5158605
Lauril sulfato Sal de Sódio (Dodecil sulfato de sódio; SDS) C12H2504SNaSigma AldrichL5750
N-Lauroilsarcosina sal de sódio CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONaSigma AldrichL-9150É um surfactante aniônico
Polivinilpirrolidona (PVP-40)Sigma AldrichPVP40
Polietilenoglicol Monolaurato de sorbitano (Tween 20)Sigma Aldrich9005-64-5
Cloreto de sódio (NaCl)Sigma Aldrich7647-14-5
Dodecil sulfato de sódio (SDS)Sigma Aldrich151-21-3
Hidróxido de sódio (NaOH)Sigma Aldrich1310-73-2
Fosfato de sódio dibásico (NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-79-4
Transferase terminal, cloridratoTris Roche3289869103
(Tris HCl)Sigma-Aldrich1185-53-1
SSPE 20XSigma-AldrichS2015-1LPode ser feito em casa seguindo Arquivo Suplementar 6
PrimersSigma-AldrichSob demandaSiga a tabela 1
SondasSigma-AldrichSob demandaSiga a tabela 1
Equipment
Nanodrop™ Um EspectrofotômetroThermo-ScientificND-ONE-W
Microcentrífuga refrigerada Sigma 1-14K, adequada para centrifugação de tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a 14.000 rpmSigma-Aldrich1-14K
, faixa 2-20 µ l, 20-200 µ lGilsonSKU:F167360
Tubos de microcentrífuga descartáveis de 1,5 ml (autoclavados)AxygenMCT-150-SP
Descartáveis 600 µ l tubos de microcentrífuga (autoclavados)Axygen3208
1-10 µ lAxygenT-300
1-200 µ lAparelho AxygenTR-222-Y
Dot-Blot Bio-DotBIORAD1706545
Portátil Hergom Sucção Hergom7E-A
Caixa de Luz Científica (Luz Visível PH90-115V)HoeferPH90-115V
UV CrosslinkerHoeferUVC-500
Thermo Hybaid PCR Express ThermocyclerHybaid
radiográfico com placa IP14 X 17Fuji
Papel de filtro 11417240001 de recombinante Pipetas ajustáveis desinfetadas Pontas de pipeta descartáveis Pontas de pipeta descartáveis HBPX110

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