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Artigo de método

Janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas murino

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DOI:

10.3791/65498

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6 de outubro de 2023

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1Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Integrated Imaging Program for Cancer Research, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 5Breast Center, Peking University People's Hospital, 6Department of Microbiology & Immunology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 7Montefiore Einstein Cancer Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 8Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 9Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 10Department of Cell Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo para o implante cirúrgico de uma janela óptica de demora estabilizada para imagens de resolução subcelular do pâncreas murino, permitindo estudos seriados e longitudinais do pâncreas sadio e doente.

Resumo

A fisiologia e fisiopatologia do pâncreas são complexas. Doenças do pâncreas, como pancreatite e adenocarcinoma pancreático (ADP), apresentam alta morbidade e mortalidade. A imagem intravital (IVI) é uma técnica poderosa que permite a obtenção de imagens de alta resolução de tecidos em estados saudáveis e doentes, permitindo a observação em tempo real da dinâmica celular. A IVI do pâncreas murino apresenta desafios significativos devido à natureza visceral profunda e complacente do órgão, o que o torna altamente propenso a danos e artefatos de movimento.

Descreve-se aqui o processo de implantação do Stabilizado Window para Intravital imageamento do pâncreas Pmurino (SWIP). O SWIP permite IVI do pâncreas murino em estados normais saudáveis, durante a transformação do pâncreas saudável para pancreatite aguda induzida por ceruleína, e em estados malignos, como tumores pancreáticos. Em conjunto com células geneticamente marcadas ou a administração de corantes fluorescentes, o SWIP permite a medição da dinâmica de célula única e subcelular (incluindo migração de célula única e coletiva), bem como imagens seriadas da mesma região de interesse durante vários dias.

A capacidade de capturar a migração de células tumorais é de particular importância, pois a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer no ADP é a carga metastática esmagadora. A compreensão da dinâmica fisiológica das metástases no ADP é uma necessidade crítica não atendida e crucial para melhorar o prognóstico dos pacientes. Em geral, o SWIP fornece melhor estabilidade de imagem e expande a aplicação de IVI no pâncreas saudável e doenças malignas do pâncreas.

Introdução

As doenças pancreáticas benignas e malignas são potencialmente fatais, com lacunas consideráveis no entendimento de sua fisiopatologia. A pancreatite, inflamação do pâncreas, é a terceira maior causa de internações e readmissões hospitalares relacionadas a doenças gastrointestinais nos EUA e está associada a substancial morbidade, mortalidade e carga socioeconômica1. Classificado como a terceira causa de morte relacionada aocâncer2, o adenocarcinoma ductal do pâncreas (ADP) é responsável pela maioria das neoplasias malignas pancreáticas3 e prenuncia uma baixa taxa de sobrevida em 5 anos de apenas 11%2. A principal causa de mortalidade relacionada ao câncer no ADP é a sobrecarga metastática. Infelizmente, a maioria dos pacientes apresenta doença metastática. Portanto, compreender a dinâmica das metástases no ADP é uma necessidade crítica não atendida no campo da pesquisa em câncer.

Os mecanismos subjacentes à inflamação e à cascata metastática do pâncreas são pouco compreendidos. Um dos principais contribuintes para essa lacuna no conhecimento é a incapacidade de observar a dinâmica celular pancreática in vivo. A observação direta dessas dinâmicas celulares promete desvendar alvos críticos para alavancar e melhorar o diagnóstico e o tratamento de pessoas com doença pancreática.

A imagem intravital (IVI) é uma técnica de microscopia que permite aos pesquisadores visualizar e estudar processos biológicos em animais vivos em tempo real. O IVI permite a visualização direta e de alta resolução da dinâmica intracelular e microambiental in vivo e dentro do ambiente nativo do processo biológico em questão. Portanto, a IVI permite a observação in vivo de processos patológicos e saudáveis.

As modalidades contemporâneas de imagem de corpo inteiro, como RM, PET e TC, oferecem excelentes visões de órgãos inteiros e podem revelar patologias, mesmo antes do início dos sintomasclínicos4. Eles são incapazes, no entanto, de atingir resolução de célula única ou revelar os estágios iniciais da doença-pancreatite ou malignidade.

Pesquisas anteriores utilizaram IVI de resolução unicelular para observar doenças benignas e malignas de tumores cutâneos5,6, mama7, pulmão8, fígado9, cérebro 10 epâncreas11, levando a insights sobre mecanismos de progressão da doença12. No entanto, o pâncreas murino apresenta obstáculos significativos para alcançar a resolução unicelular usando IVI, principalmente devido à sua localização visceral profunda e alta complacência. Além disso, é um órgão ramificado e difusamente distribuído dentro do mesentério que se conecta ao baço, intestino delgado e estômago, dificultando o acesso. O tecido também é altamente sensível ao movimento causado pelo peristaltismo adjacente e pela respiração. A minimização do movimento do pâncreas é essencial para a microscopia de resolução unicelular, pois artefatos de movimento de até alguns mícrons podem borrar e distorcer as imagens, impossibilitando o rastreamento da dinâmica de células individuais13.

Para a realização da IVI, uma janela de imagem abdominal (AIW) deve ser implantada cirurgicamente 9,11. Para implantar o AIW cirurgicamente, uma moldura de janela metálica é suturada na parede abdominal. Em seguida, o órgão de interesse é fixado ao quadro com adesivo de cianoacrilato. Embora isso seja suficiente para alguns órgãos internos rígidos (por exemplo, fígado, baço, tumores rígidos), as tentativas de obtenção de imagens do pâncreas murino saudável são comprometidas pela estabilidade lateral e axial subótima, devido à textura compatível e à arquitetura complexa do tecido14. Para resolver essa limitação, Park et al.14 desenvolveram uma janela de imagem projetada especificamente para o pâncreas saudável. Esta Janela de Imagem do Pâncreas (PIW) minimiza a influência do movimento intestinal e da respiração, incorporando uma prateleira metálica horizontal dentro da moldura da janela, logo abaixo da lamínula, estabilizando o tecido e mantendo seu contato com o vidro da tampa. Embora o PIP ofereça maior estabilidade lateral, observamos que essa janela ainda demonstra desvio axial e, adicionalmente, impede a obtenção de imagens de grandes tumores sólidos devido ao estreito espaço entre a plataforma metálica e o lamínulo15.

Para resolver essas limitações, desenvolvemos o Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP), uma janela de imagem implantável capaz de obter imagens estáveis a longo prazo do pâncreas saudável e doente (Figura 1)15. Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para o procedimento cirúrgico usado para implantar o SWIP. Embora o objetivo primário tenha sido estudar os mecanismos dinâmicos envolvidos na metástase, este método também pode ser utilizado para explorar vários aspectos da biologia e patologia do pâncreas.

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Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina Albert Einstein (IACUC).

1. Passivação de janelas

NOTA: A passivação do aço inoxidável limpa o metal de contaminantes e cria uma fina camada de óxido que aumenta muito a biocompatibilidade do metal com os tecidos moles, mesmo além do titânio16.

  1. Inicie o processo de passivação lavando as esquadrias ópticas com uma solução de detergente enzimaticamente ativa a 1% (p/v).
  2. Submergir as armações em uma solução de hidróxido de sódio a 5% (p/v) a 70 °C por 30 min dentro de um frasco de vidro.
  3. Retire as armações e enxágue-as com água deionizada.
  4. Mergulhe as armações em uma solução de ácido cítrico a 7% (p/v) a 55 °C por 10 min dentro de um novo frasco de vidro.
  5. Retire as armações e enxágue-as com água deionizada novamente.
  6. Repita o passo 1.2 e, finalmente, lave as esquadrias das janelas com água deionizada uma última vez.

2. Preparo para implante de tumor ou cirurgia de janela

NOTA: Para estudos de tumores pancreáticos, as células tumorais devem ser implantadas e permitir que cresçam em tumores evidentes. Para visualizar as células tumorais in vivo, recomenda-se o uso de células geneticamente alteradas para expressar proteínas fluorescentes, como a Dendra2. O uso de rótulos de proteínas fluorescentes brilhantes atenuará possíveis problemas com a autofluorescência tecidual. Outras potenciais proteínas fluorescentes, corantes e modelos de camundongos fluorescentes codificados geneticamente que podem ser utilizados têm sido discutidos em outros estudos17,18. Para evitar a contaminação do campo operatório, realize o procedimento cirúrgico em uma capela ou gabinete de fluxo laminar e garanta que áreas distintas sejam usadas para preparação, cirurgia e recuperação.

  1. Antes da cirurgia, esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em autoclave e, se necessário, usar um esterilizador de esferas quentes para procedimentos subsequentes. Certifique-se de que a cirurgia emprega uma técnica apenas de pontas.
  2. Ligue a almofada cirúrgica aquecida e o esterilizador de contas e aguarde que atinja a temperatura de operação adequada. A temperatura da almofada de aquecimento deve ser monitorada com um termômetro de superfície para evitar possíveis queimaduras. Coloque um pano estéril sobre a almofada de aquecimento se a temperatura não puder ser adequadamente controlada.
    NOTA: A temperatura corporal durante procedimentos curtos (≤20 min), como tumor e implante de janela, é minimamente afetada durante o uso de um coxim cirúrgico aquecido. No entanto, períodos mais longos de anestesia, como durante imagens de lapso de tempo prolongado, exigem que o mouse seja colocado em uma câmara aquecida para manter a temperatura corporal.
  3. Anestesiar o camundongo com isoflurano a 5% em câmara de anestesia.
  4. Passo crítico: Abaixe a anestesia para 2% quando o rato estiver inconsciente. Monitorar cuidadosamente o nível de anestesia e os sinais vitais do mouse (por exemplo, usando um oxímetro de pulso)19.
  5. Coloque uma pequena gota de lubrificante ocular em cada olho do rato para evitar o ressecamento da córnea.
  6. Antes da cirurgia, aplique creme depilatório generosamente no abdome superior esquerdo para remover os pelos. Após 20 s, use papel higiênico umedecido para limpar firmemente o cabelo e creme depilatório. Repita o processo conforme necessário até que todos os cabelos sejam removidos da área cirúrgica.
  7. Injetar 10 μL de buprenorfina (0,1 mg/kg) diluídos em 90 μL de PBS por via subcutânea para garantir analgesia pré-operatória.

3. Implante de tumor de pâncreas

  1. Preparar alíquotas de células tumorais na concentração desejada (com base no tempo de duplicação de células tumorais). Coloque a suspensão celular em uma seringa de insulina e mantenha-a no gelo. Para seguir esse protocolo, utilizar10 6 células tumorais KPC singênicas 20 suspensas em no máximo 50 μL de PBS, seguindo o protocolo de injeção ortotópica adaptado de Erstad etal.21
    NOTA: Esta linhagem celular injetada nesta concentração produziu rotineiramente tumores palpáveis ou apropriadamente grandes por 10-14 dias. Subclones dessa linhagem celular e de outras linhagens de células pancreáticas precisariam ser avaliados quanto a concentrações e prazos apropriados para produzir tumores de tamanho adequado).
  2. Lave as mãos usando sabão antisséptico.
  3. Antes de cada nova cirurgia, coloque novas luvas estéreis.
  4. Transfira o mouse para o capuz cirúrgico estéril e coloque-o em decúbito lateral parcial direito.
  5. Fixe os membros com fita adesiva de papel.
    NOTA: O uso adequado dos instrumentos é importante durante todo o procedimento. Exemplos de como segurar pinças, tesouras Castroviejo e a ferramenta de captação a vácuo são mostrados na Figura 2A-C.
  6. Esterilizar o abdome com antisséptico (Figura 2D).
  7. Certifique-se de que o animal está totalmente anestesiado realizando um teste de pinça dos dedos.
  8. Realizar incisão subcostal esquerda de 10 a 15 mm na pele com pinça e tesoura de Castroviejo (Figura 2E).
  9. Controle a hemostasia com cotonetes ou cautério quando/quando necessário.
  10. Divida cuidadosamente o músculo subjacente com pinça e tesoura de Castroviejo para entrar no peritônio (Figura 2F).
  11. Usando cotonetes estéreis, exteriorizar atraumaticamente o pâncreas e o baço.
  12. Jogue o pâncreas para fora para que não haja dobras (Figura 2G).
  13. Identificar o local de injeção do tumor desejado no corpo ou cauda do pâncreas (longe dos vasos sanguíneos).
  14. Passo crítico: Após o posicionamento cuidadoso do pâncreas, utilizar pinça para dar tensão ao tecido e inserir a ponta da seringa de insulina, com o bisel voltado para cima, no local desejado do pâncreas a uma profundidade de 4-5 mm (Figura 2H).
  15. Injete lentamente a solução de células tumorais. Procure uma pequena bolha que confirme o sucesso da injeção (Figura 2I).
  16. Retornar cuidadosamente o pâncreas para o abdome sem perturbar a bolha de injeção de células tumorais (Figura 2J).
  17. Com fio absorvível de polidioxanona 5-0, fechar-se primeiro a camada muscular e, em seguida, a pele com pontos interrompidos (Figura 2K-N).
  18. Cubra a incisão com cola de cianoacrilato (Figura 2O) e, em seguida, devolva o rato a uma gaiola limpa sob uma lâmpada de aquecimento para recuperação. Administrar antibióticos em água potável para prevenir a infecção. Monitore os ratos e permita que eles se recuperem completamente da cirurgia.
    NOTA: Os antibióticos são administrados conforme exigido pelo protocolo da IACUC. Todos os animais são alojados individualmente.
  19. Deixe o tumor se desenvolver por 10-14 dias até que seja palpável através da parede abdominal.

4. Cirurgia da janela do pâncreas

  1. Quando os animais estiverem prontos para exames de imagem, inicie a cirurgia de implante de janela. Para começar, lave as mãos com sabão antisséptico.
  2. Antes de cada nova cirurgia, coloque luvas estéreis frescas.
  3. No banco cirúrgico aquecido, colocar o mouse em decúbito lateral direito para expor o abdome esquerdo.
  4. Ancorar os membros anteriores e posteriores do mouse ao estágio cirúrgico aquecido cranial e caudalmente usando fita adesiva de papel. Verifique se o baço (abaixo da pele) é visível dentro do campo cirúrgico (Figura 3A).
  5. Para manter a esterilidade, desembale todos os instrumentos cirúrgicos no capô.
  6. Desinfete o local cirúrgico esfregando a pele do rato com uma generosa aplicação de antisséptico.
  7. Certifique-se de que o animal está totalmente anestesiado realizando um teste de pinça dos dedos.
  8. Passo crítico: Levantar a pele do quadrante superior esquerdo do abdome com pinça e fazer uma incisão circular de ~10 mm na pele e musculatura com tesoura de Castroviejo (Figura 3B,C).
  9. Controle o sangramento e mantenha a hemostasia usando cotonetes ou cautério, quando necessário.
  10. Localize o pâncreas, que está preso ao baço, e identifique a direção em que o pâncreas está deitado dentro da incisão para decidir onde o ponto cruzado de suporte deve ser colocado.
  11. Usando sutura de seda 5-0, coloque o primeiro ponto no local desejado na camada muscular. Empate este final com 3-5 nós. (Figura 3D,E)
  12. Continue a costurar diretamente através da incisão. Corte e deixe uma cauda de ~5 cm (Figura 3F).
  13. Repetir os passos 4.11 e 4.12 perpendicularmente ao primeiro ponto (Figura 3G,H).
  14. Passo crítico: Levante e posicione suavemente o pâncreas sobre o ponto cruzado (Figura 3I,J). Tome cuidado para não danificar o pâncreas durante a manipulação.
  15. Passo crítico: Com fio de seda 5-0, realizar um ponto bolsa-corda a ~1 mm do orifício, circunferencialmente, entrelaçando a pele e a camada muscular (Figura 3K).
  16. Posicione a moldura da janela de modo que as bordas da incisão circular fiquem assentadas dentro do sulco da janela (Figura 3L).
  17. Aperte a janela implantada amarrando firmemente a seda 5-0.
  18. Carregar 100 μL de adesivo líquido de cianoacrilato na seringa de 1 mL.
  19. Seque o tecido aplicando um fluxo delicado de ar comprimido por ~10 s.
  20. Aperte a moldura da janela por sua borda externa com pinça e levante-a suavemente para garantir a separação do pâncreas da superfície inferior da moldura da janela.
  21. Etapa crítica: Dispensar uma fina camada de adesivo líquido de cianoacrilato ao longo do recesso da janela (Figura 3M). Certifique-se de não obter nenhum do adesivo no tecido do pâncreas.
  22. Usando captadores a vácuo, levante a tampa de 5 mm.
  23. Coloque cuidadosamente a tampa dentro do recesso no centro da moldura da janela óptica. Segure com leve pressão, permitindo que o adesivo de cianoacrilato se ajuste (~25 s).
  24. Separe a tampa dos captadores a vácuo usando pinças.
  25. Apertar as suturas de ponto cruzado para fixar o pâncreas confortavelmente à lamínula (Figura 3N,O). Nota: Não aperte demais o ponto cruz, pois pode causar danos e isquemia ao pâncreas.
  26. Corte as extremidades da sutura.
  27. Retire a fita do mouse.
  28. Desligue o vaporizador de isoflurano.
  29. Deslocar o rato para uma gaiola limpa ou diretamente para o microscópio intravital.
  30. Alojar os animais individualmente após a cirurgia de janela e monitorá-los até a recuperação completa.
  31. As imagens são então realizadas em microscópio multifóton bilaser, como descrito anteriormente 22,23,24 Para longas sessões de imagem, o camundongo é colocado em uma câmara aquecida para manter a temperatura corporal e fornecido com fluidos de suporte de acordo com os padrões da IACUC.

5. Tratamento com Ceruleína para a indução de pancreatite

  1. Para investigar o início da pancreatite, tratar camundongos saudáveis com cerúleina após a implantação do SWIP. Certifique-se de que os ratos estão em jejum durante 14-18 h e recebem água ad libitum antes da administração de ceruleína.
  2. Injetar 50 μg/kg de ceruleína em 100 μL de 1x DPBS estéril por via intraperitoneal a intervalos de 1 h para até oito injeções. Administrar um volume equivalente de 1x DPBS isoladamente, injetado intraperitonealmente, aos camundongos controle.
  3. Após a aquisição de imagem, sacrificar os camundongos 24 h após a primeira injeção por deslocamento cervical de acordo com os padrões da IACUC.
  4. Realizar exames de imagem em microscópio multifóton bilaser conforme descrito anteriormente22,23,24. Para longas sessões de imagem, coloque o mouse em uma câmara aquecida para manter a temperatura corporal e fornecer-lhe fluidos de suporte de acordo com os padrões da IACUC.

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Resultados

A Figura 1, adaptada de Du et al.15, mostra imagens de um filme de IVI com lapso de tempo do pâncreas murino. Alguma movimentação tecidual pode ser observada dentro do período inicial de sedimentação (primeira hora de exame, Figura 1A). No entanto, com a continuidade dos exames de imagem após esse período de sedimentação (>75 min), observamos um aumento da estabilidade lateral e axial (Figura 1B). A compar...

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Discussão

O protocolo SWIP descrito aqui fornece um método aprimorado de estabilização do tecido pancreático utilizando uma técnica de cesto de ponto cruzado. As janelas de imagem abdominais precoces (AIWs) permitiram imagens intravitais (IVI) de órgãos internos do abdome, mas não limitaram adequadamente o movimento de tecidos moles, como o pâncreas. Em resposta, Park e col. desenvolveram uma janela de imagem do pâncreas (PIW) que incorpora uma prateleira metálica horizontal e permite uma melhor estabilização do tecido pancreático...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

A Evelyn Lipper Charitable Foundation, o Gruss-Lipper Biophotonics Center, o Integrated Imaging Program for Cancer Research, uma bolsa NIH T-32 (CA200561) e um programa de pesquisa de câncer pancreático do Departamento de Defesa (PCARP) concedem PA210223P1.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de 1% (p/v) de detergente ativo enzimáticoAlconoxInc NADetergente aniônico concentrado com enzimas protease para limpeza manual e ultrassônica
Solução de 5% (p/v) de hidróxido de sódioReagente de passivaçãoSigma-AldrichS8045
5 mm de vidrode cobertura Microscopia Eletrônica Sciences72296-05Lamínulas de Vidro Redondas 
Solução a 7% (p/v) de ácido cítricoSigma-Aldrich 251275Reagente de passivação
28G 1 mL BD Seringa de insulinaBD329410Seringa para injeção celular
Baytril 100 (enrofloxacina)Bayer (Santa Cruz Biotechnology)sc-362890RxAntibiótico
Lâmpada de calor de montagem em bancadaMcMaster-Carr3349K51Lâmpada de calor
Buprenorfina 0,3 mg / mLCovetrus América do Norte059122Buprenorfina Tesoura Curva de Analgesia
CastroviejoWorld Precision InstrumentsWP2220Tesoura para cortar tecido
C57BL/6J MouseJackson Laboratory000664 Rato C57BL/6J
Solução de clorexidinaDurvet7-45801-10258-3Solução desinfetante de clorexidina
Recipiente de ar comprimidoFalconDPSJB-12Ar comprimido para secagem de tecido
Acrilato de ciano - Gel SuperglueStaples234790-6Cola para a pele
Acrilato de ciano - Grampos de supercola líquidaLOC1647358Cola de lamínula
DPBS 1xCorning21-031-CVDPBS para injeções de ceruleína/células
Kit de Cauterização GeminiCaneta de Cauterização 726067 Aparelho Harvard
Germinador 500CellPoint ScientificGER  5287-120VEsterilizador de Contas
Graefe Micro Dissecante Fórceps; Serrilhada; Ligeira curva; Largura da ponta de 0,8 mm; 4" ComprimentoRoboz SurgicalRS-5135 Pinça de Micro Dissecação Graefe
Microscópio de imagemNANAVer Entenberg et al. 2011 [27]
Software de imagemNANAVer Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurano)Henry Schein Animal Health50033Isoflurano Anestesia
Kim WipesFisher Scientific06-666-A Lenços umedecidos Kim
Fita de laboratórioFisher Scientific159015R
Kit de dissecação de mouseWorld Precision InstrumentsMOUSEKITInstrumentos cirúrgicos
Sensor de oxímetro de pulso de pata de ratoKent Scientific CorpoMSTAT Sensor-MSEOxímetro de pulso
Mouse SurgisuiteKent ScientificSURGI-M04Plataforma aquecida
Nair Depilação LoçãoAmazonB001RVMR7KLoção Depilatória
OxygenTechAirOX TMOxygen
PERMA-HAND Suturas de Seda Trançadas Pretas, ETHICON Tamanho 5-0VWR95056-872Sutura de Seda
Tamponada com Solução Salina 1xLife Technologies10010-023PBS
Sistema PhysioSuiteScientificPhysioSuitePlataforma Aquecida Controlador
PuralubeHenry Schein Animal Health008897Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton Tipped Swabs Cotonetes de AlgodãoFisher Scientific867WCNOGLUE
SHARP Precision Barrier Tips, Para P-100, 100 µ LDenville Scientific Inc.P1125100 µ L Pontas de Pipeta
Isotiocianato de Tetrametilrodamina– DextranSigma-AldrichT1287-500MGEtiqueta Vascular
Placa de fixaçãode janela NANAPlaca feita à medida para colocação de janela na platina do microscópio. A placa é feita de 0,008 em calço de aço inoxidável. Para as dimensões da placa, consulte Entenberg et al., 2018 [8].
Caixilharia NANAA janela é composta por uma estrutura de aço com uma abertura central que aceita uma lamínula de 5 mm. Uma ranhura de 1,75 mm ao redor da circunferência da armação fornece espaço para a aderência do músculo peritoneal e das camadas da pele. Ver Entenberg et al., 2018 [8].
de fita de laboratório Kent

Referências

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