Artigo de método

Métodos para Incorporação de Reações de Síntese Proteica Livre de Células em Hidrogéis em Macroescala

DOI:

10.3791/65500

⸱

23 de junho de 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos dois protocolos para incorporar reações de síntese proteica livre de células em matrizes de hidrogel em macroescala sem a necessidade de uma fase líquida externa.

Resumo

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As redes genéticas sintéticas fornecem uma plataforma para cientistas e engenheiros projetarem e construírem novos sistemas com funcionalidade codificada em nível genético. Enquanto o paradigma dominante para a implantação de redes gênicas está dentro de um chassi celular, redes gênicas sintéticas também podem ser implantadas em ambientes livres de células. Aplicações promissoras de redes gênicas livres de células incluem biossensores, já que esses dispositivos foram demonstrados contra alvos bióticos (vírus Ebola, Zika e SARS-CoV-2) e abióticos (metais pesados, sulfetos, pesticidas e outros contaminantes orgânicos). Sistemas livres de células são tipicamente implantados na forma líquida dentro de um vaso de reação. Ser capaz de incorporar tais reações em uma matriz física, no entanto, pode facilitar sua aplicação mais ampla em um conjunto mais amplo de ambientes. Para este fim, métodos para incorporar reações de síntese proteica livre de células (CFPS) em uma variedade de matrizes de hidrogel têm sido desenvolvidos. Uma das principais propriedades dos hidrogéis propícios a este trabalho é a alta capacidade de reconstituição de água dos materiais hidrogéis. Além disso, os hidrogéis possuem características físicas e químicas funcionalmente benéficas. Os hidrogéis podem ser liofilizados para armazenamento e reidratados para uso posterior. Dois protocolos passo-a-passo para a inclusão e ensaio de reações de CFPS em hidrogéis são apresentados. Primeiro, um sistema CFPS pode ser incorporado a um hidrogel via reidratação com um lisado celular. O sistema dentro do hidrogel pode então ser induzido ou expresso constitutivamente para a expressão completa de proteínas através do hidrogel. Em segundo lugar, o lisado celular pode ser introduzido em um hidrogel no ponto de polimerização, e todo o sistema pode ser liofilizado e reidratado em um ponto posterior com uma solução aquosa contendo o indutor para o sistema de expressão codificado dentro do hidrogel. Esses métodos têm o potencial de permitir redes gênicas livres de células que conferem capacidades sensoriais a materiais hidrogéis, com potencial para implantação além do laboratório.

Introdução

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A biologia sintética integra diversas disciplinas de engenharia para projetar e projetar peças, dispositivos e sistemas de base biológica que podem executar funções que não são encontradas na natureza. A maioria das abordagens da biologia sintética ainda está ligada a células vivas. Por outro lado, sistemas de biologia sintética livres de células facilitam níveis sem precedentes de controle e liberdade no projeto, permitindo maior flexibilidade e um tempo reduzido para a engenharia de sistemas biológicos, ao mesmo tempo em que eliminam muitas das restrições dos métodos tradicionais de expressão gênica baseados em células

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Protocolo

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1. Tampão de lisado celular e preparação do meio

  1. Preparo de 2x ágar YT+P e meio
    1. Preparar 2x ágar YT+P medindo 16 g/L de triptona, 10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 40 mL/L de 1 M K 2 HPO4, 22 mL/L de 1 M KH2PO4 e 15 g/L de ágar. Para o caldo 2x YT+P, siga a composição anterior, mas omita o ágar.
    2. Esterilizar autoclavando a 2x YT+P.
  2. Preparação do buffer S30A
    1. Preparar o tampão S30A com 5,88 g/L de Mg-glutamato, 12,195 g/L de K-glutamato e 25 mL/L de Tris 2 M, ajustado para pH 7,7 com ácido acético.
    2. Conservar o tampão S30A a 4 °C dur....

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Resultados

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Este protocolo detalha dois métodos para incorporar reações de CFPS em matrizes de hidrogel, com a Figura 1 apresentando uma visão geral esquemática das duas abordagens. Ambos os métodos são passíveis de liofilização e armazenamento a longo prazo. O método A é a metodologia mais utilizada por dois motivos. Primeiro, mostrou-se o método mais aplicável para trabalhar com uma variedade de materiais hidrogéis11. Em segundo lugar, o método A permite o teste paralelo de con.......

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Discussão

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Aqui são descritos dois protocolos para a incorporação de reações CFPS baseadas em lisado celular de E. coli em hidrogéis de agarose. Esses métodos permitem a expressão gênica simultânea em todo o material. O protocolo pode ser adaptado para outros sistemas CFPS e tem sido conduzido com sucesso com kits CFPS disponíveis comercialmente, além dos lisados celulares preparados em laboratório detalhados aqui. É importante ressaltar que o protocolo permite a expressão gênica na ausência de uma fase líquida externa. Is.......

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Agradecimentos

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Os autores agradecem imensamente o apoio dos prêmios BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) e BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) e EP/N026683/1 (A.L., T.P.H.) do Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas - Laboratórios de Ciência e Tecnologia de Defesa (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Os dados que suportam esta publicação estão disponíveis em: 10.25405/data.ncl.22232452. Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença Creative Commons Attribution (CC BY) a qualquer versão do Autor Aceito do Manuscrito que surgir.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Material
3-PGASanta Cruz Biotechnologysc-214793B
Ácido AcéticoÁgar Sigma-AldrichA6283
Thermo Fisher ScientificA10752.22
AgaroseSevern Biotech30-15-50
Kit de Amostrador de AminoácidosVWR
ATPSigma-AldrichA8937-1G
cAMPSigma-AldrichA9501-1G
Coenzima A (CoA)Sigma-AldrichC4282-100MG
CTPAlfa AesarJ14121.MC
DTTThermo Fisher ScientificR0862
Ácido FolínicoSigma-AldrichF7878-100MG
GTPCarbosynthNG01208
HEPESSigma-AldrichH4034-25G
K-glutamatoSigma-AldrichG1149-100G
LisozimaSigma-AldrichL6876-1G
Mg-glutamatoSigma-Aldrich49605-250G
NADSigma-AldrichN6522-250MG
PEG-8000PromegaV3011
Hidróxido de Potássio (KOH)Sigma-Aldrich757551-5G
Fosfato de Potássio Dibásico (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786-500G
Fosfato de Potássio Monobásico (KH2PO4)Sigma-AldrichRDD037-500G
Inibidor de Protease coquetelSigma-AldrichP2714-1BTL
Kit de concentração de proteína QubitThermo Fisher ScientificA50668
Rossetta 2 DE 3 E.coliSigma-Aldrich71397-3
Cloreto de sódio (NaCl)Sigma-AldrichS9888-500G
EspermidinaSigma-Aldrich85558-1G
TriptonaThermo Fisher Scientific211705
TrisSigma-AldrichGE17-1321-01
tRNASigma-Aldrich10109541001
UTPAlfa AesarJ23160.MC
Extrato de leveduraSigma-AldrichY1625-1KG
strong>Equipment
1.5 mL tubos de microcentrífugaSigma-Aldrichde diálise HS4323-500EA
10K MWCOThermo Fisher Scientific66381
Tubo de centrífuga de 15 mLSarstedt62.554.502
Frascos de centrífuga de 50 mLSarstedt62.547.254
Frascos de centrífuga de 500 mLThermo Fisher Scientific3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus liofilizadorCristopart no. 101521, 101522, 101527
Centrífuga de bancadaThermo Fisher ScientificH-X3R
Placas de microtitulação de 384 poços pretasFischer Scientific66
CuvettesThermo Fisher Scientific222S
Elga Purelab ChorusMicrocentrífuga Elga#####
Eppendorf 5425REppendorfEP00532
Centrífuga de alta velocidadeBeckman CoulterB34183
Licença JMPSAS Institute15
Agitador magnéticoFischer Scientific15353518
ParafilmAmcorPM-966
Espectrômetro (Biofotômetro)Eppendorf16713
Pipetas e ponteirasGilson#####
Precision BalanceSartorius16384738
Qubit 2.0 FluorômetroThermo Fisher ScientificQ32866
Incubadora de agitaçãoThermo Fisher ScientificSHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)Thermo Fisher Scientific12893543
Incubadora EstáticaSanyoMIR-162
Seringa e agulhasThermo Fisher Scientific66490
Thermo max Q8000 (Incubadora Agitada)Thermo Fisher ScientificSHKE8000
Varioskan Luxplatereader Thermo Fisher ScientificVLBL00GD1
Vortex Genie 2Cole-parmerOU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/° medidor cVWR662-1657
BTRABR1401801<

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbo....

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