Method Article

Geração de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos com Fenótipos Sialilados Diferentes

DOI:

10.3791/65525

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Associate Laboratory i4HB - Institute for Health and Bioeconomy, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 2UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 3LAQV and REQUIMTE, Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade NOVA de Lisboa, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Oncology, Albert Einstein College of Medicine, 6Stemmatters, Biotecnologia e Medicina Regenerativa SA, Parque de Ciência e Tecnologia Avepark, Zona Industrial da Gandra, 7CDG & Allies - Professionals and Patient Associations International Network (CDG & Allies - PPAIN), Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um protocolo único e abrangente para gerar células dendríticas derivadas de monócitos humanos dessialiladas (mo-DCs) a partir de células mononucleares isoladas do sangue periférico (PBMCs) usando um tratamento com sialidase é apresentado. Além disso, são descritos métodos para avaliar a caracterização fenotípica e funcional das mo-DCs e avaliar como o tratamento com sialidase melhora o nível de maturação das mo-DCs.

Abstract

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Os ácidos siálicos são monossacarídeos carregados negativamente tipicamente encontrados no terço dos glicanos da superfície celular. Devido à sua hidrofilicidade e características biofísicas, estão envolvidos em inúmeros processos biológicos, tais como modulação da resposta imune, reconhecimento de antígenos auto e não-auto, interações carboidrato-proteína, etc. O conteúdo celular do ácido siálico é regulado pela sialidase, que catalisa a remoção de resíduos de ácido siálico. Vários estudos têm mostrado que os sialo-glicanos são críticos no monitoramento da vigilância imunológica, envolvendo-se com receptores Siglec inibitórios cis e trans em células imunes. Da mesma forma, os checkpoints glico-imunes no câncer estão se tornando alvos cruciais para o desenvolvimento de imunoterapias. Além disso, as células dendríticas (DCs) são concebidas como um componente importante em imunoterapias, especialmente na pesquisa do câncer, devido ao seu papel único como células apresentadoras de antígenos profissionais (APC) e sua capacidade de desencadear respostas imunes adaptativas e gerar memória imunológica. No entanto, a função das CDs é dependente de sua plena maturação. As DCs imaturas têm uma função oposta às DCs maduras e um alto teor de ácido siálico, o que amortece ainda mais seu nível de maturação. Isso diminui a capacidade de DCs imaturos para ativar as células T, levando a uma resposta imune comprometida. Consequentemente, a remoção do ácido siálico da superfície celular das DCs humanas induz sua maturação, aumentando a expressão de moléculas de MHC e a apresentação de antígenos. Além disso, pode restaurar a expressão de moléculas co-estimulatórias e IL-12, resultando em DCs com maior capacidade de polarizar células T em direção a um fenótipo Th1 e ativar especificamente células T citotóxicas para matar células tumorais. Portanto, o ácido siálico emergiu como um modulador chave das DCs e está sendo usado como um novo alvo para avançar seu uso terapêutico. Este estudo fornece uma abordagem única para tratar DCs derivadas de monócitos in vitro com sialidase, visando gerar populações de DC com diferentes fenótipos de ácido siálico de superfície celular e perfis de maturação e co-estimulatórios adaptados.

Introduction

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Os glicanos portadores de ácido siálico (sialoglicanos) têm ganhado interesse significativo devido ao seu papel imunomodulador. O ácido monossacarídeo siálico, mais prevalente em humanos na forma de ácido N-acetilneuramínico, apresenta ligantes fundamentais para lectinas com reconhecido papel na imunologia, como Selectinas e Siglecs. Essas lectinas reconhecem sialoglicanos na mesma célula (cis) ou em células diferentes (trans) e desempenham um papel significativo nas interações patógeno-hospedeiro e em várias atividades celulares fisiológicas e patológicas 1,2,3. Além disso, como o ácido siálico ocupa as posições terminais dos glicoconjugados da superfície celular, ele pode ocultar as estruturas subjacentes, inibindo o contato célula a célula por efeitos repulsivos inespecíficos ou obstruindo a detecção por outras lectinas4. A atividade de uma variedade de sialiltransferases (que transferem ácidos siálicos) e de sialidases (que clivam ligações de ácido siálico) dentro da célula determina a quantidade de ácido siálico presente na superfície. Além disso, sialiltransferases solúveis e sialidases expressas pelo hospedeiro ou patógenos podem modificar extrinsecamente a quantidade de ácido siálico na superfície celular 5,6.

A sialilação aberrante é uma característica de várias condições patológicas. Nas doenças autoimunes, a hipossialação pode contribuir para a ativação imune desenfreada e danos aos órgãos, uma vez que o ácido siálico ajuda a discriminar autoantígenos e regular as respostas inflamatórias7. Por outro lado, a hipersialilação resulta na superexpressão de sialoglicanos, como sialil-Tn, antígenos de sialil-Lewis, ácido polisiálico e gangliosídeos, o que constitui uma característica marcante de alguns cânceres 8,9. A hipersialilação também depende do aumento da expressão de enzimas específicas, como a N-acetilglucosaminiltransferase (GNT-V), que gera glicanos hipersialados, tri e/ou tetraantenas, ligados a N, que têm sido associados ao crescimento de câncer e metástases10. O teor de ácido siálico também regula a estabilidade e a função das proteínas, que são fundamentais para o papel de agentes oncogênicos relevantes11. Portanto, o aumento da sialilação pode facilitar o desenvolvimento do tumor, metástase, resistência a drogas e evasão imunológica. Além disso, a upregulation de sialoglicanos permite que os tumores interajam com receptores Siglec inibitórios em células imunes e evitem a vigilância imunológica. Por essa razão, os sialoglicanos são agora considerados pontos de verificação glico-imunes e alvos terapêuticos atraentes. Por exemplo, inibidores do eixo imune de Siglec já estão em ensaios clínicos iniciais, uma vez que o receptor de células imunes Siglec (ImmunoGlobulin-like LECtin, de ligação ao ácido siálico) desempenha um papel imunoinibitório12.

Enzimas têm sido utilizadas para modular o perfil glicano como ferramentas de estudo ou estratégias terapêuticas13,14. A sialidase tem sido empregada para alterar a malignidade de células cancerosas, uma vez que glicanos sialilados, como o sialyl Lewis X, são críticos para migração celular e metástase de câncer15. Ao mesmo tempo, os inibidores da sialidase, que impedem a clivagem do ácido siálico, têm chegado às clínicas para o tratamento de infecções virais dependentes de ácido siálico16. Recentemente, a modulação do ácido siálico ganhou maior interesse devido ao papel crítico dos ácidos siálicos como ligantes no eixo imune de Siglec, o que significa que eles oferecem novos meios para reduzir o escape do câncer das respostas imunes. Esse interesse foi ainda mais fortalecido pela contribuição da ganhadora do Nobel de 2022 Bertozzi e sua equipe de várias estratégias que clivam seletivamente diversos sialoglicanos e melhoram as respostas imunes anticâncer17. Assim, estratégias baseadas em sialidase representam uma modalidade promissora para a terapia de checkpoint glico-imune. O glicofenótipo das células do sistema imune é dependente do tipo de célula e de seu estado de ativação. Em relação às células T, os glicanos têm papel fundamental nas etapas fisiopatológicas do desenvolvimento das células T e seleção dos timócitos, atividade, diferenciação e proliferação das célulasT18. Por exemplo, a polilactosamina sobre glicoproteínas influencia os níveis basais de linfócitos B e linfócitos T e a ativação de macrófagos19. Em macrófagos, padrões distintos de expressão de glicanos têm um papel importante no recrutamento de macrófagos para o microambiente tumoral (TME)20. Assim, a expressão de glicanos ligados ao O e N-ligados por células imunes poderia ser usada como glicobiomarcadores potenciais para abordagens terapêuticas no tratamento de câncer e doenças autoimunes.

As células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígenos específicos com capacidade única de desencadear respostas imunes, como a imunidade anticâncer21. As DCs devem sofrer uma upregulation de suas moléculas MHC apresentadoras de antígenos para apresentar antígenos às células T (sinal 1), moléculas coestimulatórias para ativar as células T (sinal 2) e citocinas pró-inflamatórias, como IL-12, para desencadear a proliferação de células T auxiliares tipo 1 (sinal 3)22. O perfil imunológico resultante é fortemente regulado, e os pontos de verificação são essenciais para evitar que células saudáveis sejam atacadas. Como as DCs podem estimular várias respostas imunes contra células tumorais, elas são usadas como vacinas baseadas em células, e um número considerável de estudos clínicos tem demonstrado seus potenciais benefícios23,24. Depois que o FDA aprovou a primeira vacina baseada em DC em 201025,26, muitas outras vacinas baseadas em DC foram desenvolvidas. As vacinas baseadas em DC são produzidas principalmente ex vivo e administradas aos pacientes para provocar respostas imunes contra tumores. No entanto, a maturação insuficiente ou breve é atualmente um dos fatores que limitam a eficácia clínica das DCs e significa que coquetéis de citocinas caros devem ser usados. Sem maturação adequada, as DCs não conseguem ativar as células T em circunstâncias clínicas. Em vez disso, as DCs expressam pontos de verificação imunes e desencadeiam uma resposta imune tolerogênica que impede que as células T citotóxicas atuem contra as células tumorais.

As DCs humanas têm superfícies fortemente sialiladas, e essa sialilação diminui com a maturação e durante uma resposta imune global27. A maturação das DCs pode ser induzida pela eliminação desses ácidos siálicos com sialidase. A dessialiação aumenta grandemente várias citocinas, incluindo a IL-12, devido à translocação do fator de transcrição NF-kB para o núcleo 6,28. Além disso, a dessialação melhora a apresentação cruzada de antígenos por meio de MHC-I e respostas imunes antitumorais29,30. Nesse sentido, o knockout das sialiltransferases ST3Gal.l e ST6Gal.l, que têm papel importante na sialilação das DC, gera um fenótipo mais maduro nas DCs murinas31.

O tratamento com sialidase fornece um método para estimular todos os aspectos da maturação da DC, incluindo o aumento da apresentação de antígenos, o aumento da expressão de moléculas co-estimulatórias e o aumento da produção de citocinas, para resolver as deficiências mencionadas acima e permitir que as DCs provoquem respostas eficazes. Este artigo apresenta um procedimento para obtenção de CDs humanas dessialilados viáveis através do uso de uma sialidase bacteriana. As DCs dessialiladas mostram um perfil de maturação melhorado e podem ser usadas como modelos celulares para aumentar as respostas imunes antitumorais in vitro. As DCs são obtidas a partir de monócitos sanguíneos, que são então diferenciados in vitro na presença da citocina interleucina-4 (IL-4) e do fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos (GM-CSF). Este trabalho também descreve métodos baseados em lectinas para analisar o ácido siálico na superfície celular e métodos para imunofenótipo do nível de maturação da DC. O procedimento aqui descrito pode ser usado para desializar outros tipos celulares, fornecendo assim uma abordagem para investigar o papel dos sialoglicanos, que são pontos de verificação glico-imunes vitais e relevantes na imunomodulação.

Protocol

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As células foram isoladas dos jalecos de doadores de sangue anônimos saudáveis, voluntários cedidos pelo Banco Nacional de Sangue e da Transplantação (IPST), após obtenção do consentimento escrito e informado do doador (IMP.74.52.4). A utilização do sangue foi aprovada pelo comité de ética (IPST 30072015), de acordo com a Diretiva 2004/23/CE relativa às normas de qualidade e segurança para a dádiva, recolha, análise, processamento, preservação, armazenamento e distribuição de tecidos e células de origem humana (Lei 22/2007, de 29 de junho). O biobanco do IPST coleta e armazena o sangue em uma bolsa coletora plástica específica contendo citrato fosfato dextrose (CPD), uma solução preservadora e anticoagulante, para manter a integridade do sangue até o processamento. Para avaliar se o material biológico é adequado para manipulação, é realizado um controle sorológico para Treponema pallidum, vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV) e vírus da imunodeficiência humana (HIV), todos negativos. Para o presente estudo, o buffy coat foi fornecido pelo IPST para fins de investigação, juntamente com informações sobre a data da coleta, resultados sorológicos, tipo sanguíneo e idade do doador32. A pelagem bufante pode permanecer em temperatura ambiente por no máximo 1 dia.

1. Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos

OBS: É importante mencionar que, quando o sangue periférico humano está sendo manipulado, deve-se considerar precauções universais específicas de segurança e descarte adequado do material. Antes de começar, confirme se todos os reagentes e materiais necessários estão preparados e prontos para uso.

  1. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico
    1. Acesse o casaco buffy humano.
      NOTA: Buffy coat é um subproduto derivado do sangue coletado via leucaferese32, que é enriquecido em glóbulos brancos através de centrifugação. Todas as etapas foram realizadas em uma câmara de fluxo vertical de biossegurança (BSC).
    2. Abra a embalagem do buffy coat cortando o tubo de saída selado com um bisturi e transfira o conteúdo para um tubo de 50 mL. Transferir 7 mL de amostra de buffy coat por tubo cônico estéril de 15 mL e adicionar 6 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para realizar uma lavagem preliminar. Esta etapa inicial de lavagem é necessária para limpar a amostra da quantidade considerável de hemácias (RBC) e plasma para que a amostra seja otimizada para a separação do gradiente com um meio de gradiente de densidade (veja a Tabela de Materiais).
    3. Centrifugar o tubo à temperatura ambiente durante 10 min a 1.100 x g numa centrífuga com rotor oscilante e com o travão desligado (ver Tabela de Materiais).
    4. Após a centrifugação, coletar a suspensão de leucócitos (o anel branco entre o plasma e as hemácias) com uma pipeta de Pasteur e transferi-la para um novo tubo cônico estéril de 15 mL.
    5. Encha a suspensão de leucócitos até 10 mL com PBS para ajudar na próxima etapa de separação e misture pipetando suavemente para cima e para baixo.
    6. Preparar a solução do meio de gradiente de densidade (densidade: 1,077 g/mL): Coloque 3 mL de meio de gradiente de densidade em um novo tubo cônico estéril de 15 mL e deixe aquecer até a temperatura ambiente.
    7. Adicionar 5 ml da suspensão de leucócitos diluída (a partir do passo 1.1.5) no tubo cónico que contém o meio de gradiente de densidade (5:3) para efectuar a separação do gradiente de densidade. Adicione a amostra lentamente, gota a gota, usando as paredes do tubo para não perturbar o meio de gradiente de densidade.
    8. Separação do gradiente: Centrifugar a suspensão do meio de gradiente de densidade à temperatura ambiente por 30 min a 1.100 x g em uma centrífuga com rotor oscilante e com o freio desligado.
    9. Após a centrifugação, remova cuidadosamente os tubos cônicos da centrífuga. Após essa etapa, uma gama de camadas bem definidas são visíveis, incluindo as seguintes, começando pelo fundo: uma camada vermelha (hemácias e granulócitos), meio de gradiente de densidade, uma fina camada pálida de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e plasma.
    10. Colete a fina camada de PBMCs usando uma pipeta de Pasteur e evite ocupar o meio de gradiente de densidade abaixo ou muito plasma acima. Coloque a amostra de PBMC em um novo tubo cônico de 50 mL, preencha-o até 25 mL com PBS e misture a amostra pipetando suavemente para cima e para baixo.
    11. Centrifugar as amostras à temperatura ambiente durante 10 min a 600 x g (travão normal) para lavar as células residuais e os detritos e eliminar o sobrenadante invertendo cuidadosamente o tubo.
      NOTA: Se houver muita contaminação de glóbulos vermelhos, que é observável quando a pelota de células ou a pelagem de buffy não está totalmente separada ou parece avermelhada, recomenda-se lisar as hemácias restantes. Neste caso, adicione 5 mL de tampão de lise eritrocitária (consulte a Tabela de Materiais), misture bem e incube por 5 min. Encher até 40 mL com PBS, centrifugar as amostras à temperatura ambiente por 10 min a 900 x g (freio normal) e descartar o sobrenadante invertendo cuidadosamente o tubo.
    12. Encha a amostra até 10 mL com PBS e pegue uma alíquota para contar as células. Para remover as plaquetas, centrifugar à temperatura ambiente durante 5 min a 400 x g (travão normal) e eliminar o sobrenadante invertendo cuidadosamente o tubo.
      NOTA: No caso de haver um número substancial de plaquetas, centrifugar à temperatura ambiente por 10 min a 200 x g (freio normal) duas vezes. As plaquetas são identificadas visualizando-se a amostra durante a contagem das células.
  2. Isolamento de monócitos por separação imunomagnética
    1. Preparar o tampão de microesferas suplementando PBS com albumina de soro bovino (BSA) a 0,5% e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 2 mM. Esterilizar a solução por filtração (0,2 μm) e manter o tampão refrigerado (2-8 °C).
    2. Realizar o isolamento de monócitos CD14+ por classificação de células ativadas por magnetismo (MACS).
      1. Após a contagem de células utilizando um contador de células automatizado (passo 1.4.1), calcule o volume adequado de tampão de microesferas e esferas imunomagnéticas CD14 (ver Tabela de Materiais) necessário. Certifique-se de que essas soluções sejam mantidas no gelo. Adicionar 80 μL de tampão de microesferas por 1 x 10 7 células e 20 μL de contas CD14 por 1 x 107 células.
      2. Ressuspender o pellet celular nos volumes previamente determinados e incubar por 15 min a 4 °C (2-8 °C).
        NOTA: Caso seja necessária a verificação dos níveis de monócitos nas amostras de CMSP, realize uma análise por citometria de fluxo usando anticorpos corantes (por exemplo, CD14 [TÜK4 monoclonal]). Siga a etapa 3.2 para obter detalhes sobre a análise por citometria de fluxo.
      3. Adicionar 1-2 mL de tampão de microesferas por 1 x 107 células, centrifugar à temperatura ambiente por 10 min a 600 x g (freio normal) para remover contas não encadernadas e descartar o sobrenadante invertendo cuidadosamente o tubo.
      4. Prepare a coluna LS. As colunas LS contêm esferas ferromagnéticas que, quando colocadas sobre um ímã, permitem a retenção positiva e suave de células marcadas magneticamente33. Imediatamente antes de usar, coloque uma coluna LS (consulte a Tabela de Materiais) sobre o ímã, enxágue com 3 mL de tampão de microesferas sem secar completamente e prossiga imediatamente para a próxima etapa.
        OBS: Nunca deixe a coluna secar durante o procedimento para não comprometer o rendimento.
      5. Ressuspender o pellet celular em 500 μL de tampão de microesferas por 1 x 108 células. Se o número de células for superior a 4 x 108, utilize um filtro de células de 40 μm para evitar a agregação celular.
      6. Adicionar a suspensão celular à entrada da coluna, colocar um tubo cônico de 15 mL abaixo da saída da coluna para coletar a fração celular negativa e lavar a coluna três vezes com 3 mL de tampão de micropartículas. A fração negativa compreende as células que não foram coletadas com as esferas CD14 (ou seja, as células CD14− ).
      7. Após a lavagem final, remova a coluna do ímã, coloque-a em um tubo cônico estéril de 15 mL, pipete 5 mL de tampão de microesferas na entrada da coluna e insira imediatamente o êmbolo da seringa na entrada da coluna e empurre para dispensar as células-alvo.
      8. Recolher as células marcadas magneticamente (células CD14+ ) e tomar uma alíquota para contar as células, conforme descrito no passo 1.4.1.
      9. Centrifugar ambas as frações celulares, células CD14− e CD14+ , à temperatura ambiente por 10 min a 600 x g (freio normal). Descarte o sobrenadante, retenha a fração CD14+ para as próximas etapas e armazene a fração CD14− para ensaios futuros, como ensaios de cocultura, se necessário. Se necessário, as células da fração CD14− podem ser criopreservadas em RPMI-1640 20% FBS e 10% DMSO a −80 °C.
  3. Diferenciação de monócitos em células dendríticas
    1. Preparar o meio RPMI-1640 completo suplementando o meio base RPMI-1640 (contendo 11,1 mM de glicose) com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de 2 mM de L-glutamina, 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA), 1% de piruvato de sódio e 1% de 100 μg/mL de penicilina/estreptomicina (consulte a Tabela de Materiais).
    2. Realizar a diferenciação de monócitos em mo-DCs, que ocorre ao longo de ~5-6 dias.
      1. Calcular o volume de meio necessário para o número de células CD14+ obtidas e plaquear as células de acordo com a seguinte configuração do experimento.
        NOTA: Neste protocolo, as células foram plaqueadas a uma concentração de 1,3 x 106 células/mL para levar em consideração a morte celular e erros de medição, e o meio foi preparado adicionando 1.000 U/mL de GM-CSF e 750 U/mL de IL-4 (ver Tabela de Materiais) em um meio completo e misturando-o completamente.
      2. Adicione o volume apropriado de meio às células CD14+ e ressuspenda pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de Pasteur. Colocar a suspensão celular em placas de 24 poços (por poço: 1,3 x 106 células/mL) e incubar em estufa de cultura a 37 °C com 5% de CO2.
      3. Trocar o meio de cultura e suplementá-lo com citocinas frescas a cada 2-3 dias (geralmente uma vez por processo de diferenciação). Para fazer isso, remova cuidadosamente metade do meio de cultura sem perturbar as células. Adicionar a mesma quantidade de meio fresco com a concentração adequada de citocinas, conforme descrito anteriormente na nota do passo 1.3.2.1, e incubar durante o período de diferenciação restante.
        NOTA: As DCs, ao se diferenciarem dos monócitos, são células frouxamente aderentes. Mo-DCs imaturos totalmente diferenciados são células fusiformes, flutuantes e fracamente aderentes. As células também podem formar rosetas, especialmente quando maduras34.
      4. Para coletar as células após a diferenciação, utilizar uma micropipeta para transferir toda a suspensão celular para um tubo cônico estéril e lavar os orifícios da placa duas vezes com PBS, batendo suavemente no fundo (Figura 1A).
        NOTA: Evite coletar as células fortemente aderentes, pois estas provavelmente são macrófagos. Para evitar a maturação ou ativação celular inadequada, certifique-se de que as células sejam manuseadas com extremo cuidado.
      5. Centrifugar as células à temperatura ambiente durante 10 minutos a 180 x g (travão normal) para remover quaisquer resíduos ou células mortas e ressuspender no meio/tampão adequado para a instalação experimental.
    3. Realizar a maturação de mo-DCs.
      1. Caso seja necessária a maturação das mo-DCs, utilizar uma placa de poço ou frasco, levando em consideração o exemplo de concentração celular utilizado anteriormente (1,3 x 10 6 células/mL), e administrar um coquetel de citocinas suplementando o meio com um coquetel de citocinas composto por IL-1β (10 ng/mL),IL-6 (1.000 U/mL), prostaglandina E2 (PGE2; 1 μg/mL), e fator de necrose tumoral α (TNF-α; 10 ng/mL) (ver Tabela de Materiais). Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 durante 24 h ou 48 h.
  4. Contagem e viabilidade celular
    1. Realizar contagem celular e coloração azul de tripano.
      1. Para determinar o número de células e a viabilidade de uma suspensão celular, pegue uma alíquota de 10 μL da suspensão celular e misture-a com 10 μL de azul de tripano (diluição 1:1).
      2. Tome 10 μL da mistura anterior e use o contador de células automatizado para contar o número de células de acordo com as instruções do fabricante.
        NOTA: Se a concentração de células for muito alta, dilua a alíquota e, após a contagem de células, considere o fator de diluição nos cálculos.
      3. Ajustar o número de células e meio/tampão para o arranjo experimental.
    2. Determinar a viabilidade celular e a apoptose30.
      NOTA: Neste trabalho, após o tratamento com sialidase (seção 2), o ensaio de viabilidade foi realizado.
      1. Colorir as mo-DCs com 5 μg/mL de 7-aminoactinomicina D (7-AAD) e anexina V e determinar a apoptose de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
      2. Analisar os resultados por citometria de fluxo 29,30.

2. Tratamento das células com sialidase

NOTA: Após a diferenciação em mo-DCs, no sexto dia, as células estão prontas para o ensaio de tratamento com sialidase.

  1. Considerando a configuração experimental desejada, coletar ~10 x 10 6 mo-DCs de 10 poços das placas de 24 poços com 1,3 x 106 células/poço, e transferi-las para um novo tubo cônico estéril de 15 mL.
    NOTA: Suponha alguma perda celular; tipicamente, nesta fase, a concentração encontrada é de 1,3 x 106 células/mL, pois as mo-DCs e seus precursores não proliferam e experimentam 20% de perda de viabilidade durante a diferenciação em mo-DCs.
  2. Centrifugar à temperatura ambiente durante 5-7 minutos a 300 x g (travão normal) e eliminar o sobrenadante para remover células mortas e detritos.
  3. Adicionar 10 mL de meio RPMI-1640 (contendo 11,1 mM de glicose), centrifugar à temperatura ambiente por 4 min a 300 x g (freio normal), descartar o sobrenadante, adicionar 2 mL de RPMI-1640 e homogeneizar.
  4. Colocar 1 mL de células em RPMI-1640 em novos microtubos estéreis, #1 e #2; Cada microtubo conterá aproximadamente 5 x 106 células.
  5. Ao microtubo #1, adicione 500 mU de sialidase de Clostridium perfringens (consulte a Tabela de Materiais). Ao microtubo #2, adicionar sialidase simulada, que é um controle negativo, para confirmar se os efeitos observados estão diretamente relacionados à remoção do ácido siálico e não são devidos a artefatos. A sialidase tratada simuladamente é a sialidase inativada pelo calor, que é obtida pela fervura da enzima por 20 min a 100 °C.
  6. Incubar durante 60 min a 37 °C.
  7. Após a incubação, colocar as células em novos tubos cônicos estéreis de 15 mL com a mesma numeração, #1 e #2. Adicionar cerca de 4 mL de meio RPMI-1640 completo (contendo 10% de FBS) a ambos os tubos para interromper a reação enzimática.
  8. Centrifugar à temperatura ambiente durante 4 min a 300 x g (travão normal) e eliminar o sobrenadante.
  9. Adicionar 5 mL de meio RPMI-1640 completo a cada tubo e placa 1 mL de células por poço.

3. Determinação do perfil de ácido siálico

  1. Coloração de lectina
    1. Recolher e lavar as células à temperatura ambiente durante 5 min a 300 x g (travão normal).
    2. Ressuspender as células em RPMI-1640 + 10% FBS e distribuir as células (100.000/100 μL) nos microtubos.
    3. Realizar coloração para citometria de fluxo em RPMI-1640 com FBS a 10% usando uma concentração de 0,01 mg/mL para cada lectina: lectina de Sambucus nigra (SNA), lectina de aglutinina de amendoim (PNA) e lectina Maackia amurensis (MAA) (ver Tabela de Materiais). Incubar durante 30 min a 4 °C.
    4. Lavar as células com 1 mL de PBS contendo FBS a 10% ou BSA a 10% e centrifugar à temperatura ambiente por 4 min a 300 x g (freio normal).
    5. Às células coradas com as lectinas biotiniladas, adicionar 0,0005 mg/mL de estreptavidina-PE (ver Tabela de Materiais) e incubar por 15 min à temperatura ambiente no escuro. Lavar as células com 1 ml de PBS e centrifugar à temperatura ambiente durante 4 minutos a 300 x g (travão normal).
    6. Eliminar o sobrenadante e, a cada tubo, adicionar 300 μL de paraformaldeído a 2% (PFA 2%). Proteger os tubos da luz e, se necessário, conservar a 4 °C até à aquisição dos dados.
    7. Adquirir os dados utilizando citômetro de fluxo em até 1 semana após o preparo da amostra29,30.
  2. Citometria de fluxo
    1. Ressuspender as células em 1 mL de PBS e adquirir a amostra com citômetro de fluxo para aquisição imediata dos dados.
    2. Para aquisição tardia de dados, ressuspenda em 300 μL de PFA a 2% e adquira os dados dentro de 1 semana.
  3. Microscopia confocal de varredura a laser
    1. Plaquear as células em lamínulas de vidro revestidas de polilisina de 12 mm de diâmetro e incubar por 5 min à temperatura ambiente.
    2. Centrifugar as lamínulas da tampa à temperatura ambiente durante 1 min a 100 x g (travão normal) para promover a adesão celular.
    3. Fixar à temperatura ambiente durante 30 minutos com PFA a 4% antes de lavar com BSA a 1% em PBS.
    4. Use lectina SNA conjugada com FITC (0,01 mg/mL) para corar ácidos siálicos ligados a α2,6 nas superfícies celulares (ver Tabela de Materiais).
    5. Adquirir imagens em microscópio confocal (ver Tabela de Materiais).
    6. Após o processamento da pilha Z, selecione imagens representativas de seção transversal confocal.
    7. Quantificar analiticamente a intensidade de coloração utilizando a fluorescência celular total corrigida (CTCF).
      NOTA: CTCF = Densidade integrada − (Área da célula selecionada × Fluorescência média das leituras de fundo)29.

4. Perfil de maturação de mo-DCs

  1. Coloração de anticorpos e citometria de fluxo
    1. Coletar uma nova amostra das células de interesse para realizar a coloração de anticorpos. Lave as células à temperatura ambiente durante 5 minutos a 300 x g (travão normal) e distribua as células nos microtubos (100.000 células por tubo).
    2. Realizar coloração para citometria de fluxo usando os anticorpos desejados (ab), MHI-I, MHC-II, CD80 e CD86 (consulte a Tabela de Materiais).
    3. Incubar o ab conjugado com fluorescência durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
    4. Lave as células com 1 mL de PBS e centrifugue em temperatura ambiente por 5 min a 300 x g (freio normal).
      NOTA: Se estiver usando ab não rotulado, adicione ab secundário fluorescentemente conjugado e incube no escuro por 15 minutos de acordo com as instruções do fabricante. Lavar as células com 1 ml de PBS e centrifugar à temperatura ambiente durante 5 minutos a 300 x g (travão normal).
    5. A todos os microtubos somar até 100 μL de PBS, ressuspender as células em 300 μL de paraformaldeído a 2% (PFA 2%) e manter os tubos no escuro a 4 °C até a aquisição dos dados.
    6. Adquira os dados usando um citômetro de fluxo.
      OBS: Após coloração e fixação, as amostras podem ser adquiridas por citometria de fluxo imediatamente ou dentro de um período de 1 semana. Neste caso, guarde os tubos a 4 °C no escuro.

5. Ensaio imunoenzimático (ELISA)

NOTA: Neste trabalho, a produção de IFN-γ foi medida usando o ensaio ELISA seguindo as instruções do fabricante (veja a Tabela de Materiais).

  1. Para revestir a placa em um tampão de revestimento, diluir o anticorpo de captura (1:100, anticorpo de captura em PBS), transferir 100 μL desta solução de trabalho para cada poço e incubar durante a noite à temperatura ambiente.
  2. Descarte completamente o anticorpo de captura.
  3. Adicione o tampão de bloqueio (por exemplo, PBS + 2% BSA + 0,05% Tween20) e incube por 1 h à temperatura ambiente antes de remover o buffer de bloqueio.
  4. Adicionar o padrão e a amostra, com a respectiva mistura e diluições, e incubar durante 2 h à temperatura ambiente. Lave cinco vezes com tampão de lavagem.
  5. Adicionar o anticorpo do detector biotinilado e incubar por 2 h à temperatura ambiente, seguido de cinco lavagens.
  6. Adicionar poli-HRP-estreptavidina-HS e incubar por 30 min à temperatura ambiente, seguido de cinco lavagens com tampão de lavagem.
  7. Adicionar substrato TMB (ver Tabela de Materiais) e incubar por até 60 min à temperatura ambiente, levando em consideração o sistema de teste utilizado. Lave cinco vezes com tampão de lavagem.
  8. Leia as amostras em um leitor de microplacas a 450 nm.

Results

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Isolamento de monócitos e diferenciação de monócitos em mo-DCs
De acordo com o protocolo, as CMSP humanas foram isoladas do buffy coat usando separação por gradiente de densidade com meio gradiente de densidade e cuidadosamente lavadas. O azul de tripano foi utilizado para realizar a contagem de células viáveis no dia do isolamento, conforme descrito anteriormente na etapa 1.4.1. Posteriormente, foi realizado o isolamento de monócitos CD14+ por seleção positiva. Para isso, as CMSP foram incubadas com esferas magnéticas contendo um anticorpo que reconhece o antígeno CD14. Os monócitos CD14+ selecionados foram cultivados em meio suplementado com GM-CSF e IL-4 por 5-6 dias27 para se diferenciarem em mo-DCs imaturas (Figura 1A). A maturação das mo-DCs pode ser obtida pela aplicação de um coquetel de citocinas, incluindo IL-6, IL-1β, TNF-α e PGE235 (Figura 1A).

Durante o processo de diferenciação, como resultado da estimulação com IL-4 e GMCSF, espera-se que o fenótipo celular mude. Os dados mostram que as mo-DCs perdem a expressão do marcador de superfície CD14, expresso principalmente pelos monócitos (Figura 1B), e ganham expressão significativa de CD1a, marcador expresso pelas DCs humanas36,37. As mo-DCs também obtêm maior expressão de MHC-II (HLA-DR), uma molécula apresentadora de antígeno expressa por DCs humanas e outras células apresentadoras de antígeno38 (Figura 1B).

Conteúdo de ácido siálico na superfície celular
O tratamento das mo-DCs com sialidase reduz o conteúdo de ácido siálico na superfície das mo-DCs, o que pode ser confirmado pela coloração com lectinas, proteínas capazes de se ligar aos carboidratos39. Como a enzima utilizada remove os ácidos siálicos α2,3 e α2,6 da superfície celular, as mo-DCs foram coradas com PNA, que reconhece o antígeno T-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr, bem como lectinas MAA e SNA, que se ligam a α2,3- e α2,6-siálico, respectivamente. A eficácia do tratamento com sialidase foi avaliada por citometria de fluxo e por microscopia confocal (Figura 2). Como mostrado na Figura 2A, o tratamento com sialidase diminuiu significativamente a ligação de MAA e SNA, enquanto aumentou a coloração de PNA. A diminuição na coloração SNA após o tratamento com sialidase foi confirmada pela análise de microscopia confocal mostrando uma redução significativa da coloração SNA na superfície celular (Figura 2B).

Caracterização funcional de mo-DCs tratadas com sialidase
Para avaliar como o tratamento com sialidase afeta as funções da mo-DC, o nível de maturação das mo-DCs foi avaliado após o tratamento com sialidase. Como mostrado na Figura 3A, o tratamento com sialidase leva a um aumento significativo na expressão das moléculas apresentadoras de antígenos MHC I e MHC II e na expressão das moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86. Para avaliar o efeito da remoção de ácido siálico sobre a capacidade das mo-DCs de induzir respostas de células T, foram utilizadas mo-DCs tratadas com sialidase carregadas com lisados de células tumorais para formar células T autólogas (Figura 3). Em seguida, o perfil das células T resultantes foi caracterizado com base em sua capacidade de secretar a citocina Th1 IFN-γ. Como mostrado na Figura 3B, quando comparadas com células T preparadas por mo-DCs totalmente sialiladas, as células T preparadas por mo-DCs tratadas com sialidase secretaram níveis significativamente mais altos de IFN-γ. Esses resultados sugerem que as mo-DCs tratadas com sialidase melhoraram a capacidade de formar células T autólogas.

Viabilidade celular
Após o tratamento com sialidase, um ensaio de viabilidade foi realizado para garantir que o tratamento não fosse citotóxico para as células. Após o tratamento, as mo-DCs foram coradas com 7-AAD e Anexina V, para detecção de células inviáveis e apoptóticas, e analisadas por citometria de fluxo (Figura 4). Os dados mostram que não houve diferença significativa na viabilidade celular entre as células não tratadas (Figura 4, painel esquerdo) e as tratadas com sialidase (Figura 4, painel direito).

figure-results-1
Figura 1: Diferenciação dos monócitos isolados em mo-DCs. (A) Os monócitos CD14+ foram isolados de buffy coats e cultivados na concentração de 1,3 x10 6 células/mL a 37 °C. Os monócitos foram diferenciados em meio suplementado com 750 U/mL de IL-4 e 1.000 U/mL de GM-CSF. Análise microscópica da morfologia dos monócitos isolados do pelupimento humano no dia 0 (imagem superior). Mo-DCs imaturos; as células foram diferenciadas durante um período de 5 dias usando IL-4 e GM-CSF (imagem do meio). Mo-DCs maturadas foram obtidas usando as citocinas IL-6, IL-1β, TNF-α e PGE2 por 24 h (imagem de fundo). Barras de escala: 100 μm. (B) As células foram analisadas nos dias 0, 2 e 5 durante todo o período de diferenciação por citometria de fluxo. Os seguintes anticorpos foram utilizados para caracterizar marcadores de superfície celular: (a-c) CD14; d-f) CD1a e (g-i) HLA-DR (MHC classe II). A figura mostra histogramas representativos de pelo menos três ensaios independentes. O painel (B) foi modificado de Videira et al.40, patente WO2017002045A1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Tratamento com sialidase de mo-DCs humanas para remover ácidos siálicos ligados a α2,6 e α2,3 da superfície celular. (A) Análise de mo-DCs por citometria de fluxo usando coloração de lectina para testar a eficácia do tratamento com sialidase. Mo-DCs humanas foram tratadas com sialidase (barras cinzentas) ou deixadas sem tratamento (barras brancas) e coradas com lectina SNA (reconhecendo ácidos [2,6]-siálico), lectina MAA (reconhecendo ácidos [2,3]-siálicos) e lectina PNA (reconhecendo antígeno T-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr). Os valores representam a intensidade média de fluorescência (MFI) de pelo menos três ensaios independentes. A significância estatística foi determinada usando um teste t pareado bicaudal (*P < 0,05 ou ***P < 0,0001), referente à diferença entre as CDs não tratadas e as tratadas com sialidase. O tratamento com sialidase diminuiu a ligação ao MAA e aumentou a coloração de PNA em mo-DCs humanas, resultante da remoção de ácidos siálicos ligados ao α(2,3); a remoção dos ácidos siálicos ligados ao α(2,6) após o tratamento com sialidase foi detectada por uma diminuição na coloração SNA. (B) Microscopia confocal de mo-DCs tratadas com sialidase e preparadas em lamínulas para observação. Uma variedade de imagens z-stack foi coletada de diferentes células e processada para incluir a intensidade média de coloração. Barras de escala: 20 μm. O painel (A) foi modificado de Silva et al.30; O painel (B) foi modificado a partir de Silva et al.29. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Tratamento com sialidase de mo-DCs induzindo maior expressão de marcadores de maturação. (A) as mo-DCs tratadas com sialidase apresentaram maior fenótipo de maturação do que as mo-DCs totalmente sialiladas. A citometria de fluxo foi utilizada para avaliar a expressão de vários marcadores de maturação. As mo-DCs foram tratadas com sialidase por 1 h a 37 °C; os valores do gráfico representam a intensidade média da fluorescência (MFI) (média ± EPM) de pelo menos três ensaios independentes. Diferenças estatisticamente significativas foram calculadas usando um teste t (*P < 0,05, **P < 0,01), referentes à diferença entre as condições não tratadas e tratadas com sialidase. (B) Mo-DCs humanas dessialiadas carregadas com antígenos tumorais inteiros induziram respostas específicas de células T. As mo-DCs foram tratadas com sialidase por 1 h a 37 °C ou não tratadas, seguidas de carga com lisados MCF-7 (LT) como fonte de antígenos de células tumorais inteiras. O co-cultivo entre mo-DCs e linfócitos T autólogos foi realizado por 4-8 dias na presença de IL-2 (10 U/mL). Células T submetidas a priming com mo-DCs dessialilados apresentaram secreção significativamente maior da citocina Th1, IFN-γ. Após estimulação de células T com mo-DCs, as citocinas secretadas nos sobrenadantes da co-cultura foram medidas por ELISA (n = 7). Os valores do gráfico representam a concentração (pg/mL) (média ± EPM). Diferenças estatisticamente significativas foram calculadas usando um teste t (*P < 0,05). A figura foi modificada de Silva et al.30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Ausência de impacto do tratamento com sialidase na viabilidade de mo-DCs humanas. As mo-DCs não tratadas (painel esquerdo) e as mo-DCs tratadas com sialidase (painel direito) foram submetidas à dupla coloração com anexina V e 7-AAD, e a coloração foi analisada por citometria de fluxo. Os dados não mostraram diferença significativa na viabilidade celular entre as células não tratadas e as tratadas com sialidase, sugerindo que as mo-DCs podem tolerar o tratamento com sialidase e permanecer viáveis para exercer sua função imunológica. A figura foi modificada de Silva et al.30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

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Isolamento de monócitos
Este manuscrito descreve um protocolo para gerar mo-DCs a partir de monócitos CD14+ isolados por humanos (Figura 1A), seguido da realização de um tratamento com sialidase para reduzir o conteúdo de ácido siálico na superfície dessas células.

Existem diferentes maneiras de se obter DCs humanas, como diretamente do sangue ou tecidos periféricos ou através da diferenciação de precursores como células-tronco ou monócitos. A obtenção de CDs diferenciadas de monócitos isolados de sangue periférico é muito mais simples devido à facilidade de obtenção de grandes quantidades de monócitos em comparação com outras fontes de CD41. Ainda, para se obter uma alta porcentagem de monócitos isolados, todos os passos do protocolo devem ser cuidadosamente seguidos. Por exemplo, o meio de gradiente de densidade pode ser tóxico para as células e, para evitar a morte celular, deve-se evitar o contato celular prolongado com o meio de gradiente de densidade e lavar bem as células. A manipulação celular deve ser feita o mais rápido possível para evitar a perda de viabilidade celular. A partir de CMSP, monócitos podem ser isolados através de seleção positiva usando o método de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS), que é uma tecnologia adequada para produzir um alto número de monócitos. Além disso, em comparação com outros métodos de seleção de monócitos, as mo-DCs derivadas de monócitos isolados de MACS possuem maior capacidade de estimular a atividade de células T antitumorais42. Nesse protocolo, uma vez isolados, os monócitos foram incubados com IL-4 e GM-CSF por um período de 5-6 dias para se obter a diferenciação em mo-DCs imaturas (Figura 1). Os resultados mostraram que morfologicamente (Figura 1A) e fenotipicamente (Figura 1B), os monócitos isolados se diferenciaram em mo-DCs imaturas. Além disso, ao longo da diferenciação, as mo-DCs perderam a expressão dos marcadores CD14 e ganharam a expressão de CD1a e MHC-II (Figura 1B), que são necessários para a apresentação do antígeno às células T.

Esse isolamento e diferenciação de monócitos em mo-DCs são limitações deste protocolo. O processo de isolamento é uma etapa sensível que deve ser executada com cuidado e rapidez para evitar a morte celular, e essa etapa também deve ser feita toda vez que forem necessárias mo-DCs para um novo experimento. O processo de diferenciação leva de 5 a 6 dias, o que representa uma dificuldade em termos de empregar este método para análises de alto rendimento. No entanto, o método de isolamento e o uso de citocinas para diferenciar mo-DCs são úteis para gerar um grande número de mo-DCs funcionais in vitro para fins de experimentação. As mo-DCs geradas nesse protocolo são capazes de ser submetidas a tratamento com sialidase, citometria de fluxo, ELISA, microscopia confocal, entre outros, enfatizando a importância e utilidade desse método30.

Mo-DCs imaturas e tratamento com sialidase
As sialidases são essenciais na regulação da sialilação e são responsáveis pela remoção dos ácidos siálicos dos glicanos da superfície celular. Nas mo-DCs, a remoção do ácido siálico pela sialidase leva à maturação dessas células, o que aumenta a apresentação cruzada antígeno e a subsequente ativação das células T e a atividade antitumoral30.

Mo-DCs humanas imaturas exibem um alto conteúdo de ácidos siálicos ligados à superfície celular α(2,6) e α(2,3)27 em comparação com mo-DCs maduras31,43. Além disso, a remoção dos ácidos siálicos pelo tratamento das mo-DCs com sialidase melhora a maturação dasCDs 28,30,31. A sialidase selecionada para este experimento foi da bactéria Clostridium perfringens. Ainda, outros organismos também produzem sialidases, como as bactérias Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae ou Salmonella typhimurium44, a sanguessuga Macrobdella decora45 e até mesmo o Homo sapiens46, e as sialidases desses organismos também são usadas experimentalmente. No entanto, cada sialidase tem diferentes especificidades de substrato. Além disso, o uso da enzima sialidase pode ter suas limitações; por exemplo, a manipulação de mo-DCs durante o tratamento pode estimular ainda mais essas células. Além disso, a quantidade de sialidase e os tempos de incubação devem ser otimizados com base no tipo de células a serem utilizadas e sua composição em ácido siálico. A remoção do ácido siálico não é um efeito permanente, mas sim um fenômeno transitório, porque a célula irá restaurar seu conteúdo de ácido siálico na superfície celular. Além da sialidase, existem outros métodos para reduzir as moléculas de ácido siálico na superfície das células, como o uso de inibidores da sialiltransferase, knockouts gênicos dos genes da sialiltransferase ou bloqueio metabólico do ácido siálico utilizando miméticos do ácido siálico47,48,49. No entanto, esses métodos podem apresentar efeitos distintos sobre as células e, além da dessialização, a viabilidade celular deve ser considerada. O tratamento enzimático com sialidase é um método prático para remover de forma eficaz e transitória os ácidos siálicos da superfície celular, mantendo a viabilidade celular.

Neste trabalho, sialidase foi adicionada às mo-DCs imaturas na concentração de 500 mU/5 x 106 células/mL, e as células foram incubadas a 37 °C por 60 min. O tratamento foi realizado com RPMI-1640 sem soro para preservar a viabilidade celular e evitar qualquer interação entre as moléculas sialiladas presentes no soro30. O tratamento com sialidase pode ser realizado com outros tampões além do RPMI, como acetato de sódio 50 mM, pH 5,1 (no caso da C. perfingens sialidase) ou PBS50,51,52. No entanto, o RPMI-1640 é o meio de cultura mais comum para DCs, pois mantém condições experimentais constantes durante o procedimento, evita a indução da maturação e reduz qualquer estresse que possa ser causado por tampões de sialidase ou PBS53,54,55,56. Após a incubação com sialidase, é fundamental lavar bem as células com um meio suplementado com soro para garantir que a reação enzimática tenha parado. A presença de moléculas sialiladas no soro competirá como substrato para a sialidase, garantindo assim uma rápida parada da reação.

Caracterização de marcadores de superfície por citometria de fluxo e microscopia confocal
Para a determinação do perfil ácido siálico, no protocolo seção 3, utilizou-se a coloração de lectina seguida de citometria de fluxo e microscopia confocal de varredura a laser. Para o procedimento de coloração celular, em ambos os casos, as concentrações de lectina e as condições de incubação foram otimizadas para evitar aglutinação e morte celular. É fundamental realizar a incubação a 4 °C em tampões contendo pelo menos 2% de FBS ou BSA para evitar a ligação inespecífica das lectinas. Neste protocolo, RPMI-1640 contendo FBS a 10% foi utilizado para manter as condições experimentais constantes e evitar o estresse celular. Em relação à microscopia confocal, a fixação das células antes da coloração é essencial para preservar a morfologia, prevenir a autólise e manter a antigenicidade.

A análise do fenótipo de mo-DC por citometria de fluxo mostrou que as mo-DCs tratadas com sialidase apresentaram uma quantidade significativamente maior de lectina PNA ligada à superfície celular em comparação com lectinas MMA e SNA, que diminuíram após o tratamento com sialidase (Figura 2A). Como esperado, a coloração de PNA aumentou, uma vez que o PNA reconhece antígenos não sialilados, em contraste com MAA e SNA, que se ligam diretamente aos ácidos α2,3- e α2,6-siálico, respectivamente30. Esta coloração confirma a remoção efetiva dos ácidos siálicos da superfície celular utilizando este protocolo. Outro método que pode ser utilizado para validar o tratamento e analisar o conteúdo de ácido siálico na superfície celular é a coloração de lectina seguida de microscopia confocal, como exemplificado na Figura 2B.

Além dos exemplos anteriores, existem abordagens alternativas para avaliar e caracterizar o conteúdo de ácido siálico, como a sondagem de lectinas por western blotting. Lectinas alternativas específicas do ácido siálico também estão disponíveis, como as Siglecs, um grupo de lectinas que têm uma preferência distinta por tipos e ligações de ácido siálico57. Além do uso de lectinas em ambas as técnicas (citometria de fluxo, microscopia ou western blot), também é possível caracterizar o conteúdo de ácido siálico usando anticorpos; Por exemplo, os ácidos α2,8-siálicos podem ser avaliados por anticorpos como o clone 735, específico para o ácido polisiálico58. Além disso, após o tratamento com sialidase, as células podem ser funcionalmente testadas quanto à sua eficácia biológica ou terapêutica, avaliando seu fenótipo e capacidade de ativar células T40. De fato, como mostrado nos exemplos fornecidos, as mo-DCs tratadas com sialidase apresentaram maior fenótipo de maturação, bem como uma expressão elevada de moléculas apresentadoras de antígenos e co-estimulatórias.

Além disso, as mo-DCs tratadas com sialidase podem ser carregadas com antígenos e co-cultivadas com células T ou outras células e, em seguida, podem ser estudadas em relação ao fenótipo, perfil de secreção de citocinas ou outras características. No exemplo fornecido, os dados mostram que as mo-DCs tratadas com sialidase podem ser carregadas com antígenos tumorais e, em seguida, usadas para ativar células T. De fato, as células T resultantes mostraram aumento da secreção de IFN-γ, o que está de acordo com relatos anteriores sobre o efeito da escassez de ácido siálico no aumento da capacidade das mo-DCs de ativar células T 27,28,29,30,31.

Em conclusão, este protocolo mostra um método viável, viável e prático para gerar mo-DCs para manipulação do conteúdo de ácido siálico pelo tratamento com sialidase. Este protocolo apresenta uma metodologia que pode servir a diferentes propósitos e aplicações. Este método não só pode ter um papel crucial na compreensão do papel dos ácidos siálicos na maturação e resposta das células imunes, mas também pode ser usado como uma ferramenta imunomoduladora.

Disclosures

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

Acknowledgements

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Os autores agradecem o financiamento da Comissão Europeia GLYCOTwinning GA 101079417 e EJPRD/0001/2020 EU 825575; a Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) Portugal, no âmbito das bolsas FCT 2022.04607.PTDC, UIDP/04378/2020, UIDB/04378/2020 (UCIBIO) e LA/P/0140/2020 (i4HB). FCT-NOVA. e Stemmatters também foram financiados pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), por meio do Programa Operacional Regional do Norte (Norte 2020) para o SI I& Projeto DT DCMatters (NORTE-01-0247-FEDER-047212). Agradecemos às instalações da Biolabs na FCT-NOVA e na GLYCOVID NOVA Saúde.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubo cônico de 15 mLAstiK' sCTGP-E15-050Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos; Tratamento de Células com Placa de 24
PoçosGreiner Bio-one662 160Obtenção de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos; Tratamento de células com sialidase
50 mL tubo cônicoAstiK' sCTGP-E50-050Obtenção de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos
7-Aminoactinomicina D (7-AAD)BioLegend420404Obtenção de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos
Anexina VImmunotools31490013Obtenção de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos
Attune Acoustic Focusing Flow CytometerThermo Fisher Scientific Determinação do perfil de ácido siálico; Perfil de maturação de mo-DCs
BSASigma - AldrichA3294-100GObtenção de células dendríticas derivadas de monócitos; Determinação do perfil de ácido siálico
CD14 (T & Uuml monoclonal; K4)Miltenyi Biotec130-080-701Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos
CD80Immunotools21270803Maturação Perfil de mo-DCs
CD86Immunotools21480863Maturação Perfil de mo-DCs Lâminas de contagem de
células e azul de tripanoEVE EVS-050Obtenção de centrífuga de células dendríticas derivadas de monócitos
Eppendorf5430 RObtenção de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos; Tratamento de Células com Sialidase; Determinação do perfil de ácido siálico; Maturação Perfil de mo-DCs
Meio de gradiente de densidade (Histopaque)Sigma - Aldrich10771-100MLObtenção de células dendríticas derivadas de monócitos
EDTAGibco, ThermoFisher15400054Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos
Kit Elisa (IFN-&gama;)Imunoferramentas31673539Maturação Perfil de mo-DCs
EVE contagem automatizada de célulasNanoEntek10027-452Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos
Soro fetal bovino (FBS)Gibco10500064Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos; Tratamento de Células com Sialidase; Determinação do Perfil de Ácido Siálico
Fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF)Miltenyi Biotec  130-093-864Obtenção de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos
Microesferas CD14 Humanas (Esferas Imunomagnéticas)Miltenyi Biotec130-050-201Obtenção de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos
Interleucina (IL)-1βSigma - AldrichI9401Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos
Interleucina (IL)-4Miltenyi Biotec130-093-919Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos
Interleucina (IL)-6Sigma - AldrichSRP3096Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos
L-glutaminaGibcoA2916801Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos
Coluna LS e êmboloMiltenyi Biotec130-042-401Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos
Maackia amurensis ( MAA) lectina (MAA lectina - Biotinilada)Laboratórios de vetoresB-1265-1Determinação do Perfil de Ácido Siálico
MHC-I (HLA-ABC) Imunoferramentas21159033Maturação Perfil de mo-DCs
MHC-II (HLA-DR) ImmunostepHLADRA-100TPerfil de Maturação de mo-DCs
MicrotubosAstiK ' sPCRP-E015-500Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos; Tratamento de Células com Sialidase; Determinação do perfil de ácido siálico; Perfil de maturação de mo-DCs
Neuraminidase (Sialidase)Roche11585886001Tratamento de Células com Sialidase
Aminoácidos não essenciais (NEAA)Gibco11140-050Obtenção de Células Dendríticas Derivadas
de Monócitos Paraformaldeído (PFA 2%)Polysciences Europe25085-1Determinação do Perfil de Ácido Siálico; Perfil de maturação de mo-DCs
Paraformaldeído (PFA 4%)Biotium22023Determinação do Perfil de Ácido Siálico
Pipetas de PasteurLabboxPIPP-003-500Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos
Amendoim (Arachis hypogaea) Aglutinina ( PNA) lectina (lectina PNA - FITC)Laboratórios vetoriaisFL-1071Determinação do perfil de ácido siálico
Penicilina/estreptomicinaGibco15140163Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)NZYTech  MB18201Obtenção de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos; Tratamento de Células com Sialidase; Determinação do perfil de ácido siálico; Perfil de maturação de mo-DCs
Prostaglandina E2 (PGE2)Sigma - AldrichP0409Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos
Tampão de lise RBCBioLegend420302Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos
Meio RPMI-1640 ( contendo 11,1 mM de glicose)Gibco31870074Obtenção de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos; Tratamento de Células com Sialidase; Determinação do Perfil de Ácido Siálico
Sambucus nigra lectina (lectina SNA - Biotinilada)Laboratórios devetores  B-1305-2Determinação do Perfil de Ácido Siálico
Sambucus nigra lectina (lectina SNA - FITC)Laboratórios de vetoresFL-1301-2Determinação do Perfil de Ácido Siálico
Piruvato de SódioThermofisher11360-070Obtenção de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos
Dispositivos Moleculares SpectroMax190MaturaçãoPerfil de mo-DCs
Estreptavidin-PEBioLegend  405203Determinação do Perfil de Ácido Siálico; Perfil de maturação de mo-DCs
Tetrametilbenzidina (TMB)Sigma - AldrichT0440Perfil de maturação de mo-DCs
Fator de necrose tumoral-&alfa; (TNF-&alfa;)Sigma - AldrichH8916Obtenção de células dendríticas derivadas de monócitos
Microscópio confocal Zeiss LSM710Determinação do perfil de ácido siálicoZeiss
de Sialidase

References

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