Um protocolo é apresentado para o enriquecimento de proteínas da célula hospedeira (HCPs) a partir de produtos farmacêuticos (PD) e detecção de peptídeos usando esferas de enriquecimento de proteoma. O método é demonstrado usando uma substância medicamentosa (MD) de anticorpos monoclonais (mAb) fabricada internamente, que é um material de referência bem caracterizado para avaliar e comparar diferentes métodos em termos de desempenho.
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Artigo de método
Análise de Proteína de Células Hospedeiras usando Contas de Enriquecimento Acopladas a Digestão Limitada
Neste artigo
Resumo
Resumo
As proteínas da célula hospedeira (HCPs) são impurezas que podem afetar adversamente as proteínas terapêuticas, mesmo em pequenas quantidades. Para avaliar os riscos potenciais associados aos medicamentos, métodos têm sido desenvolvidos para identificar PCH de baixa abundância. Uma abordagem crucial para o desenvolvimento de um método sensível de detecção de HCP envolve o enriquecimento de HCPs e, simultaneamente, a remoção de anticorpos monoclonais (mAbs) antes da análise, utilizando cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS).
Este protocolo oferece instruções detalhadas para o enriquecimento de proteínas da célula hospedeira usando esferas de enriquecimento de proteoma comercialmente disponíveis. Essas esferas contêm uma biblioteca diversificada de ligantes hexapeptídicos com afinidades específicas para diferentes proteínas. O protocolo também incorpora digestão limitada e subsequente detecção de peptídeos usando nano LC-MS/MS. Ao empregar essas técnicas, HCPs com baixa abundância podem ser enriquecidos mais de 7000 vezes, resultando em um limite de detecção impressionante tão baixo quanto 0,002 ppm. Significativamente, este protocolo permite a detecção de 850 HCPs com um alto nível de confiança usando um mAb do NIST. Além disso, ele foi projetado para ser fácil de usar e inclui uma demonstração em vídeo para ajudar na sua implementação. Ao seguir essas etapas, os pesquisadores podem efetivamente enriquecer e detectar PCHs, aumentando a sensibilidade e a precisão da avaliação de risco para produtos farmacêuticos.
Introdução
As proteínas da célula hospedeira (PCH) são impurezas liberadas da cultura celular do organismo hospedeiro e copurificadas com anticorpo monoclonal (mAb)1,2,3,4. Níveis traço de PID podem afetar negativamente a qualidade do medicamento 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 e, portanto
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Protocolo
As abreviaturas utilizadas no protocolo estão listadas na Tabela Suplementar 1.
1. Preparação de soluções e tampões
NOTA: Os detalhes comerciais de todos os reagentes estão listados na Tabela de Materiais.
- Preparar 0,1 M Tris-HCl, solução de pH 8,0 adicionando 1 mL de 1 M Tris-HCl, pH 8,0 em 9 mL de água deionizada em um frasco para injetáveis de vidro e misturar bem por vórtice. Conservar a 4 °C até 3 meses.
- Preparar 24 mM de desoxicolato de sódio (SDC) dissolvendo 10 mg de SDC em 1 mL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
- Preparar 24 mM de la....
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Resultados
Este protocolo apresentou um fluxo de trabalho de preparação de amostras, denominado enriquecimento proteico acoplado à digestão limitada (PMLD), para a análise de proteínas da célula hospedeira (HCPs) em uma amostra de anticorpo monoclonal (mAb). A Figura 1 ilustra o passo a passo do PMLD. Os pesquisadores compararam os resultados da análise de HCP usando digestão direta (mostrada no painel superior da Figura 2) e PMLD (mostrada no painel inferior da Figura 2)........
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Discussão
Existem duas versões de esferas de enriquecimento de proteínas disponíveis comercialmente: uma com menor capacidade e outra com maior capacidade (ver Tabela de Materiais). Ambas as versões das contas de enriquecimento contêm dez preparações no pacote. As instruções do fabricante sugerem que cada preparação do kit de pequena capacidade pode ser usada para enriquecer 10 mg de proteína total. No entanto, para um ótimo desempenho do enriquecimento da proteína da célula hospedeira (HCP) a partir da SD, cada p.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 16 G, Agulha de Cubo de Metal, 2 pol, estilo de ponta 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 coluna de armadilha (20 cm & vezes; 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrila | Fisher-Scientific | A955 | |
| com 0.1% de Ácido Fórmico (v/v), Grau Optima LC/MS | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| coluna analítica C18 (0.075 mm &vezes; 1.7 μ m &vezes; 30 cm, 100 &) | HEB07503001718I | CoAnn Technologies | |
| 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit para cartuchos SPE, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| concentração interna de mAb | Regeneron | 200 mg/mL | |
| Iodoacetamida (30 x 9,3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidina | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidina monocloridrato monohidratado | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Metanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0,5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2,0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Kit de Enriquecimento de Proteínas de Grande Capacidade | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Kit de Enriquecimento de Proteínas de Pequena Capacidade | Bio-Rad | 1633006 | |
| Desoxicolato de Sódio (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Lauroil sarcosinato de sódio (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Ácido trifluoracético (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Tripsina (Grau de Sequenciamento Modificado) (5 x 20 ug) | Revólver de Tubo Promega | V5111 | |
| Rotador | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Água com 0.1% de Ácido Fórmico (v/v), Grau Optima LC/MS | Fisher-Scientific | LS118-4 |
Referências
- Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
- Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C.
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Reimpressões e permissões
