Artigo de método

Hibridização in situ por fluorescência de RNA para localização de RNA longo e não codificante em células de osteossarcoma humano

DOI:

10.3791/65545

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16 de junho de 2023

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O presente protocolo descreve um método de hibridização in situ por fluorescência de RNA para localizar os lncRNAs em células humanas de osteossarcoma.

Resumo

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Os papéis importantes dos RNAs longos não-codificadores (lncRNAs) no câncer têm sido estudados, tais como a regulação da proliferação, transição epitélio-mesenquimal (EMT), migração, infiltração e autofagia de células cancerosas. A detecção de localização de lncRNAs em células pode fornecer informações sobre suas funções. Ao projetar a sequência de cadeia antisense específica para lncRNA seguida de marcação com corantes fluorescentes, a hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) pode ser aplicada para detectar a localização celular de lncRNAs. Juntamente com o desenvolvimento da microscopia, as técnicas de RNA FISH agora permitem até mesmo a visualização dos lncRNAs mal expressos. Este método pode não só detectar a localização de lncRNAs sozinho, mas também detectar a colocalização de outros RNAs, DNA, ou proteínas usando imunofluorescência de cor dupla ou multicolorida. Aqui, incluímos o procedimento detalhado de operação experimental e precauções de RNA FISH usando lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) em células humanas de osteossarcoma (143B) como um exemplo, para fornecer uma referência para pesquisadores que desejam realizar experimentos de RNA FISH, especialmente lncRNA FISH.

Introdução

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Nossa compreensão do genoma humano tem sido grandemente expandida pelos recentes avanços na tecnologia do genoma completo. Cerca de 93% do genoma humano pode ser transcrito em RNAs, mas apenas 2% dos RNAs podem ser traduzidos em proteínas; os 98% restantes dos RNAs que não têm função de tradução de proteínas são chamados de RNA não codificantes (ncRNA)1. Como uma classe de RNAs não codificantes (ncRNAs), os ncRNAs longos (lncRNAs), contendo mais de 200 nucleotídeos2, têm atraído atenção crescente devido ao seu envolvimento em muitos processos fisiológicos e patológicos das células, como diferenciação, controle do ciclo, apoptose, migração e invasão 3,4,5 . Os LncRNAs desempenham seu papel através de vários mecanismos, tais como regulação da estrutura da cromatina e expressão gênica nuclear, controle do processo de splicing de RNAm e modificação pós-transcricional6. Os LncRNAs regulam a ocorrência, o desenvolvimento e a metástase de malignidades em ambos os níveis transcricional e pós-transcricional. A regulação transcricional é realizada no núcleo por afetar a transcrição do RNA via ligação às estruturas cromossômicas, enquanto a regulação pós-transcricional é realizada no citoplasma pelo controle dos genes-alvo via mecanismo endógeno competitivo de RNA (ceRNA)5,7,8. O CeRNA revelou um novo mecanismo de interação de RNA, a saber, que os lncRNAs podem atuar como uma esponja para adsorver miRNAs e inibir a degradação mediada por miRNA de genes-alvorelacionados9. Portanto, as informações sobre a localização subcelular dos lncRNAs, se um lncRNA específico está localizado no citoplasma ou no núcleo, são importantes para ajudar a identificar suas funções biológicas.

Atualmente, a localização do lncRNA é detectada principalmente por dois métodos, um é por ensaio de isolamento da fração núcleo/citoplasma e o outro é por RNA FISH. No primeiro, os RNAs nas frações citoplasmática e nuclear são extraídos respectivamente e, em seguida, a amplificação por PCR é realizada com primers específicos de lncRNA para detectar a proporção de lncRNAs no citoplasma e núcleo. A vantagem deste método é a eficiência do tempo, enquanto a desvantagem é que a localização real do lncRNA não é diretamente refletida pela proporção relativa de lncRNAs no citoplasma e núcleo. RNA FISH pode detectar a localização de lncRNA em células através do planejamento de sequências de cadeia antisense específicas para lncRNA seguidas de marcação com corantes fluorescentes10. Os métodos de RNA FISH foram aprimorados com os avanços nas técnicas de sonda e métodos de detecção, incluindo conjuntos de múltiplas sondas oligo marcadas com fluoróforos11, sondas LNA 12 e sondas de DNA ramificado (bDNA)13. RNA FISH pode não apenas detectar a localização de lncRNA, mas também detectar a colocalização de outros RNAs, DNA ou proteínas usando imunofluorescência de dupla cor ou multicolorida14.

Neste trabalho, incluímos como exemplo o protocolo detalhado de detecção de localização intracelular do gene 6 do RNA nucleolar pequeno RNA do lncRNA (SNHG6) em células de osteossarcoma (143B) por RNA FISH. SNHG6 é um lncRNA de nucleotídeo 600-730 em sua forma spliced madura e identificado como um novo oncogene em diversos cânceres humanos, incluindo câncer colorretal, câncer gástrico, carcinoma de células claras do ovário, osteossarcoma e carcinoma hepatocelular15,16,17,18. Estudos têm confirmado o envolvimento do SNHG6 em comportamentos biológicos de células cancerosas, como proliferação, EMT e autofagia, e demonstrado a localização citoplasmática do SNHG6 onde ele pode afetar os genes alvo por ligação (esponja) aos miRNAs15,16,17. Este protocolo detalhado de detecção da localização intracelular do SNHG6 por RNA FISH é apresentado neste artigo.

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Protocolo

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Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes de todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo. A Figura 1 mostra o protocolo geral para RNA FISH; A Tabela 1 contém a composição de todas as soluções e a Tabela 2 contém as sequências de primers utilizadas neste protocolo.

1. Preparação da sonda

  1. Identificar e adquirir a sequência FASTA de um lncRNA alvo de interesse, por exemplo, do GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Seguindo as indicações no site, projete as sondas ISH online19 e revise as sugestões do algoritmo de design para listar as sondas a serem encomendadas com o rótulo Cy3.
  2. Incubar o tampão de hibridização a 37 °C durante 2 h de antecedência.
  3. Dissolver 4 sondas de densidade óptica (OD) em 160 μL de ddH2O tratado com dietilpirocarbonato (DEPC) na concentração de 1 mg/mL longe da luz.
    NOTA: A densidade óptica (DO) representa a unidade de medida do DNA e do RNA. Geralmente, 1 unidade OD = 33 μg/mL de DNA.
  4. Preparar 200 μL da mistura de sonda para cada poço (1,2 μL-10 μL de sonda, 70 μL de tampão de hibridização, completar o volume com ddH2O a 200 μL tratados com DEPC) e montar uma série de 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12,5 μg/mL e 6 μg/mL.
    NOTA: A concentração da sonda precisa ser explorada experimentalmente com antecedência. Uma alta concentração de sonda levará à ligação não específica de lncRNAs, enquanto uma baixa concentração de sonda levará à detecção insensível ou falha de lncRNAs.
  5. Desnaturar a mistura da sonda a 73 °C durante 5 min.
    NOTA: Se a sonda de DNA marcada com Cy3 for de fita dupla, desnature a sonda para DNA de fita simples a 95 °C por 5 minutos e, em seguida, resfrie rapidamente por 2 minutos no gelo.

2. Preparação celular

  1. Semear 50.000 células 143B por poço em lamínulas de vidro estéril em uma placa de cultura celular de 12 poços e incubá-las por 24 h (37 °C, 5% CO2) em DMEM.
    NOTA: O número específico de células semeadas aqui varia com o tamanho da célula, o que é apropriado para que as células semeadas atinjam uma confluência de 50% após serem incubadas por 24 h. As tampas de vidro estéreis são redondas para serem adequadas para a placa de 12 poços.
  2. Retire o meio e lave por 2 x 5 min com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    NOTA: Preparar 1x PBS com ddH2O. O PBS sem tratamento com DEPC não pode ser usado porque contém RNase. Execute todas as etapas a seguir em condições livres de RNase.
  3. Remover 1x PBS e adicionar 200 μL de etanol 100% em cada poço para fixar por 15 min à temperatura ambiente.
  4. Retire o etanol, adicione 200 μL de Triton X-100 a 0,1% (em 1x PBS) em cada poço e incube por 15 min à temperatura ambiente.
    NOTA: O tempo precisa ser rigorosamente controlado com permeabilização Triton X-100 e não pode ser muito longo.
  5. Retire Triton X-100 a 0,1% e lave 2 x 5 min com 1x PBS.
    NOTA: Se o protocolo tiver que ser pausado aqui, substitua o PBS por etanol 70% (diluição de etanol 100% com ddH2O livre de RNase) e armazene a amostra a 4 °C por até 3 meses.
  6. Remover 1x PBS, adicionar 200 μL de 2x tampão citrato salino de sódio (SSC) (diluição de 20x SSC com ddH2O livre de RNase) em cada poço e incubar por 30 min a 37 °C.
  7. Remover 2x tampão SSC, adicionar 200 μL de etanol 70% em cada poço e incubar por 3 min à temperatura ambiente.
  8. Descarte o etanol 70%, adicione 200 μL de etanol 85% (diluição de etanol 100% com ddH2O livre de RNase) em cada poço e incube por 3 min à temperatura ambiente.
  9. Descarte o etanol 85%, adicione 200 μL de etanol 100% em cada poço e incube por 3 min à temperatura ambiente.
  10. Absorver e descartar etanol 100%; deixe os poços secarem.

3. Hibridação in situ fluorescente (FISH)

  1. Adicionar 200 μL de mistura de sonda (desnaturada como no passo 1.5) a cada poço e incubar a 37 °C durante a noite (16-18 h).
    NOTA: Existe uma forte correlação positiva entre a temperatura de hibridização e a concentração de sonda; Portanto, para otimizar o fundo, tanto a temperatura de hibridização quanto a concentração de sonda devem ser reduzidas.
  2. No dia seguinte, retire amostras a 37 °C e elimine a mistura de sonda. Adicionar 200 μL de tampão 0,4x SSC/0,3% Tween-20 a cada poço (pré-aquecido a 65 °C) e lavar por 2 min à temperatura ambiente.
  3. Remova o tampão 0,4x SSC/0,3% Tween-20, adicione 200 μL de 2x SSC/0,1% Tween-20 buffer a cada poço e lave por 2 min à temperatura ambiente.
  4. Remover 2x tampão SSC/Tween-20 a 0,1%, adicionar 200 μL de solução corante com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 μg/mL) e corar por 20 min longe da luz.
  5. Eliminar a solução corante DAPI e lavar com 1x PBS durante 2 minutos à temperatura ambiente.
  6. Adicione 50 μL de meio de montagem contendo goma na lâmina e coloque a tampa de vidro na corrediça para fixar.
    NOTA: Certifique-se de colocar a tampa no slide com o lado da célula para baixo.
  7. Observe sob um microscópio de fluorescência.
    NOTA: Use um microscópio de fluorescência ou um microscópio confocal a laser; este último produz uma imagem de maior sensibilidade e clareza.

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Resultados

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Imagens representativas de FISH SNHG6 em células humanas de osteossarcoma são mostradas (Figura 2). O controle negativo é tratado com a sonda Ctrl negativa; o controle positivo é tratado com sonda U6 20. A sonda SNHG6 e a sonda U6 são marcadas com Cy3, que emite fluorescência vermelha. DAPI é um corante que cora o DNA, que emite fluorescência azul. Esse resultado mostra que o SNHG6 está localizado principalmente no citoplasma, e essa informação pode fornecer uma direç...

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Discussão

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Este protocolo de RNA FISH pode não apenas detectar a localização de lncRNAs em células, mas também detectar a colocalização de outros RNAs, DNA ou proteínas nas células, que também podem ser usados para detectar a localização de lncRNAs em tecidos embebidos em parafina. Entretanto, o protocolo específico nesses casos é diferente, pois os tecidos emblocados em parafina necessitam ser desparafinados21. Este procedimento experimental pode ser aplicado em placas de 48 ou 96 poços, mas placas de 384 p...

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Divulgações

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Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho é apoiado por subsídios de (1) o Programa Nacional de P&D da China (2020YFE0201600); (2) a National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408); (3) Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation; (4) Projetos de Pesquisa dentro do Orçamento da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai (2021LK047).

    

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Contador automático de célulasShanghai Simo Biological Technology Co., LtdIC1000Contagem de células
Placa de cultura de células-12Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd3513,corningColoque as lamínulas na placa
  Linha celular (143B)Banco de células da Academia Chinesa de CiênciasCRL-8303linha celular de osteossarcoma câncer
Tubo de centrífuga (15 mL, 50 mL)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, CorningCentrifuge as lamínulas
Xangai YueNian Biotechnology Co., Ltdabs7026As células são semeadas nas lamínulas
Cy3 label-SNHG6 DNA sondaShanghai GenePharma Co., LtdA10005Detectar SNHG6
localização DMEM mídiaShanghai YueNian Biotechnology Co., LtdLM-E1141Incubadora
de banho seco de meio de cultura de célulasHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.DKT200-2 Incubação em diferentes altas temperaturas
Etanol 100% Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218de desidratação
Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTDOlympus BX43 equipado com uma câmera de Olympus U-TV0.5XC-3 (SN: 5J01719), olympusObservação e posicionamento
IncubadoraShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDDHP-9051As amostras foram incubadas a 37 °C.
Meio de montagemSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E675004Prenda as lamínulas na corrediça
ShakerHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.TS-8SAmostra de lavagem
SlideShanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd188105As lamínulas são colocadas na corrediça
Triton X-100Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600198Membrana permeável e membrana nuclear
  Tripsina (0,25%)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd25200056, Gibcotratamento de tripsina de células
Tween-20Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600560detergente
microscópio de fluorescência

Referências

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